（ß-tubulin）基因進行塊菌之親緣分析
一、前人研究
（一）塊菌形態特徵鑑定
菌根的分類向來是研究菌根最基礎工作，菌種種類繁多卻無有規則的菌根形 態特徵可供分類時，則會產生相互間不易比較差異且混亂之情形，因此，為了進 一步瞭解林木－真菌間的關係，作好菌根分類確有其必要性。胡弘道（1990）指 出，基於四種研究需求而須針對菌根進行分類：（1）生理研究－因真菌種間之生 理特徵不同，故菌種能改變菌根之生理與形態，並間接影響林木生理之行為；（2）
病理研究－菌根因有菌毯形成機械障礙、分泌抗生素以及避免根吸收土壤毒素等 因素，因而有抗病之機制；（3）生態研究－針對暸解外生菌根之地理分布與其在 自然環境中季節變化等關係；（4）研究結果之應用－目前菌根接種仍少應用在苗 圃及森林之原因，即是因為分類不全之故，若分類健全，則對接種或野外之菌根 型，自能預知其功用。
傳統之外生菌根分類及形態特徵研究，是以光學顯微鏡為基礎，進行菌根或 子實體表面觀察，但是如菌毯菌絲表面之微細差異，只靠光學顯微鏡之觀察是無 法分辨的，因此利用電子顯微鏡技術來觀察菌根之微細構造，給予菌根鑑定、分 類等提出更可靠之方法（Massicotte et al., 1987）。其他如利用不同化學試劑進行菌 根試劑反應、細胞化學的利用與其他染色技術等，都可以增加顯微鏡在區別鑑定 菌根之效率（胡弘道，1990）。描述新發表的塊菌菌種時，也多藉由上述幾種方法，
塊菌的形態特徵描述，可以從兩大方向來作觀察，第一種為進行肉眼可觀察到的 宏觀特徵（macroscopic character），另外一種則是以電子顯微鏡進行微觀特徵
（microscopic character）。宏觀特徵如塊菌子實體的外形、果皮形態是否具疣
（warts）、基部有無凹孔、果肉顏色、產孢組織之菌脈特徵等作簡單的區分，而微
觀特徵則是針對孢子構造、孢子飾紋（spore ornamentation）、孢子在子囊內的排列、
菌絲形態等，作為分類的依據，依據孢子形態更可將塊菌細分為兩大類，一為具 刺狀（spines），另一種則為蜂巢網狀（reticulata）（Trappe, 1979）。
最先進行塊菌菌根的外部形態描述為Fontana 與 Palenzona（1979），他們是以 義大利白塊菌接種毛櫟（Quercus pubescens）後，以顯微鏡觀察塊菌菌根並描述特 徵，之後有許多研究者（Fontana et al., 1990；Zambonelli et al., 1993）也以苗木接 種塊菌，在形成菌根後，進行形態上的描述。Comandini 與 Pacioni（1997）則是 首先針對兩種形態相類似的塊菌，進行詳細比對形態的研究人員，他們指出兩種 亞洲塊菌－印度塊菌與喜馬拉雅塊菌，均與在歐洲有黑色金剛鑽（black diamond）
之稱的黑孢塊菌有著相類似的外形，此二種亞洲塊菌於1993 年引進歐洲後，即有 許多商人因為他們的價錢較低，而將亞洲塊菌的菌根苗以黑孢塊菌的菌根苗名義 出售，造成歐洲地方性塊菌族群受到生物性污染（biopollution）的風險，有鑑於此，
他們針對此二種亞洲塊菌的菌根形態作詳細的描述與比較。試驗結果發現，以菌 根的外部形態來講，兩者之間非常相近，僅可藉由菌毯最外層的部分作區別，喜 馬拉雅塊菌的菌毯表面相當明顯，菌絲大多為同種形式且菌絲細胞皆有相似的形 狀與大小；印度塊菌的菌毯表面結構異質性相當高，菌絲通常由四邊形或形狀不 規則的細胞所組成，且菌絲細胞間隙比較大。此外，Zhang 與 Minter（1988）的研 究指出，印度塊菌的孢子屬於刺狀，喜馬拉雅塊菌的孢子則為網狀，但是研究中 卻發現，印度塊菌與喜馬拉雅塊菌，均可發現同時有兩種孢子存在於同一子囊的 情形，因此，以形態來觀察兩種亞洲塊菌的方法至今仍存在許多爭議。
Halász 等（2005）以外觀形態法進行歐洲白塊菌之分類，他們使用子實體外 部形態（平滑或具疣狀突起）、子囊盤（excipulum）外部特徵、表皮囊狀體
（dermatocystidia）、孢子大小、每一個子囊內的孢子數目等五種特徵進行分類，結 果成功的將歐洲白塊菌分成五大類，分別為波奇塊菌、T. foetidum、T. maculatum、
T. puberulum、T. rapaeodorum。而 Halász 等更表示，在他們所研究的塊菌屬中，
表皮囊狀體與子囊盤外部特徵為相當可信賴的分類特徵，然而表皮囊狀體卻在塊 菌老化時，會有分解（collapse）與消失的情形（Mello et al., 2000）。此外，Halász 等也針對塊菌形態會因外在環境條件而改變的特性作出建議，他們認為如果要以 形態來分類，應該要在各種子實體形成的過程中，針對氣候因子作控制，以減少 環境的干擾。
Moreno 等（1997）則是在進口自亞洲的喜馬拉雅塊菌中，發現有一些在形態 上與傳統的喜馬拉雅塊菌略有不同的新種，因此將其命名為偽喜馬拉雅塊菌，他 們也是以孢子與子實體的形態來作區別，結果發現，偽喜馬拉雅塊菌的孢子有一 種獨特的特徵，即是網刺狀孢子（reticulated-spiny），而且其孢子壁較其他種塊菌 薄，子實體顏色與喜馬拉雅塊菌比較起來呈較偏暗褐色；然而此一塊菌菌種若以 子實體外部形態來觀察，與喜馬拉雅塊菌、印度快菌、黑孢塊菌與T. spinoreticulatum 等四種塊菌容易混淆。
Wang 等（1998）從中國四川地區的雲南松林下發現另一塊菌新種－擬凹孔塊 菌，擬凹孔塊菌的最大特徵即是具有褐色的子實體，呈現橢圓狀，且果皮有很深 的孔（deeply excavate），每一個子囊內具有1～8 個孢子，孢子形態呈刺網狀。Wang 等指出，世界上主要的有孔塊菌原為兩種，一為凹孔塊菌，另一則為中果塊菌，
擬凹孔塊菌為第三種發現的有孔塊菌，三者之間明顯差異為，凹孔塊菌具有較平 滑的子實體果皮，每一子囊有3～5 個孢子，孢子的形態為網狀不具刺；中果塊菌 的子實體則呈暗黑色，每一子囊內有一個孢子，但孢子形態亦為網狀不具刺。Wang 與He（2002）則發現另一新種，稱之為會東塊菌，他們指出此種塊菌與波奇塊菌、
T. maculatum 等兩種塊菌，在形態上相當類似，但在孢子的彎曲度不同，且子囊比 上述兩種塊菌小很多，子實體的外壁有兩層，孢子形態亦是刺網狀。有趣的是，
Wang 與 He 指出，在會東附近所採集到的四種塊菌（中國塊菌、擬凹孔塊菌、T.
giagansporum 與會東塊菌），孢子形態均為刺網狀。
在台灣，Hu（1992）所發現的塊菌新種－台灣塊菌，依據其菌根與子實體的
特徵觀察後發現，台灣塊菌與黑孢塊菌的形態相類似，因此將台灣塊菌、黑孢塊 菌以及冬塊菌的子實體形態作一比較（表 2），供作分類時的參考。此外，該研究 中也提到，依據塊菌的孢子形態可分成刺狀或網狀兩大類，而子實體的果皮形態 亦可分成兩大類，分別為表面有疣或表面無疣。但是若以子實體果皮顏色來分，
可以分成四大類：Excavatum、Rufum、Puberulum 與 Aestivum，其中前三類屬非黑 色，最後一類則為黑褐色到黑色，台灣塊菌可以明確的分類為孢子網刺狀與 Aestivum 類。此外，冬塊菌也被認為易與台灣塊菌混淆，但是主要可以藉由產孢組 織的菌脈顏色與芳香氣味作出區別（表2）。
表2. 冬塊菌、黑孢塊菌與台灣塊菌的形態區分（引自 Hu, 1992）
Species
difference in brumale melanosporum formosanum
gleba
dark grayish brown to black
dark violet to reddish brown, stained by spore to black
dark brown to black
spore
26-34 x 18-26μm,
vein
young and mature light gray to slightly white, color not changed when exposed to air
young roseate, mature yellow, color changed to red when exposed to air
white only when very
young, mature yellowish brown to light purple, color not changed when exposed to air
odor
aromatic like nutmeg very aromatic slight aromatic
Hu 與 Wang（2005）發現台灣的另一塊菌新種－屑塊菌，研究報告指出，屑 塊菌與大陸的會東塊菌相當類似，但是其子實體果皮顏色較淡，果皮上有頭屑狀 特徵，孢子比會東塊菌大且窄（屑塊菌孢子長度平均1.3～2.3 mm；會東塊菌 1.1
～1.4 mm）。有趣的是，屑塊菌之形態與生育環境條件和會東塊菌相類似，同樣情 形亦發生在台灣塊菌與印度塊菌等大陸黑塊菌上，這樣的結果證明且支持台灣與 大陸間的塊菌，可能有著相同的親緣關係，但是仍需作進一步的分子生物技術分 析方可確認。
一般認為形態研究僅限於種間（interspecific），而無法使用在種內（intraspecific）
的區別，但是Giomaro 等（2000）則使用共軛焦（confocal）顯微鏡，觀察五種不 同品系（1BO、71BO、43BO、17BO 與 10RA）的波奇塊菌，波奇塊菌在接種 Tilia platyphyllos 後，由其所形成菌根之形態與解剖上的特徵發現，五種品系之菌根形 態與菌絲囊狀體（cystidia）均相似而無法區分；但是觀察其菌毯表面及內部菌絲 解剖形態，則可以將五種品系區分出來，分別為菌絲細胞呈多邊形的有 1BO 與 71BO 兩個品系；細扁平狀的有一個品系為 43BO；處於兩者之間的形態者為 17BO 與10RA 兩個品系。
胡弘道與黃鏡諺（2004）則是以青剛櫟接種印度塊菌及台灣塊菌，在形成菌 根後，藉由菌根外部形態與電子顯微鏡技術觀察菌根之微細構造，並比較兩者之 間的區別。該試驗結果得知印度塊菌及台灣塊菌與青剛櫟所形成之菌根特徵歸納 敘述如下：（1）印度塊菌：菌根為單根或不規則羽狀，菌根表面粗糙，菌根顏色 在幼期為淺褐色，成熟期為褐色，老化期為深褐色；菌毯外層為毯狀原形菌絲結 構，內層為規則密實菌絲結構，菌絲表面粗糙有明顯的突紋構造，哈替氏網延伸 菌絲侵入至皮層細胞第三層，有菌絲侵入至皮層細胞第三層，菌毯內層菌絲及哈 替氏網菌絲內有球狀內容物。（2）台灣塊菌：菌根為單根或不規則羽狀，菌根表 面平坦，菌根顏色在幼期為淺褐色，成熟期為金黃色，老化期為黃褐色－深褐色；
菌毯外層為毯狀原形菌絲結構，內層為規則密實菌絲結構，菌絲表面是平滑狀，
哈替氏網延伸菌絲侵入約皮層細胞第二層。此外，胡弘道與黃鏡諺亦以不同化學 試劑進行菌根試劑反應，結果發現印度塊菌（Ti）及台灣塊菌（Tf）菌根元素對化 學試劑反應之明顯差異分別為（1）Ti 之菌根外延伸菌絲與濃硫酸呈紅褐色，與濃 氨水呈淡綠色，與37﹪formalin 呈淺灰色，然 Tf 者與濃硫酸、濃氨水及 37﹪formalin
哈替氏網延伸菌絲侵入約皮層細胞第二層。此外，胡弘道與黃鏡諺亦以不同化學 試劑進行菌根試劑反應，結果發現印度塊菌（Ti）及台灣塊菌（Tf）菌根元素對化 學試劑反應之明顯差異分別為（1）Ti 之菌根外延伸菌絲與濃硫酸呈紅褐色，與濃 氨水呈淡綠色，與37﹪formalin 呈淺灰色，然 Tf 者與濃硫酸、濃氨水及 37﹪formalin