參、研究方法
一、 人類GSK3之全長cDNA的取得
本研究所使用的人類全長 GSK3的 cDNA 購於 GenDiscovery Biotechnology 重組質體 pOTB7-GSK-3 (GenDiscovery
Biotechnology)。 promoter 與 ribosome binding site 中間多了不明的 10 個核甘酸，進而 影響蛋白質無法順利被表達，因此我們決定以置換正確的 pET23a 載 體的方式重新建構 pET23a-GSK3。
(1) 插入片段之建構
1.1 將保存於 DH5之 pET23a-GSK3(由永資陵學姊建構)重組質體，
以質體 DNA 小量製備法取得重組質體。
使用 High-Speed Plasmid Mini Kit(Geneaid)做質體 DNA 小量製備。
以牙籤挑出單一菌落並養在含100 μg/mL Ampcillcin 之 3 mL LB 培養 液中，於 37 °C、225 r.p.m.做隔夜培養。而後以 12,000 rpm 離心 10
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分鐘，除去上清液。加入200 μL PDI buffer 並劇烈震盪至均質後，加 入200 μL PDⅡ buffer 溫和翻轉微量離心管數次，而後再加入 300 μL PDⅢ buffer 溫和翻轉微量離心管數次，以 12,000 rpm 離心 15 分鐘沈 澱細胞碎片。組裝 spin column 與 collection tube 後，取含有核酸的上 清液到 spin column 中，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄去廢液；加入
1.2 將質體以限制酶 SalI(Bio Lab)和 NdeI(Bio Lab)作用，使得 pET23a 質體與 GSK3 基因片段分離，即獲得 GSK3插入片段。
1.2.1 限制酶反應
pET23a-GSK3以限制酶SalI(Bio Lab)和NdeI(Bio Lab)反應，反應 條件為37 °C，作用16-18個小時。
1.2.2 DNA電泳分析
取適量限制酶反應後樣品，加入適量 6×DNA loading dye 做 DNA 電泳分析。
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Agarose 回溶於 1× TAE buffer (GeneMark) 1.2.3 純化 DNA 片段
上述DNA片段經限制酶切割，且經含EtBr (Ethidium bromide) (0.25 µg/mL)的洋菜膠電泳分離後，在紫外光標示下切下GSK3 基因 片 段 ， 置 於 1.5 mL 微 量 離 心 管 中 ， 使 用 DNA clean-up/extraction kit(GeneMark)做DNA純化。方法為加入適量PG buffer於55 °C乾浴槽 中培養10分鐘以徹底回溶洋菜膠，組裝spin column與collection tube後，
將溶解後的膠體轉移到spin column中，以12,000 rpm離心1分鐘，棄去 廢液；加入400 µL W1 solution，以12,000 rpm離心1分鐘，棄去廢液；
加入600 µL washing solution，以12,000 rpm離心1分鐘，棄去廢液。藉 由真空抽氣去除剩餘酒精後，將spin column轉移到新的微量離心管中，
加入適量(50 µL)高溫(65 °C)滅菌水於spin column並等待2分鐘等膜吸 收水分，12,000 rpm離心4分鐘，即完成GSK3片段純化。
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(2) 載體之建構
2.1 將保存於 DH5之 pET23a-htreH 重組質體(由張紘綸學長建構)，
以質體 DNA 小量製備法取得重組質體(質體 DNA 小量製備方法同 上)。
2.2 將質體以限制酶 SalI(Bio Lab)和 NdeI(Bio Lab)作用，使得 pET23a 質體與 htreH 基因片段分離，即獲得 pET23a 載體片段。
2.2.1 限制酶反應(方法同上)
pET23a-htreH 以限制酶 SalI(Bio Lab)和 NdeI(Bio Lab)反應，反應條件 為 37 °C 作用 16-18 個小時。 終止反應，反應液包含 T4 DNA ligase(Promega)與 10×緩衝液。
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(4) 質體轉型
重組質體轉型進入大腸桿菌之 DH5α (GeneMark, Tainan, Taiwan)菌種，
經由 DNA 電泳分析與定序挑出含有正確序列重組質體的 DH5α 菌株 並將該菌株作冷凍保存。完成 pET23a-GSK3 重組質體之建構(圖 一)。 pGEM-T easy vector 後，以 SalI(Bio Lab)和 EcoRI(Promega)兩種限制 酶反應後得到 GSK3。
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將 pMAL-c2X 質體(Bio Lab)以 SalI(Bio Lab)和 EcoRI(Promega)兩種限 制酶反應後，完成載體之製備。
(3) 接合反應
方法同上，完成 pMAL-c2X-GSK3 重組質體之建構(圖二)。
15 yeast extract、10 g/L NaCl)培養液中，以 37°C、225 r.p.m.隔夜培養後，
取 1 mL 菌液加入 30 mL LB 培養液中，於 37 °C 培養 1 小時後(OD600