亞洲秋海棠雜交多倍體化現象研究 - 亞洲產秋海棠屬植物分子親緣關係研究以及對其系統分類學與生物地理學的影響

前言

過去的分子譜系研究不斷強調地理隔離在秋海棠種化過程中的重要性 (Chung et al., 2014; Forrest and Hollingsworth, 2004; Hughes, 2008; Plana, 2003;

Plana et al., 2004; Thomas et al., 2012)，相對的，種間雜交的現象在秋海棠種化過程中扮演的角色卻一直被忽略。現生亞洲秋海棠的天然種間雜交頻繁(Chiang et al., 2001; Kiew et al., 2003; Li et al., 2005; Peng and Chen, 1991; Peng and Chiang, 2000; Peng and Ku, 2009; Peng et al., 2010; Peng and Sue, 2000; Teo and Kiew, 1999)，臺灣原生秋海棠屬 (Begonia L.) 植物已知共有 18 種，其中包含 4 種天然雜交種。

生物種觀 (Mayr, 1942) 認為種是一群自然的族群，個體能互相交配，但與其他族群有生殖隔離 (Species are groups of actually or potentially interbreeding natural populations, which are reproductively isolated from other such groups)。在生物種觀下，種化是建立生殖隔離的過程，使得新形成的類群不與原有的類群基因交流。雜交後代必須克服生殖隔離的障礙，才能對物種多樣性有較大貢獻，雜交打破了生物種的定義，但雜交種的結果，仍是遵循生物種觀的 (Arnold, 1997)；

所以，雜交種化的關鍵在於生殖隔離失敗與重新確立，其中，多倍體化為植物雜交後能否成功種化的重要機制之一 (Grant, 1981)。

在臺灣產秋海棠屬植物中，就有多種不同的倍體數，其中僅圓果秋海棠(B.

longifolia, 2n=22)、裂葉秋海棠(B. palmata, 2n=22)、蘭嶼秋海棠(B. fenicis, 2n=26) 為二倍體 (Oginuma and Peng, 2002; Peng et al., 2005; Peng and Ku, 2009)，然其他物種難以估算倍體數，因為多倍體化和非整倍體化 (aneuploidization) 為秋海棠屬的特性，染色體基數至今仍無法確定 (Oginuma and Peng, 2002)。Oginuma and

Peng (2002) 提出亞洲產種類的祖先染色體數可能為 2n=22，但 Thomas (2010)則 發現 Petermannia-Coelocentrum clade 的染色體數多為 2n=30，又亞洲支序基群的 印度物種亦是，推論亞洲物種的祖先染色體基數為 n=15。

在亞洲秋海棠過去的演化歷史中，究竟有多少雜交種化事件成功續存到現代？其對現生物種多樣性的貢獻如何？對於特徵演化是否造成影響？對秋海棠的拓遷是否有正面的影響？

雜交是兩組異源基因的結合，故 DNA 的相關方法提供了有力的證據。透過分別以核內低拷貝基因序列以及葉綠體 DNA 序列重建之親緣關係進行比對，並以此探討染色體數的演化，將可能回答以上問題。

材料與方法

取樣

材料多為野外採集葉片並直接以矽膠乾燥，部份植物為栽植於中研院溫室新鮮材料。基本上每個物種採取一個個體。部分樣品為具有不同果實型態或具有較高染色體數疑似雜交起源的種類，證據標本存放於中研院標本館(HAST)。

共取樣 52 個不同分類群的亞洲秋海棠屬植物(附表 3)，分屬九個不同的組，

其中包含圓果組(Sect. Sphenanthera)11 個分類群，親緣關係與其最為密切之扁果 組(Sect. Platycentrum) 22 種(附錄三)，同時包括秋海棠組(秋海棠組)10 種，側膜 組(Sect. Coelocentrum)2 種，單座組(Sect. Reichenheimia)2 種，棒果組(Sect.

Leprosa)1 種，單翅組(Sect. Monopteron)1 種，等翅組(Sect. Petermannia)1 種，以 及二室單座組(Sect. Ridleyella)1 種。

染色體數

在葉綠體標記重建之親緣關係樹上標記個物種染色體數，各物種染色體數來自文獻(Doorenbos et al., 1998; Gu et al., 2007; Oginuma and Peng, 2002)與本研究室未發表資料。

分子實驗方法

總 DNA 萃取參考 Doyle and Doyle (1987)、Kopperud and Einset（1995）等之研究，以 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)方法從液態氮下磨成粉末的植物組織分離出。由於多數秋海棠植株呈酸性，常導致 DNA 萃取失敗，利用 Kopperud and Einset（1995）的方法，以稀釋之緩衝液清洗磨碎的材料，提高 pH 值後，再加入 CTAB 萃取 DNA，得以提高實驗成功率及產量。

葉綠體 DNA 選用五個 intergenic spacer,包括 trnL-trnF、trnC-ycf6、ycf6-psbM、

psbM-trnD 以及 rpL16 intron，細胞核 DNA 片段則選取二個低拷貝核基因片段 PISTILLATA (PI, ca. 1.8kb)與 RNA Polymerase Large Subunit II (RPB2, ca. 1.1kb)。

各標記進行聚合酶連鎖反應(PCR)時所使用之引子序列如表 5-1。定序儀機型為 ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。

細胞核 DNA 片段先 TAE 系統之瓊脂膠體電泳分析確認片段長度正確，或在 UV 燈下取出長度正確之 DNA 片段回收，再純化 PCR 產物。在此測試階段時，

特定細胞核 DNA 片段的不同複本以 DNA 選殖方式進行。即利用 pGEM-T Easy (Promega Corporation) 試劑模組，將純化後之 DNA 片段做接合反應(ligation)連接至載體 pGEM-T Vector system (Promega, USA)上，轉殖(transformation)至大腸

桿菌(DH5α 菌株)中；再以抗生素 ampicillin 和 X-Gal 的篩選，挑選白色的菌落培養後送定序。另對每個物種分別挑 10-15 個菌落進行 colony PCR 確認是否帶有目標片段。將帶有目標片段的菌落挑至裝有 2 μL LB 之試管中培養約 15 小時。以 Mini Plus^TM Plasmid DNA Extraction System (Viogene, Taiwan)，並依照手冊上步驟萃取質體 DNA。同源性(homology)的不確定位點 (ambiguous site) 均不納入分析。個別樣本得到的五個片段葉綠體 DNA rpL16 intron、trnC-ycf6、ycf6-psbM、psbM-trnD、trnL-F 合併成一個矩陣進行分析。

核基因片段的分析，是先將所有 clone 序列先混合分析，以確認 clone 序列的分群。本研究之目的在確認多倍體個體所擁有的 homoeologous gene copy 及其親本支序群來源，並非探討 allele 之多型性，因而在一個體中得到的 clone 序列若歸在同一支序則僅保留其中一條序列做為代表，此方法並能減少整個矩陣的大小，便於後續軟體分析。又部分序列有重組 (recombination) 現象，為避免干擾親緣分析結果，將可能的重組序列排除不放入分析。

序列矩陣先以 MrModeltest (Nylander, 2004)計算其分子演化模型（models of molecular evolution），得出最合乎 DNA 演化的最佳模式，並根據赤池資訊準則 (Akaike information criterion, AIC) 選取。親緣關係重建乃利用最大簡約法 (maximum parsimony, MP) 和貝葉氏導出式分析 (Bayesian inference analysis, BI) 進行。

最大簡約法以 PAUP* v. 4.0b10 (Swofford, 2002)，以窮盡搜尋法(heuristic

searches)，所有位點等權重，gap 處理為 missing data，分類群資隨機加入(random taxon addition)，並以 TBR (tree-bisection-reconnection)建構樹。為求得樹形的支持度，以重複 1000 次(replicates) 的 bootstrapping 計算 (Felsenstein, 1985)。

貝葉氏導出式分析是以 MrBayes 3.2.2 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)進行 20,000,000 次演算世代 (generation)，演算期間產生的演化樹每 1,000 個世代取樣一次，可得到 20,000 個演化樹，為使最佳化，扣除取樣中最先得到的 25%的演化樹 (及 5,000 個演化樹，burnin=5,000)，將最後保留的 15,000 個演化樹經計算後合併成一個 50%多數共識樹(50% majority consensus tree)，並在分支上標記後驗機率 (posterior probability)。

結果

染色體數

染色體數標註在以葉綠體 DNA 片段重建之親緣關係樹上在(圖 5-1, 5-2)，分析中包含的物種染色體數以 2n=22 最普遍，但也有 2n=16, 18, 20, 24, 26 等變異，

染色體數較高的物種有 B. emeiensis (2n=33), B. ravenii (2n=36), B. taiwaniana (2n=38), B. roxburghii (2n=22, 44), B. chuyunshanensis (2n=52), B. af. multangula (2n=56), B. formosana (2n=60, 64), B. robusta (2n=66), B. handelii (2n=22, 44, 66, 77)。

DNA dataset 資料統計與分子演化模型

葉綠體分子標記部分共取得 52 個亞洲分類群 DNA 序列，經排序後的統計結果如表 5-2，五個片段(trnL-F, rpL16 intron, trnC-ycf6, ycf6-psbM, psbM-trnD) 共得 4977 位點，因排序不明確(ambiguity)而排除不予分析的位點共 598 個，包含在分析中的位點有 4201 個，具簡約意義的位點有 222 個；利用 MrModeltest (Nylander, 2004)選取的演化模型為 rpL16: GTR+G；trnC-D: GTR+I+G；trnL-F:

GTR+G。

PI 分子標記部分共取得 51 個分類群 61DNA 序列，其中 B. taiwaniana 與 B.

lancangensis 中發現兩個不同的疑似同源基因片段，B. formosana, B.

chuyunshanensis, B. multangula, B. robusta 四個物種則分別發現三個不同的疑似 同源基因片段，經排序後共得到 1846 位點，因排序不明確(ambiguity)而排除不予分析的位點共 188 個，包含在分析中的位點有 1658 個，具簡約意義的位點有 289 個；利用 MrModeltest (Nylander, 2004)選取的演化模型為 GTR+G。

RPB2 分子標記部分共取得 51 個分類群 57 DNA 序列，其中 B.

chuyunshanensis 中發現三個不同的疑似同源基因片段，B. formosana, B.

multangula, B. robusta, B. taiwaniana 四個物種則分別發現兩個不同的疑似同源基 因片段，經排序後共得到 1713 位點，因排序不明確(ambiguity)而排除不予分析的位點共 616 個，包含在分析中的位點有 1097 個，具簡約意義的位點有 115 個；

利用 MrModeltest (Nylander, 2004)選取的演化模型為 GTR+G。

綜合上述結果得知取樣分類群中包含五個疑似異源多被體(allopolyploid)，分 別為 B. chuyunshanensis (2n=52), B. formosana (2n=60, 64), B. af. multangula (2n=56), B. robusta (2n=66), B. taiwaniana (2n=38)，以下分析結果將主要針對這五 個物種進行探討。

chuyunshanensis, B. formosana和B. taiwaniana與8個圓果組分類群形成一個單系 群(SPH Clade)，其中B. chuyunshanensis和B. taiwaniana形成姊妹群。B. af.

multangula和B. robusta與15個扁果組分類群形成另一個單系群(PLA Clade)。檢視 本分析中取樣到的漿果狀物種，包含外群中的B. leprosa，顯示漿果狀果實的性 狀至少具有六個不同起源。

PI 親緣關係

以最大簡約法及貝葉氏導出式分析所得到結果如圖5-3, 5-4，由於部分物種包 含兩個或以上的基因拷貝(gene copy)，不同拷貝將以學名加代號稱呼，B.

formosana P2, B. formosana P3, B. chuyunshanensis P3, B. af. multangula P3, B.

taiwaniana P2與8個圓果組分類群以及B. nepalensis (Sect. Monopteron)形成一個 單系群(SPH Clade)，其中圓果組的成員之一B. lancangensis亦具有兩個不同拷貝，

B. lancangensis P1與B. silletensis subsp. mengyangensis形成姊妹群，而B.

lancangensis P2則與B. acetosella形成姊妹群。B. chuyunshanensis P1, B.

chuyunshanensis P2, B. taiwaniana P1, B. formosana P1自成一單系群。B. af.

multangula P2和B. robusta P3與兩個扁果組物種B. baviensis和B. palmata組成一單 系群。B. af. multangula P1, B. robusta P1, B. robusta P2與17個扁果組物種形成一 單系群(PLA Clade)。

RPB2 親緣關係

以最大簡約法及貝葉氏導出式分析所得到結果如圖5-5, 5-6，B. robusta R1, B.

robusta R2, B. chuyunshanensis R3, B. formosana R2, B. taiwaniana R2與8個圓果 組分類群以及B. nepalensis形成一單系群 (SPH Clade)，B. chuyunshanensis R2, B.

taiwaniana R1與三個扁果組物種B. longiciliata, B. manhaoensis和B. oreodoxa形成 單系群，並與SPH Clade 互為姊妹群，B. af. multangula R1, B. af. multangula R2, B.

chuyunshanensis R1, B. formosana R1與其餘所有26個常綠性物種組成一單系群 (PLA)。

討論

雜交種化現象對秋海棠物種多樣性的貢獻

比對葉綠體與核基因親緣關係樹，發現一個異源同倍體B. lancangensis及五 個異源多倍體 B. chuyunshanensis, B, formosana, B. multangular, B. robusta,和B.

taiwaniana，表示雜交種化現象對秋海棠物種多樣性有一定程度的貢獻。在植物 進入新生境過程中，雜交後的基因重組現象可促進產生快速適應新生境的能力，

本研究中使用的分類群主要分布於亞洲大陸，而目前發現的雜交物種中，除了 B. lancangensis外，其餘五種均分布於島嶼，B. multangular和B. robusta產自爪哇，

B. chuyunshanensis, B, formosana和B. taiwaniana則產自台灣，而台灣產秋海棠物 種大多具有雜交起源(Oginuma and Peng, 2002; 楊巽安, 2011)，即說明了種兼雜交現象對新物種形成的貢獻。

由於葉綠體一般是母系遺傳，因此在葉綠體親緣關係樹中，B. lancangensis 與B. silletensis subsp. mengyangensis形成姊妹群，可推測雜交起源物種的母本果 實形態，B. chuyunshanensis, B. formosana, 和B. taiwaniana 的母系DNA可能來自 漿果狀物種，而B. cf. multangula和B. robusta則可能來自蒴果物種。B.

chuyunshanensis與B. taiwaniana為姊妹群，兩者可能傳承相同母系DNA，又B.

longifolia與該二物種的關係非常接近，疑似即為其母本。五個異源多倍體物種都 可能都是由漿果狀物種與蒴果物種間雜交後種化而來，由於B. cf. multangula和B.

robusta具有漿果狀果實，而其母系DNA來自蒴果物種，因此利用葉綠體重建親 緣關係時，會認為B. cf. multangula和B. robusta的漿果狀果實各自具有獨立的起源，

同時B. chuyunshanensis, B. formosana, 和B. taiwaniana以其蒴果性狀，卻承載漿 果狀祖先的母系DNA，使得利用葉綠體重建的親緣關係中會誤以為這些物種的蒴果性狀是反祖現象，必須藉由比較葉綠體與核基因親緣關係後方得釐清。

本研究中葉綠體與核基因之間的親緣關係樹或兩個核基因之間的親緣關係樹的分支結構不盡相同，可能由以下原因造成：(1) 對異源多倍體而言，在選取

在文檔中亞洲產秋海棠屬植物分子親緣關係研究以及對其系統分類學與生物地理學的影響 (頁 61-105)