將構築完成之 pET23a-GSK3圖一重組質體進行表達與純化，
首先將重組質體送入表達的大腸桿菌宿主 BL21(DE3)中，於 37°C、
IPTG 1 mM 之條件下誘導三小時。GSK3蛋白大小約 49 kDa，誘導 達(圖四 B)。Negative control 為 pET23a 質體。
我們使用另外一種優化條件，將重組質體轉形至 Rosetta-gami B
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(DE3)[簡稱 RGB(DE3)]和 Origami(DE3)兩種大腸桿菌宿主中，並且於 IPTG 濃度 0.4 mM 下分別將兩種大腸桿菌宿主於 30°C 誘導 23 小時、
20°C 誘導 3 天以及 16°C 誘導 6 天。由於 pET system 所使用的大腸桿 菌宿主必須能夠表達 T7 RNA Polymerase，所以宿主必須含有
lamda-DE3 lysogen(DE3)才能啟動 T7-promotor，因此，我們使用沒有 含 DE3 的大腸桿菌宿主 RGB 和 Origami 當作負控制組，以利比較觀
(二) 融合蛋白表達系統－pMAL™ Protein Fusion and Purification System
Maltose-Binding Protein (MBP)是一個具高度水溶性的蛋白，此融 合蛋白系統藉由在欲表達的蛋白前融合 MBP，使得蛋白增加溶解度，
來改善蛋白易沉澱的問題。
構築完成的 pMAL-p2x-GSK3和 pMAL-c2x-GSK3重組質體後
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(圖二)，進行重組蛋白表達，將 pMAL-p2x-GSK3重組質體轉型至 BL21(DE3)和 K12 TB1 大腸桿菌宿主中誘導表達，MBP-GSK3融合 蛋白大小約 92 kDa，結果不管於破菌上清或破菌沉澱皆沒有蛋白被 SalI/EcoRI 作用，此作用會使 pMAL-P2X 質體和 GSK3基因片段分 離，pMAL-P2X 質體片段大小為 6720 bp，GSK3基因片段大小為 1302 bp，可以看到電泳分析結果 lane 3 和 7 呈現此大小之片段，另外重組 質體再以限制酶 BamHI 作用，此作用會使重組質體呈現直線形式 (linear form)，pMAL-p2x-GSK3片段大小為 8022 bp，可以看到電泳 分析結果 lane 4 和 8 呈現此大小之片段，綜合以上結果證實重組質體 依舊存在於 BL21(DE3)和 K12 TB1 大腸桿菌宿主中，另外，控制組 pMAL-P2X 質體以限制酶 SalI/EcoRI 和 BamHI 作用後，電泳分析結 果 lane 1.2.5 和 6 皆呈現原本質體片段之大小 6720 bp(圖六 C)。
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將另一個重組質體 pMAL-c2x-GSK3轉型至 BL21(DE3)和 K12 TB1 大腸桿菌宿主中誘導表達，可觀察到破菌上清無融合蛋白表達，
但於破菌沉澱中可觀察到有大量融合蛋白被誘導表達(圖七)，而表達 的情形為大腸桿菌宿主 K12 TB1 表達的蛋白量較多，於是我們後續 優化表達條件選用此宿主，另外，其控制組 pMAL-c2x 有成功的表達 出 MBP 蛋白大小約 50 kDa。
為了改善 pMAL-c2x-GSK3融合蛋白的包涵體Inclusion body，
我們進行了表達條件之優化，表達條件如表三。在此優化表達的策略 中，嘗試了多種表達條件後，依然無法成功的表達出可溶的
MBP-GSK3融合蛋白。
二、 蛋白重摺疊(Protein refolding)
我們利用蛋白質重新摺疊的方式，試圖使之摺疊正確、增加水溶 性和具有活性。先以終濃度 8M 之尿素將蛋白結構解開後，以鎳離子 管柱純化，並利用不同的 pH 質將蛋白與管柱分離，並得到單一蛋白。
我們用了五種 pH 值梯度(8.0、6.3、5.9、4.5、2.0)，其中蛋白於 pH 5.9 的環境下被競爭下來，於是我們得到了未折疊的 GSK3蛋白(圖八 A)。
之後經由透析緩慢的將尿素的濃度降低，同時蛋白也漸漸得重新摺疊，
重摺疊後，發現有大部分蛋白沉澱，但仍有一些水溶性的蛋白(圖八
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B)。於是，我們將水溶性的 GSK3蛋白取 1l 做活性的測試(圖八 C)，
此實驗正控制組為購買之 GSK3蛋白(購自 Promega)，反應於兩種 pH 值，分別是 pH7.0 和 pH5.9。一般活性測試之反應環境為 pH7.0，但 可以競爭 GSK3的活性中心 ATP-binding site 的小分子化合物，做為 治療阿茲海默症的候選藥物。孫老師從 Zinc 資料庫(此資料庫有>
13,000,000 個小分子化合物)中，篩選並推薦了 20 個小分子化合物、
工研院提供的小分子藥庫中，篩選並推薦了 20 個藥物，這些藥物已 知有抑制其他蛋白的功能(適用於其他疾病)，但並非阿茲海默症的候