亞洲秋海棠分子親緣關係與特徵演化 - 亞洲產秋海棠屬植物分子親緣關係研究以及對其系統分類學與生物地理學的影響

前言

秋海棠屬(Begonia)植物全球將近有 1,600 種 (Golding and Wasshausen, 2002;

Gu et al., 2007; Hughes and Pullan, 2007)，分布於亞洲(約 750 種)、美洲(約 675 種) 及非洲(約 150 種)的熱帶與亞熱帶地區，根據(Frodin, 2004)的統計，其物種多樣 性在開花植物中僅次於紫雲英屬(Astragalus, 約 3,280 種)、豆蘭屬(Bulbophyllum, 約 2,030 種)、九節木屬(Psychotria, 約 1951 種)、大戟屬(Euphorbia, 約 1840 種) 及薹屬(Carex, 約 1,800 種)，為第六大屬。如此龐大分類群的分類學研究誠屬不 易，必須先建立具有明確共同演徵(synapomorphy)並符合親緣關係的屬下分類群，

如亞屬(subgenus)或組(section)等，方便再進一步針對各屬下分類群進行更全面的研究。回顧傳統分類著重的特徵(e.g. Doorenbos et al., 1998; Shui et al., 2002)是否為共同衍徵(synapomorphy)均有待商榷，根據這些特徵建立的屬下分類群是否符合這些秋海棠物種的演化歷史？

Forrest and Hollingsworth (2003)的研究指出，雖然非洲秋海棠的種數較少，

分子親緣關係支持秋海棠屬起源於非洲的假說，並顯示美洲與亞洲的種類各自成為單系群，Forrest et al. (2005), Tebbitt et al. (2006)的研究也指出許多傳統定義的組，都不是單系群，且傳統分類著重的特徵(e.g. Doorenbos et al., 1998; Shui et al., 2002)如植物為常綠或落葉性、具球莖、根狀莖或直立莖、花被片數、胎座類型、

子房室數目、胎座裂片數、果翅數目等是否為共同衍徵(synapomorphy)均有待進 一步研究。例如亞洲產的圓果組(sect. Sphenanthera)的果實呈不乾裂的漿果狀，

在秋海棠屬中相當特殊，一般認為漿果的性狀與動物傳播有關，殆為單一起源的演化事件，但親緣研究顯示圓果組成員並不形成單系群，漿果的性狀在演化過程中呈現的非同源相似性(homoplasy) (Tebbitt et al., 2006)。Thomas 等人(2011b)利

用三個葉綠體DNA標記，針對亞洲秋海棠屬植物親緣關係的研究顯示，亞洲秋海棠以少數分布於印度次大陸的物種為基群，其餘多數物種分成兩大主要支序群：

1. Clade I – 包含主要分布於南洋群島，染色體數2n=30為主的物種，主要成員為 等翅組(sect. Petermannia)、產自菲律賓的秋海棠組(sect. Diploclinium)及根莖型的 單座組物種(sect. Reichenheimia)；2. Clade II – 包含主要分布於亞洲大陸，染色 體數 2n=22 為主的物種，以具球莖的落葉性物種為基群，而常綠性的扁果組(sect.

Platycentrum)與圓果組(sect. Sphenanthera)則形成一單系群並深陷於(deeply nested )落葉性支序群中(Thomas et al., 2011b)。Rajbhandary et al. (2011) 在利用 nrITS DNA標記，針對亞洲秋海棠屬植物親緣關係的研究中，也得到類似結果，

唯前述二研究報導中，產自中國的物種相當缺乏，尤其中國產秋海棠中種類最豐 富的扁果組秋海棠(Section Platycentrum)、特產於中國—北越喀斯特石灰岩地區 的側膜組秋海棠(Section Coelocentrum)、以及有相當比例分布於中國並對於亞洲 秋海棠早期擴遷可能具有重要意義的落葉性物種。

因此本研究希望藉由補足中國與鄰近地區的秋海棠物種，再一次重建亞洲秋海棠親緣關係，藉此釐清亞洲秋海棠各支序群之間的演化關係、以及這些支序群與現今依據形態特徵定義的組的關係，並進一步利用祖先性狀重建分析，檢視傳統上普遍重視或者可能在演化上具有重要意義的性狀，重新檢討這些性狀在分類和演化上的重要性，並針對現行分類系統進行檢討各主要的組如側膜組、秋海棠組、扁果組、圓果組、等翅組、小花秋海棠組、單座組、菲律賓秋海棠組等之間的關係。

材料與方法

取樣

本研究使用之材料主要來自各地野外採集並以矽膠乾燥之葉片材料，以及中央研究院生物多樣性中心實驗溫室中栽培的秋海棠屬植物活體標本。共取樣 188

個分類群(附錄一)，其中亞洲分類群分別屬於下列 14 個不同的組(Section)：扁果 組(Platycentrum, 51 sp.), 秋海棠組(Diploclinium, 30 sp.), 等翅組(Petermannia, 19 sp.), 側膜組(Coelocentrum, 18 sp.), 單座組(Reichenheimia, 13 sp.), 圓果組

(Sphenanthera, 14 sp.), 尖籽秋海棠組(Baryandra, 10 sp.), 小花組(Parvibegonia, 10 sp.), 棒果組(Leprosae, 2 sp.)、苞花秋海棠 Bracteibegonia (1 sp.), 二被秋海棠組 Haagea (1 sp.),單翅組 Monopteron (1 sp.), 二室單座組 Ridleyella (1 sp.)，合被秋海 棠組 Symbegonia (1 sp.)以及五種未劃分組別的物種。分析中同時包含 3 個美洲物 種和 8 個非洲物種，並選取其中與亞洲秋海棠關係最遠的三個非洲物種充當外群。

本次取樣的亞洲分類群地理區域涵蓋印度次大陸、喜馬拉雅地區(不丹及尼泊爾)，

中國大陸(雲南、廣西、廣東、海南、四川、貴州及西藏等)，台灣，中南半島(緬甸、泰國及越南)，馬來半島及南洋群島(蘇門答臘、爪哇、婆羅洲、菲律賓群島、

蘇拉威西及新幾內亞等)。形態特徵除了區分組別時所使用之「重要」特徵外，

同時也考慮了是否具有球莖，此性狀與生育環境有密切關聯，具球莖者為落葉性，

通常生長在季節變化顯著或具明顯乾季的環境，不具球莖者則為被視為常綠性，

通常生長於終年潮濕，季節變化不明顯的環境。另外，是否生長於石灰岩地區也是取樣時考慮的因素之一。

DNA 萃取

參考前人研究方法(Doyle and Doyle, 1987; Kopperud and Einset, 1995)，以 CTAB 方法從液態氮下磨成粉末的植物組織分離出 genomic DNA。由於多數秋海棠植株呈酸性，常導致 DNA 萃取不易，Kopperud and Einset（1995）利用稀釋之緩衝液清洗磨碎的材料，使 pH 值上升後，再加入 CTAB 萃取 DNA，以提高實驗成功率及產量。

DNA 標記選取、擴增與定序

本研究選取了五個葉綠體 DNA 分子標記進行 PCR 及定序，分別為 rpL16

intron, trnC-ycf6 spacer, ycf6-psbM spacer, psbM-trnD spacer, trnL-F (trnL intron +

PCR 產物以 PCR -Advanced Clean Up Kit (Viogene, Taiwan) 純化後，送往中央研物暨微生物研究所核酸分析核心實驗室進行定序，DNA 定序儀機型為 ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。

DNA 序列整理排序及資料矩陣建立

同一 PCR 產物定序後所得之兩端 DNA 序列(通常 2-3 條)，先以 SeqMan^TM II (DNASTAR, USA) 比對合併，經合併後序列以 MEGA5 (Tamura et al., 2011)進行多重 DNA 序列排序（multiple DNA sequence alignment），先利用 MEGA5 內建之 MUSCLE (Edgar, 2004) 進行自動排序，完成後以目視予以修正及適當調整，

形成可供進一步分析之資料矩陣(data matrix)。矩陣中遇有多重複 A/T (poly A/T) 序列、微衛星體 (microsatellite) 片段或難以判斷同源性(homology)的混淆位點 (ambiguous site) 均不納入分析。

分子親緣關係分析(Molecular Phylogenetics Analysis)

本研究之親緣關係重建乃利用貝葉氏導出式分析 (Bayesian inference analysis, BI) 及最大似然性分析 (maximum likelihood, ML) 進行，上述分析中所使用 DNA 序列分子演化模型（models of molecular evolution）以 MrModeltest (Nylander, 2004)計算，得出最合乎 DNA 演化的最佳模式，並根據赤池資訊準則

(Akaike information criterion, AIC) 選取。分子標記分成三個 partition，分隔計算。

貝葉氏導出式分析 (BI) 以 MrBayes 3.2.2 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003) 進行 2x10⁷次演算世代 (generation)，演算期間產生的演化樹每 1,000 個世代取樣一次，共得到 20,000 個演化樹，扣除取樣中最早得到的 25% (及 5,000 個演化樹，

burnin=5,000)，將最後保留的 15,000 個演化樹經計算後合併成一個 50%多數共識樹(50% majority consensus tree)，並在分支上標記後驗機率 (posterior

probability)。

似然性引導式再取樣值(likelihood bootstrap value, LB)以 CIPRES Portals (http://www.phylo.org/index.php/portal/) 提供之 RAxML-HPC2 v8.2.4 (Stamatakis, 2014) 進行，DNA 資料矩陣如前述分析分割成三部分，並以程式自行估算出的 GTR+G 模型之下進行分析，經重複 1000 次再取樣後，將再取樣值標記於 BI 50%

多數共識樹之上。

祖先性狀重建分析(Ancestral State Reconstruction Analysis)

利用 Mesquite 2.75 (Maddison and Maddison, 2015) 進行形態特徵演化分析，

將物種形態進行編碼，包括 6 個特徵組合成矩陣輸入，包括以下數個形態特徵：

生育環境(habitat)、生活型(habit)、果實類形(fruit type)、子房室數目(locule number)、

胎座形式(placental type)、胎座裂片數(placentae division)，各特徵性狀如表 2-3。

利用貝葉氏導出式重建之親緣關係為基礎，以最大簡約法(maximum parsimony) 重建可能的祖先性狀。

結果

DNA dataset 資料統計與分子演化模型

共取樣 177 個亞洲分類群的葉綠體 DNA 序列(附表 1)，經排序後的統計結果如表 2-2，trnL-F 得 1009 個位點，rpL16 intron 得 1272 位點，trnC-ycf6 得 1190 位點，ycf6-psbM 得 1367 位點，psbM-trnD 得 1134 位點，加總長度共為 5972 個

位點，因排序不明確(ambiguity)而排除不予分析的位點共 1886 個，佔總位點數的 31.58%，包含在分析中的位點有 4086 個；利用 MrModeltest (Nylander, 2004) 選取的演化模型為：rpL16: GTR+G；trnC-D: GTR+I+G；trnL-F: GTR+G。

親緣關係樹重建

以貝葉氏導出式分析進行 2x10⁷個世代的分析，各支序群的後驗機率 (posterior probability, PP)大於 0.75 者均顯示於分支上。結果如圖 2-1，亞洲秋海 棠屬植物與原產非洲索科特拉島(Socotra Island)的 B. socotrana 及 B. samhamensis 形成一單系群，亞洲分類群中最早分化者為印度次大陸之物種，其餘物種則分成兩大支序群，Clade C 和 Clade D。

C 支序群(Clade C)包含一個由扁果組、圓果組以及部分秋海棠組組成的、具 有較高支持度的支序群(Platycentrum - Sphenanthera Clade or PLA-SPH,

PP:1/LB:75)，深陷於(deeply nested)一群落葉性、具球莖並生長於季節性明顯棲地的物種之中(DIP Grade)。DIP Grade 由 33 個具球莖的物種組成，其中最早分歧 的是產自喜馬拉雅地區的 B. dioica，並與其他 Clade C 的組成物種(Clade C1, PP:1/LB:96)形成姊妹群，而 Clade C1 中產自中國的 B. grandis 又與其餘物種 (Clade C2, PP:.55/LB:<50)形成姊妹群， Clade C2 則由 Parvibegonia Clade (PAR, PP:.96/LB:87)和 Clade C3 (PP:1/LB:96)兩個互為姊妹群的亞支序群組成，PAR Clade 由八個 Sect. Parvibegonia 物種組成，其中 B. bella, B. sinuata, B. sp. Thailand B 和 B. sp. Viet Nam Peng22812 四個分布於中南半島，B. elisabethae 分布於巽他 大陸地區，B. tenuifolia 分布於爪哇，而 B. phoineogramma 和 B. variabilis 則同 時分布於中南半島與巽他大陸地區，Clade C3 包含 14 個中國物種，7 個喜馬拉 雅物種，1 個中南半島物種(B. sp. Thailand A)及一個 1 台灣物種(B. ravenii)。

PLA-SPH Clade 包含 78 個物種(扁果組 50 種，圓果組 13 種，秋海棠組 12 種，

棒果組、單翅組及未確認組別各一種)，其中的中國物種與喜馬拉雅地區及中南半島的物種互相參雜。

D 支序群(Clade D)除了 B. peltatifolia, B. kingiana, B. bataiensis, B. boisiana 外，

主要分成五個亞支序群，分別為 Coelocentrum Clade (COE Clade, PP:1/LB:100), Baryandra Clade (BAR Clade, PP:1/LB:100), Reichenheimia Clade (REI Clade, PP:1/LB:100), Petermannia Clade I (PET I Clade , PP:1/LB:99) 和 Petermannia Clade II (PET II Clade , PP:1/LB:89)，其中 BAR Clade, REI Clade, PET I Clade 和 PET II Clade，加上由 B. kingiana 和 B. bataiensis 組成的一個支持度極高的小支序 群(PP:1/LB:100)，以及 B. peltatifolia，共同組成一個具有中等支持度的單系群 屬合被秋海棠組(Sect. Symbegonia)和 B. bracteata 屬苞花秋海棠組(Sect.

Bractaebegonia)外，其餘皆為等翅組。

中國物種大多集中在 C 支序群，只有產自廣西—北越喀斯特石灰岩地區的側 膜組物種和兩個產自海南島的物種：B. petatifolia (Sect. Diploclinium)和 B.

hainanensis (Sect. Petermannia)；屬 D 支序群的成員。

台灣秋海棠物種中，蘭嶼秋海棠(B. fenicis)深陷於(deeply nested)主要由產自 菲律賓秋海棠組(Sect. Baryandra)物種所形成的 BAR 支序群中，是台灣產秋海棠 裡唯一屬於 Sect. Baryandra 的物種；而台灣產具球莖的物種岩生秋海棠(B. ravenii) 與大部分其他具球莖的亞洲物種共同組成 DIP Grade；其他取樣到的台灣物種包 括 B. austrotaiwanensis, B. bouffordii, B. chitoensis, B. chuyunshanensis, B.

Clade 的成員，並分別屬於三個不同支序群：其一由 B. chuyunshanensis,

B.taiwaniana, B. wutaiana 三者組成(PP:0.85/LB:72)，其二由 B. austrotaiwanensis, B.

bouffordii, B. chitoensis 與 B. pinglinensis; (PP:1/LB:100)；其三為 B. formosana 獨 自形成的支序群。上述三個支序群與九個圓果組物種及兩個扁果組物種(B.

annulata 和 B. iridescens)形成一個具有高支持度的單系群(PP:1/LB:96)。其中第 一個支序群與 B. longifolia 形成姊妹群，兩者所組成的支序群支持度中等 (PP:1/LB:76)。

祖先性狀重建分析(Acenstral State Reconstruction Analysis) 生育環境

如圖2-2A所示，亞州秋海棠屬植物的祖先可能是適應乾燥環境，爾後分別演化出適應潮濕和石灰岩環境的性狀，適應石灰岩環境的性狀也非單一起源，部分

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