臺灣兩種固有塊菌之親緣關係及溫度對青剛櫟接種塊菌在菌根形成與苗木生長之影響

國立臺灣大學生物資源暨農學院森林環境暨資源學系 博士論文

School of Forestry and Resource Conservation College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Doctoral Dissertation

臺灣兩種固有塊菌之親緣關係及溫度對青 剛櫟接種塊菌在菌根形成與苗木生長之影響

Phylogenetic Relationships of Two Native Taiwan Truffles and Effects of Temperature on the Mycorrhiza Formation and Growth of Cyclobalanopsis glauca (Qerst.) Seedlings

黃鏡諺

Jing-Yang Huang

指導教授：胡弘道 博士、沈偉強 博士 Advisor: Hung-Tao Hu, Ph.D.

Wei-Chiang Shen, Ph.D.

中華民國 98 年 5 月

May, 2009

誌 謝

回首博士班的研究生活，慶幸自己終在學業、工作兩頭忙的日子中熬過來了，

五年半的時間雖不算長，卻是自己三十餘年來最為充實的一段時間。由衷感謝恩 師胡弘道與沈偉強兩位教授，胡老師不僅在學業、論文方向與研究方法等，皆給 予最大的啟迪與教導，更讓我學習到老師待人處世嚴謹的態度；沈老師則在分子 生物技術、SCI 文章撰寫與投稿等，給予莫大的協助、鼓勵與指正，誠如胡老師所 說，博士班求學中最幸運的事情，莫過於認識了沈老師，並能讓沈老師指導，否 則要畢業，SCI 這關不知道還要再花多少年。兩位業師之師恩浩蕩，特誌卷首，謹 誌個人之謝忱於萬一。

本文初稿承蒙宜蘭大學林教授世宗、中興大學顏博士江河、台灣大學曲博士 芳華與中華技術學院胡博士寶元等師長，惠予詳細審閱及逐字斟酌，並且提供諸 多寶貴的修正意見，使論文更臻完備，在此謹對辛苦的您們致上萬分之感激。此 外，在 SCI 英文報告撰寫期間，感謝胡博士哲明在親緣關係演化上的細心指導，

以及繁博士玉萍在分子鐘計算的幫忙，更感謝丁博士照棣在報告Revised 前，熬夜 到半夜三點，將英文報告逐字斧正並提供寶貴的修改意見，使得論文可以順利在 短期內，獲得SCI 期刊收錄並刊登發表。

特別感謝林博士虔隆在統計分析上的指導與幫忙，感謝楊院長平世在博士班 入學考試時，惠予撰寫推薦函。在羅東林區管理處台北工作站工作期間，感謝親 愛的同事陳大為老師、陳華政、簡碧秋、黃群策、杜興東、陳美惠、何家名、高 德璉、張麗慧、林大權、賴錦樑、郭瑞東、江國樑、張家禎、王彥仁、高秀蓮、游 輝毅等的協助與鼓勵。在研究期間，簡光文、詹明勳、劉啟福、張耀聰、林瑞進等學長，

陳秋萍、賴鴻寬、黃子銘、張勵婉等同學，陳珈后、陳怡君、許桂蓮、劉廣宏、劉啟宏、

王綾霙等學弟妹，以及所有關心與愛護我的長輩、朋友們，於修業期間的協助與照顧，因 論文匆促付梓，未能逐一答謝，在此一併致上最深忱之感謝。

感謝老婆微雯這些年來的陪伴與鼓勵，求學期間總把家庭責任先擺一邊，尤 其是愛子衍凱出生後，把小孩照顧的健康又可愛，讓我更能心無旁騖的把學業完 成，辛苦妳了！也謝謝岳父母的支持，感謝您們這段日子幫忙照顧衍凱。

最後，感謝培育、叮嚀我的父母，以及一直鼓勵我的姐姐，由於家人不斷的 付出與包容，方能使我克服所有困難，順利完成博士論文，取得博士學位，在此 謹以本文的成果獻給您們。

黃鏡諺 2009 年 06 月

摘 要

塊菌為珍貴的共生性食用真菌之一，普遍引起世界各地研究學者的興趣。在 台灣，目前僅有台灣塊菌（Tuber formosanum）與屑塊菌（Tuber furfuraceum）被 發現報導，雖然這兩種塊菌的形態特徵已被描述，而缺乏分子鑑定的證據可確立 二者與其他塊菌間的關係。本研究的目的有二，一在利用5.8S-ITS2 與 ß-微管蛋白 質(ß-tubulin)基因序列，建立台灣塊菌及屑塊菌與世界其他塊菌屬種類的親緣關 係 ， 並 以 分 子 鐘 （molecular clock）模式建立台灣與大陸塊菌間之分化時間

（divergence time）；二為利用台灣塊菌及夏塊菌（Tuber aestivum）為材料，探討 塊菌接種青剛櫟後，溫度對於菌根形成、形態、菌根感染率及塊菌接種對青剛櫟 苗木生長之影響。利用5.8S-ITS2 序列建立的親緣演化樹顯示，所分析塊菌屬種類 可分為五個主要的支序群(clade)，台灣塊菌位於第五支序群(clade V)，並與黑孢塊 菌、喜馬拉雅塊菌、印度塊菌、中國塊菌形成第二次支序群(subclade V-2)；屑塊菌 則與會東塊菌、T. ferrugineum、棕紅塊菌、T. candidum、T. quercicola 形成第三支 序群(clade III)。而利用 ß-微管蛋白質基因所建立的親緣演化樹，則得到三個主要 的支序群(clade)，屑塊菌與棕紅塊菌位於第一支序群；第三支序群亦可分成四個次 支序群，台灣塊菌與印度塊菌B 群形成第四次支序群(subclade III-4)，subclade III-1 包括偽凹孔塊菌，subclade III-2 包括黑孢塊菌，subclade III-3 包括印度塊菌 A 群。

親緣分析結果，與各塊菌間的形態特徵大致相符，而台灣塊菌與印度塊菌 B 群最 為親近，屑塊菌則是與會東塊菌最親近。根據分子鐘(molecular clock)推算，台灣 塊菌與印度塊菌B 群的分化時間在 4.1 百萬年(Ma)前，屑塊菌與會東塊菌的分化時 間則在 10.2 百萬年前。基於本研究結果，可以推測台灣的兩種塊菌，應是與大陸 相近的塊菌種類有著共同的祖先，然因為較長的分化時間及地理隔離效應後，進 而演化為台灣特有塊菌種類。

在研究不同溫度對青剛櫟接種台灣塊菌與夏塊菌兩種塊菌在菌根形成與苗木 生長之影響方面，由試驗結果得知，在不同溫度下生長的台灣塊菌及夏塊菌之菌 根，以立體解剖顯微鏡觀察，外部形態並無明顯差異，台灣塊菌菌根呈單根或不 規則羽狀，淡黃色至深褐色，具有或無明顯之剛毛；夏塊菌菌根主要為單根狀，

淡黃色至深褐色，具有羊毛狀之菌絲。進一步以掃描電子顯微鏡觀察菌根，則可

發現在較高溫度的組合（35/30℃、30/25℃）中生長的菌根，其菌毯厚度較薄，結 構較為鬆散，且其皮層細胞內，澱粉粒累積出現之頻率亦較高。台灣塊菌之菌毯 厚 15~25 μm，哈替氏網延伸菌絲可侵入至第二層皮層細胞間；夏塊菌之菌毯厚 18~30 μm，哈替氏網延伸菌絲亦侵入至第二層皮層細胞間。菌根感染率以 25/20℃

為最高，且與其他溫度組呈顯著差異，20/15℃與 30/25℃次之，15/12℃再次之，

35/30℃為最低；兩種菌根感染率在接種處理間，則以台灣塊菌較夏塊菌高，但兩 者間之差異不顯著。苗高方面，各處理均以35/30℃為最高，與其他溫度組呈顯著 差異；不同接種試驗方面，苗高以接種夏塊菌者最高，台灣塊菌次之，未接種者 最低，三者間呈顯著差異。苗木根頸方面，則是以25/20℃最高，35/30℃、30/25℃

與 20/15℃等次之，但四者間之差異呈不顯著，而 15/12℃則最低；根頸以接種台 灣塊菌者最高，夏塊菌次之，兩者差異不顯著，未接種者最差，與有接種者互呈 顯著差異。葉部養分元素方面，在碳、氮、鉀、鈣、鎂、鈉、磷等元素方面，都 是35/30℃者最高，且與其他溫度組合相互呈顯著差異，顯示高溫組合對苗木之生 長與養分元素吸收有利，但對菌根形成是不利的。溫度與菌根感染率呈負相關（r

＝-0.57），溫度與苗高、根頸、及葉部之碳、氮、鉀、鈣與鈉濃度（r＝0.52、0.54、

0.69、0.43、0.51、0.47、0.55），均呈顯著正相關（P<0.05）；菌根感染率與苗高、

根頸、及葉部之鉀、磷濃度（r＝0.49、0.47、0.42、0.67），呈顯著正相關（P<0.05）；

苗高與根頸、葉部之氮、鉀、磷濃度（r＝0.51、0.71、0.46、0.42），呈顯著正相關

（P<0.05）；根頸同樣與葉部之氮、鉀、磷濃度（r＝0.62、0.44、0.47）呈顯著正 相關（P<0.05）；葉部之鉀、鈣與鎂濃度三者之間，則是互呈負相關（r＝-0.48、-0.54、

-0.43）。

關鍵詞：台灣塊菌、屑塊菌、分子親緣分析、分子鐘、青剛櫟、外生菌根、溫度、

養分元素

Abstract

Truffles are one of the most valuable edible fungi that have drawn extensive research interests worldwide. In Taiwan, two species of truffles, Tuber formosanum and T. furfuraceum, have been identified and reported. Although morphological features of these two truffles have been described, lack of molecular identification can firmly establish their relatedness to other truffles. The goals of this study are to: 1) utilize the ITS and β-tubulin gene sequences to generate the phylogenetic relationship and divergence time of T. formosanum and T. furfuraceum with other taxonomic relatives; 2) study the effects of temperature on the mycorrhizae formation and growth of Cyclobalanopsis glauca seedlings inoculated with T. formosanun and T. aestivum.

Our phylogenetic analyses revealed five major phylogenetic clades according to the 5.8S-ITS2 gene sequences and corroborated with their morphological characterization.

In the 5.8S-ITS2 phylogenetic tree, T. formosanum was included in Clade V and T.

furfuraceum was located in Clade III. Clade V was divided into two subclades.

Subclade V-1 was formed by two species, T. brumale and T. pseudoexcavatum, and Subclade V-2 was formed by five species, T. melanosporum, T. himalayense, T. indicum, T. sinense and T. formosanum. Clade III consisted of six species, T. ferrugineum, T.

rufum, T. candidum, T. quercicola, T. furfuraceum and T. huidongense. Based on the β-tubulin gene sequences, three major phylogenetic clades were revealed. Clade I contained two species, T. rufum and T. furfuraceum. Clade III was divided into four subclades. Subclade III-1 and subclade III-2 comprised of T. pseudoexcavatum and T.

melanosporum respectively. Subclade III-3 contained T. indicum A complex. T.

formosanum and T. indicum B complex were located in subclade III-4. In conclusion, T. formosanum highly resembles to T. indicum B complex, while T. furfuraceum is most similar to T. huidongense. Based on molecular clock, we estimated that T. furfuraceum and T. formosanum would have diverged from the close relatives in mainland China between 10.2 and 4.1 Ma, respectively. Taken together, we propose that these two Tuber species found in Taiwan might originate from the common ancestors with some

truffle species in China. However, with long divergence time and geographical separation, they have evolved into indigenous species of Taiwan.

In the second part of this study, we set to determine the effects of temperature on the mycorrhizae formation and growth of Cyclobalanopsis glauca seedlings inoculated with T. formosanun and T. aestivum. No obvious morphological difference was seen in the ectomycorrhizae formed by T. formosanum and T. aestivum with different temperature treatment under stereomicroscope. The ectomycorrhizae formed by T.

formosanum were monopodial or pinnate, and the color was light yellow to dark brown with or without bristles. The ectomycorrhizae formed by T. aestivum were monopodial, and the color was light yellow to dark brown with woolly hyphae. However, futher examination by scanning electron microscope revealed different structures. In the 35/30 ℃ and 30/25 treatment℃ , fungal mantle was thinner and mycorrhizal structure was looser. In addition, the starch grain appeared more frequently in the cortical cells.

The fungal mantle of T. formosanum was 15~25 μm thick, and the Hartig nets extended to the second layer of the cortex cells. The fungal mantle of T. aestivum was 18~30 μm thick, and the Hartig nets also extended to the second layer of the cortex cells. The mycorrhizal infection rate was highest in the 25/20 treatment, which was significantl℃ y different (P<0.05) with other treatments. Treatments with 20/15 and 30/25 were ℃ ℃ second and their mycorrhizal infection rates showed no significantly different (P>0.05).

Treatments with 15/12 and 35/30 showed the lowest infection rate. T℃ ℃ he mycorrhizal infection rate was higher in seedlings inoculated with T. formosanum;

however, the rate was not significantly different (P>0.05) from that inoculated with T.

aestivum. The temperature effect on the height of seedlings was also examined.

Treatment with 35/30 showed highest seedlings, which was significantly different ℃ (P<0.05) from other treatments. Seedlings inoculated mycorrhizae exhibited higher growth than noninfected plants; whereas T. formosanum displayed better growth effects than T. aestivum. Treatment with 25/20 showed best growth in the root collar ℃ diameter of seedlings and treatments with 35/30 , 20/15 and 30/25 were second. ℃ ℃ ℃

However, no significant difference (P>0.05) was seen among these four treatments.

Treatment with 15/12 showed th℃ e worst growth of root collar diameter. Seedlings inoculated mycorrhizae also exhibited better root collar growth than noninfected plants;

whereas T. formosanum also enhanced better root collar growth than T. aestivum, but both treatments showed no significant difference (P>0.05). The concentrations of all macro-nutrient elements in the leaves exhibited the highest level in the 35/30 sample, ℃ which was significantly different (P<0.05) from other treatments. Overall, these results indicate that plants grow faster with higher nutrient contents in the high temperature; however, high temperature displayed negative effects on mycorrhizal development. Temperature exhibited negative relationship with mycorrhizal infection rate (r= -0.57), but showed positive relationships with the height and root collar diameter of seedlings, and the contents of C, N, K, Ca and Na (r= 0.52, 0.54, 0.69, 0.43, 0.51, 0.47, 0.55) in the leaves. As for the mycorrhizal infection rate, it showed positive relationships with the height and root collar diameter of seedlings, and the contents of K and P (r= 0.49, 0.47, 0.42, 0.67) in the leaves. The height of seedlings showed positive relationships with root collar diameter of seedlings, and the contents of N, K and P (r= 0.51, 0.71, 0.46, 0.42) in the leaves and the root collar diameter of seedlings showed positive relationship with the contents of N, K and P (r= 0.62, 0.44, 0.47) in the leaves as well. Finally, K, Ca and Mg showed negative relationships with each other (r= -0.48, -0.54, -0.43).

Key words: Tuber formosanum, Tuber furfuraceum, molecular phylogeny, molecular

目 錄

口試委員會審定書 誌謝

中文摘要………i

英文摘要………..iii

第一章 序言………...1

一、塊菌之介紹………...1

二、塊菌的採收與經濟價值………....2

三、塊菌人工栽培與菌根苗商業化………....4

四、塊菌生長的生態條件………...….5

五、塊菌資源多樣性與地理分布………6

六、本試驗之研究方向………8

七、研究目的……….9

第二章 以內轉錄區間(ITS)、ß-微管蛋白(ß-tubulin)基因進行塊菌之親 緣分析……….10

一、前人研究………..10

（一）塊菌形態特徵鑑定……….10

（二）分子生物技術之應用與發展………..16

（三）內轉錄區間與 ß-微管蛋白基因的特性...18

（四）分子生物鑑定在研究塊菌方面的應用………….……...19

（五）分子鐘模式的建立與分化時間之推估………..25

二、材料與方法………...26

（一）塊菌菌種採集……….26

（二）去氧核糖核酸萃取……….26

（三）聚合酶連鎖反應(PCR, Polymerase Chain Reaction)...28

（四）瓊脂電泳……….29

（五）聚合酵素連鎖反應產物之純化與定序………....29

（六）核酸排序比對與基因資料庫搜尋……….30

（七）分子親緣關係之分析……….30

（八）分子鐘與分化時間之建立……….30

三、結果………...36

（一）台灣塊菌及屑塊菌之 PCR 反應結果……….…..36

（二）台灣塊菌及屑塊菌與其他塊菌菌種之 ITS、ß-微管蛋白基 因序列分析比較………...36

（三）台灣塊菌及屑塊菌與其他塊菌菌種之相同度比較.…...37

（四）台灣塊菌及屑塊菌之 5.8S-ITS2 序列親緣分析………….58

（五）台灣塊菌及屑塊菌之 ß-微管蛋白基因親緣分析………..58

（六）

（七）台灣塊菌及屑塊菌與大陸相關塊菌種間之分化時間的建 立………..…59

四、討論………..64

五、結論………..70

第三章 不同溫度對青剛櫟接種兩種塊菌在菌根形成與苗木生長之 響………...71

一、前人研究………..71

（一）試驗宿主青剛櫟與兩種接種塊菌之介紹………71

（二）溫度對外生菌根菌之影響………72

（三）溫度對外生菌根族群與菌根菌子實體之影響…………75

（四）菌根與苗木生長、葉部養分之關係………79

二、材料與方法………..85

（一）苗木培養………85

（二）生長栽培介質之處理與苗木移植………85

（三）塊菌之接種源……….…...85

（四）青剛櫟與兩種塊菌之半無菌合成………85

（五）立體顯微鏡之觀察………86

（六）掃描電子顯微鏡之觀察………86

（七）塊菌菌根之鑑定………88

（八）菌根感染率之計算………88

（九）苗木養分分析………88

（十）試驗設計與統計分析………89

三、結果……….….90

（一）青剛櫟苗木與兩種塊菌半無菌合成菌根試驗…………90

（二）溫度對苗木菌根形成、苗木生長與葉部大量養分元素之 影響………….………...98

四、討論………..122

（一）青剛櫟苗木與兩種塊菌之半無菌合成……….…..122

（二）溫度對青剛櫟苗木菌根形成、生長與葉片養分之影 響……….….………126

五、結論……….……...133

第五章 塊菌研究之未來展望……….…...…….135

參考文獻………..……….……...136

圖目錄

圖 1. 本試驗採集台灣塊菌與屑塊菌之位置圖………... 27

圖 2. ITS、ß-微管蛋白基因序列與本試驗使用引子位置圖……….... 29

圖 3. 5.8S-ITS2 之序列排列比對………... 38

圖 4. ß-微管蛋白基因之序列排列比對……….. 43

圖 5. Indicum complex ITS 全長度之序列排列比對………..49

圖 6. 31 種塊菌之 5.8S-ITS2 區域，以矩陣推演法演算之演化樹圖譜……….. 61

圖 7. GenBank 資料庫中，所有塊菌屬之 ß-微管蛋白基因，以最大儉約法演 算之演化樹圖譜………. 62

圖 8. indicum complex 之 ITS 全 長 度 ， 以 最 大 儉 約 法 演 算 之 演 化 樹 圖 譜………. 63

圖 9. 台灣塊菌之規則羽狀菌根………. 91

圖 10. 台灣塊菌菌根表面之典型剛毛………. 91

圖 11. 台灣塊菌之老化期菌根………. 91

圖 12. 夏塊菌初期菌根………. 91

圖 13. 夏塊菌菌根表面之典型羊毛狀剛毛………. 91

圖 14. 夏塊菌之老化期菌根，剛毛消失………. 91

圖 15. 在 35/30℃溫度下，台灣塊菌菌根形態……….. 92

圖 16. 在 30/25℃溫度下，典型成熟期台灣塊菌菌根，表面呈金黃色有延伸菌 絲………. 92

圖 17. 在 25/20℃溫度下，台灣塊菌菌根表面延伸菌絲相當明顯………93

圖 18. 在 20/15℃溫度下，成熟期之台灣塊菌菌根呈褐色且有剛毛及延伸菌 絲………. 93

圖 19. 在 15/12℃溫度下，初期之台灣菌菌根表面有明顯剛毛及延伸菌絲且呈 金黃色………. 93

圖 20. 在 35/30℃溫度下，夏塊菌菌根形態，菌根表面平坦………93

圖 21. 在 30/25℃溫度下，典型成熟期夏塊菌菌根………94

圖 22. 在 25/20℃溫度下，成熟期之夏塊菌菌根，單根狀且表面有剛毛………94

圖 23. 在 20/15℃溫度下，初期之夏菌菌根表面有明顯剛毛且呈金黃色………94

圖 24. 在 15/12℃溫度下，初期夏塊菌菌根形態，呈現短棒狀且有剛毛………94

圖 25. 台灣塊菌之超微細結構………... 96

圖 26. 夏塊菌之超微細結構………... 97

圖 27. 各連續月份之菌根感染率在不同溫度處理下之柱狀圖…………... 101

圖 28. 各連續月份之菌根感染率在不同菌種處理下之柱狀圖………. 101

圖 29. 不同溫度下之菌根感染率生長趨勢及其直線迴歸關係………. 102

圖 30. 不同菌種之菌根感染率與接種月份間之變化趨勢………. 103

圖 31. 不同溫度處理與兩種菌種組合之青剛櫟苗木生長情形…..………... 107

圖 32. 各連續月份之苗木苗高在不同溫度處理下之柱狀圖………. 108

圖 33. 各連續月份之苗木苗高在不同菌種處理下之柱狀圖…………... 108

圖 34. 不同溫度下之苗木苗高生長趨勢及其直線迴歸關係………..…………... 109

圖 35. 接種台灣塊菌、夏塊菌與未接種者苗高，在第 5~8 月份之生長趨 勢………... 110

圖 36. 各連續月份之苗木根頸在不同溫度處理下之柱狀圖………. 113

圖 37. 各連續月份之苗木根頸在不同菌種處理下之柱狀圖………. 113

圖 38. 不同溫度下之苗木根頸生長趨勢及其直線迴歸關係………... 114

圖 39. 不同菌種對苗木根頸與接種月份間之變化趨勢………. 115

表目錄

表 1. 主要可食塊菌的種類與栽培研究現況………... 3

表 2. 冬塊菌、黑孢塊菌與台灣塊菌的形態區分………...13

表 3. 本試驗分析所使用之引子………... 28

表 4. 本試驗所使用的塊菌與外群種類………... 31

表 5. 5.8S-ITS2 基因序列，以 Clustal X 1.81 軟體進行兩兩相比的相同度 （identity）分析………... 56

表 6. ß-微管蛋白基因序列之，以 Clustal X 1.81 軟體進行兩兩相比的相同度 （identity）分析………... 57

表 7. 不同溫度處理與不同菌種對菌根感染率在接種後各月份的顯著性分 析………... 100

表 8. 不同溫度處理與不同菌種對苗木苗高在接種後各月份的顯著性分 析... 106

表 9. 不同溫度處理與不同菌種對苗木根頸在接種後各月份的顯著性分 析... 112

表 10. 不同溫度處理與不同菌種對苗木葉片養分濃度在接種 8 個月後的顯 著性分析………... 118

表 11. 不同溫度處理、菌根感染率、苗高、根頸與葉片養分間之相關性……..120

表 12. 菌種、溫度對菌根感染率、苗高、根頸之變異數分析與交感效應…….121

第一章、緒言

一、塊菌之介紹

塊菌（truffles）為塊狀之地下真菌（hypogeous fungi）的通稱，一般專指塊菌 屬（Tuber spp.）的真菌，在分類學上是屬於子囊菌亞門（Ascomycotina）、盤菌綱

（Discomycetes）、塊菌目（Tuberales）、塊菌科（Tuberaceae）、塊菌屬（Tuber）。

塊菌被認為是由子囊盤在地上部之盤菌屬演化而成，經演化後子囊盤向下埋於土 中，且子實層亦向內形成脈狀彎曲，基部亦由有裂片開口逐漸形成整個封閉之堅 實菇體，全埋或半埋於土中約1～20 公分深處（Delmas, 1983）。

在日本稱其子實體為「松露」，中國大陸有稱「土菇」或「無娘果」，在台灣 又稱之為「塊菌」，而英語系國家通稱其為 truffle，是西歐許多國家喜愛的食品，

法國料理則視其與魚子醬、鵝肝醬為同等級，並列為三大食材之一。塊菌因會散 發出特殊而持久之香味，加上富含蛋白質、維生素、礦物質與纖維素等營養價值 而受大眾喜愛（Danell and Eaker, 1992），商業價值舉世矚目；此外，Claus 等（1981）

以黑孢塊菌（Tuber melanosporum）的子囊果（ascocarp）進行營養成分的分析，

發現一種5-androst-16-en-3ol 的化合物，此種化合物可能是雄性酮前體類物質，能 夠引起人的性慾，另外 Claus 等（1981）還發現另一種叫新鞘脂類化合物（new soyasphingosines），這類化合物能參與調節細胞之多種生物學過程，如生物訊息傳 遞、抗原抗體反應等，因此具有某種的藥物功能，能夠調節免疫、並具有保肝的 效用等，此等保健功能也使塊菌更受世界的關注（Claus et al., 1981）。人類對塊菌 的認識最早是由歐洲地中海一帶，西元前350 年的古希臘哲學家 Theophrastus 認為 塊菌的形成是雷擊所造成，之後古羅馬學者Pliny 則表示塊菌的產生是「生物界的 奇蹟」，其認為塊菌能在沒有根系的條件下生長發育，乃是大自然的造化，由此可 反映出當時人們對於塊菌生長現象仍缺乏科學性的認知；直到19 世紀初，Persoon 與 Vittadini 對於幾種塊菌進行詳細的描述後，塊菌才有真正的分類地位，塊菌的 生活史也才逐漸的為人們所接受（陳應龍與弓明欽，2000）。

二、塊菌的採收與經濟價值

塊菌因為人工栽培不易，加上栽培所需時間長等因素，使其價值不斐，相當 珍貴，其中法國的黑孢塊菌、義大利白塊菌（Tuber magnatum）、夏塊菌（Tuber aestivum）、冬塊菌（Tuber brumale）以及勃良第塊菌（Tuber unicinatum）等，均 是商業中相當重要的塊菌種；其中，依據Mello 等（2006）的報告指出，義大利白 塊菌在2004 年時的價錢，大約是每 100 公克 300～400 歐元，價錢相當昂貴。王 曉娥等（2005）針對目前世界上幾種重要的商業塊菌進行初步整理（表 1），提供 研究塊菌的人員參考。塊菌採收目前面臨最大的問題即是產量的減少，過去法國 於19 世紀時，塊菇的自然產量約為 2000 噸，而根據近年來法國的記載，20 年以 來塊菇的產量均僅能維持在每年二十至數十公噸，但是市場上仍有相當高的需求

（Oliver, 2002）。近年來產量相對提高的中國大陸，因印度塊菌（Tuber indicum）、

中國塊菌（Tuber sinense）、擬凹孔塊菌（Tuber pseudoexcavatum）等陸續發現與採 收，使中國大陸的塊菌貿易一度興盛，但由於印度塊菌在外形、顏色等與黑孢塊 菌相似，造成某些不法商人將前者充當後者，藉以牟取暴利，此一情形也引起法 國、義大利等國家一度禁止中國生產的塊菌進口，使中國經營公司與採收農民等 遭受莫大的損失（譚著明與傅紹春，2002）。

塊菌屬於共生菌根真菌，會與林木形成互利共生的關係，子實體的形成必須 仰賴宿主（host）提供碳水化合物為營養來源，且在適當環境下才會形成菇體（Smith and Read, 1997）。塊菌也與世界其他種高經濟價值的菇類一樣，到目前為止，仍然 無法在人工培養基的狀態下產生子實體，唯有與林木共生才能形成，無法像腐生 性（saprobic）真菌一般的栽培子實體。

表1. 主要可食塊菌的種類與栽培研究現況（引自王曉娥等，2005）

塊菌種類 主要產地 常見宿主 子實體型態特徵

人工栽 培現況

黑孢塊菌

法國、義大利、西班 牙

橡樹、榛子樹

近黑色，表面佈有小疣，產孢組 織為黑白相間的大理石條紋狀

商 業 化 生產 夏塊菌

T. aestivum

義大利、匈牙利、中 國北方及西南部

紅 橡 樹 、 黑 白 楊、歐洲角樹

深棕色近黑色，有明顯多角形小 疣，產孢組織為白色

商業化 生產 勃良第塊菌

T. uncinatum

法國、歐洲中部、東 部

橡樹、榛子樹、

櫟樹

黃褐色近黑色，有扁平的小疣，

產孢組織棕色

商業化 生產 義大利白塊菌

T. magnatum

義大利、法國 紅橡樹、黑白楊

灰白色，凹陷無疣，產孢組織白 色至灰黃色，具白色紋路

商 業 化 生產 冬塊菌

T. brumale

義大利、法國、荷蘭 榛子樹、櫟樹

黃褐色，有扁平小疣，產孢組織 白至灰色

正 在 研 究中 波奇塊菌

T. borchii

法國、義大利、中國 四川、雲南

橡樹、榛子樹

棕黃色，較平坦無疣狀突起，產 孢組織棕黃色

開 始 人 工培養 印度塊菌

T. indicum

中國雲南、四川攀枝 花

雲南松、麻櫟、

土瓜、馬桑

深棕黑色，有明顯小疣，產孢組 織為黑白相間的大理石條紋狀

正在研 究中

中國塊菌

中國四川、貴州高原

雲 南 松 、 華 山 松、櫟樹、水紅 木

褐色至深褐色，外表佈小疣，產 孢組織灰白色

正在研 究中

喜馬拉雅塊菌

喜馬拉雅山區

雲 南 松 、 華 山 松、櫟樹

灰色，有扁平小疣，產孢組織灰 白色

正 在 研 究中 台灣塊菌

T. formosanum

台灣 青剛櫟

深棕黑色，有較明顯小疣，產孢 組織為暗褐－黑，白至紫色菌脈

開 始 人

工培養

在法國、義大利、西班牙、紐西蘭與澳大利亞等國家，通常是訓練豬或狗來 尋找塊菌，不僅效率高，而且不會破壞菌根區域，對於產量比較不會有太大的影 響。由於塊菌的高經濟價值，使世界各地的研究人員積極研究塊菌的人工馴化與 栽培技術，法國、義大利等國家於1970 年代，即積極發展塊菌的人工栽培研究，

並有一定的研究成果，其中，法國最早實現了塊菌苗商業化生產，為菌根食用菌 人工栽培提供了良好的典範（陳應龍，2000）。

三、塊菌人工栽培與菌根苗商業化

塊菌與大多數菌根菌一樣，對於宿主樹種有較強的選擇性與專一性，並且在 苗木時期即有所表現，因此，選擇適宜的宿主進行接種，不僅是菌根苗生產的前 提，也是塊菌栽培成敗的關鍵（陳應龍，2000）。塊菌菌根化苗木的生產通常是要 採用透氣性良好、質地鬆軟的混合性基質，並且要經過高溫高壓滅菌消毒，以減 少其他土壤中的共生真菌競爭性影響。基質的理化特性對塊菌的菌根合成亦有著 顯著的影響，包括土壤的pH 値、碳/氮比、CaCO3等。Dupre 等（1982）曾以土壤、

蛭石、泥炭土與珍珠石等不同基質以及土壤不同氮、磷含量等因素，進行黑孢塊 菌的菌根合成影響試驗，結果發現以泥炭土及蛭石為基質最有利菌根形成，其次 為珍珠石，效果最差的則為林地表土土壤。

目前，一般塊菌菌根化苗木生產所使用的接種源，主要多為子囊孢子，一般 不採用純培養的菌絲體；接種源多為自野外採集或於市場購買塊菌子實體，經打 碎、過篩後，加入無菌水即製成孢子懸浮液，此種孢子懸浮液在低溫條件下，可 以保存1 年以上，苗木接種菌根菌後，則需在苗圃中培育約 1～2 年，即可移植至 野外出栽。另外，菌根苗通常需採用特殊的柱形育苗容器，這種容器有利於根系 的發展，而菌根苗如適當的修剪，亦可使幼根密集分支，提高菌根感染率；適宜 的水分除有利宿主根系發展外，亦可減少土壤有害微生物，促進塊菌菌根的合成

（Bardet et al., 1996）。Giovannetti 與 Fontana（1982）的研究則表示適度的施肥策 略，對於塊菌的產量、菌根感染情形均有顯著的效益。

法國農業科學研究院（French National Institute for Agricultural Research, INRA）

在 1971 年建立了第一個塊菌菌根化苗圃，並且也是商業菌根苗的認證與檢測機 構，所有出售的塊菌菌根苗，均需通過其檢測與認證，只有菌根感染率符合其標 準，且沒有其他非目標共生菌根感染的塊菌苗，才能對外販售，目前約有三十多 種不同塊菌與樹種組合的菌根苗上市販賣（陳應龍，2000）。在台灣，Hu 等（2005）

於1987 年使用台灣塊菌的孢子懸浮液，接種青剛櫟（Cyclobalanopsis glauca）並 形成良好菌根後，先置於溫室培養兩年，之後選取感染率高之 150 株健壯苗木，

於1989 年出栽至台大實驗林，期間施予每公頃 3,000 公斤的 CaCO3: MgCO3（1 : 1 mol/mol），藉以修正土壤的酸鹼度，使適合台灣塊菌的生長；結果於 1996 年成功 開始採收台灣塊菌，於 1997 年間收穫約 10 公斤的台灣塊菌，最大的直徑可達 9

～10 公分，重量 350 公克；這是台灣塊菌菌根人工化栽培的先例。

四、塊菌生長的生態條件

天然塊菌主要分布於北溫帶和寒帶地區，其他地區分布則較少，這表示塊菌 的分布與氣候條件有著一定的關係。例如，黑孢塊菌分布約在北緯 40 度至 47 度 之間。海拔約100～1,000 公尺，而且 Plattner 與 Hall（1995）表示，黑孢塊菌的最 適宜氣候條件為：年降雨量600～1,500 mm，夏季日均溫 16.5～22 ℃（7 月），冬 季日均溫1～8 ℃。此外，Plattner 與 Hall 亦發現，塊菌的生長有著一定的方位性，

在法國東南部的Marseilles 沿海一帶，塊菌生長在較冷的西北向坡面上，這樣可以 阻隔乾燥南風的影響；同樣的在Haute 省，塊菌則多發生在西南向坡面上，這樣可 使其免受寒冷北風的侵襲。此外，坡度亦是影響塊菌生長的因素之一，在法國，

黑孢塊菌產量最高的區域，通常是坡度、起伏較小的林地，坡度一般不超過5 度，

這種坡度比較不會發生土壤流失與侵蝕的現象，有利塊菌生長；然而義大利中部 有一些區域，於塊菌種植園的斜坡上，挖掘出層層的階段，藉以減緩土壤的侵蝕，

對塊菌的產量亦有所幫助（陳應龍，2000）。

2.土壤條件

塊菌對於土壤條件要求嚴苛，在自然條件下，多生長在石灰質土壤中，鈣質 頁岩為其生活的典型土壤結構，Barry 等（1994）表示，土壤的 pH 值為 7.9 時，

最適宜塊菌的生長與發育；而除土壤酸鹼度外，表土組成結構與礦質營養也會影 響塊菌的生長，例如具有較高的微孔性與低體積密度的土壤有利於塊菌生長，而 表土抗沖蝕能力、質地、有機物、腐植層類型、根際結構、通氣狀況、水分滲透 等，對於塊菌菌根共生體系的建立，也有一定的影響。

3.宿主範圍

塊菌在自然的條件下，通常可以與櫟（Quercus）、榛（Corylus）、鐵木（Ostrya）、 鵝耳櫪（Carpinus）、椴（Tilia）、楊（Populus）、柳（Salix）、赤楊（Alnus）、水青 岡（Fagus）、栗（Castanea）、松（Pinus）、雪松（Cedrus）、冷杉（Abies）、胡桃

（Juglans）等屬的樹木形成菌根（陳應龍，2000）。另外有研究指出，在西藏地區 發現杜鵑（Rhododendron spp.）林下發現有塊菌共生的情形（徐阿生，1999）；而 Giovannetti 與 Fontana（1982）則以半日花科的灌木（Cistus spp.），成功的合成了 六種塊菌並形成菌根，因此可知塊菌的宿主並不僅限於較為人常知的幾種樹種。

五、塊菌資源多樣性與地理分布

目前在世界上，Tuber 屬約有 140 種與 65 個亞種，然而，曾被有效且正確的 描述之種約有70～75 個（Hawksworth et al., 1995；Bougher and Lebel, 2001），其 中，中國大陸約有26 種（陳應龍與弓明欽，2000），台灣則有兩種。

1.歐洲地區

歐洲地區是塊菌的主要發祥地，全球約有 80％以上的塊菌種類分布於此，而 且歐洲的一些國家，不僅成為全球商業塊菌及其初級產品的生產與集散地，更是 塊菌的重要消費國，全球約有 95％的塊菌都在歐洲交易後成為當地人們的美味佳 餚。在法國，以黑色金剛鑽的黑孢塊菌最有名，最初是發現於法國波爾多（Bordeaux）

東部的Périgord 省石灰岩高原地，因此「Périgord truffle」成為黑孢塊菌的代名詞，

Périgord 市也因出產黑孢塊菌而被喻為世界塊菌之都。在法國，還有白塊菌、勃良 第塊菌、冬塊菌、中果塊菌（Tuber mesentericum）與大孢塊菌（Tuber macrosporum）

等，都是分佈較廣且有商業價值的塊菌（Meotto et al., 1995）。

義大利也是黑孢塊菌的另一出產大國，在義大利的北部與中部，如 Marche、

Piedmonte、Umbria 等地區，義大利白塊菌亦是另一重要商業塊菌，主要分布在 Piedmonte、Umbria 與 Tuscany 等地區，除了上述兩種最大產量的塊菌外，還有夏 塊菌、冬塊菌、中果塊菌、T. albidum、T. moschatum 等（Fanelli, 1998）。此外，匈 牙利與西班牙也有多種塊菌分布，如黑孢塊菌、凹孔塊菌（Tuber excavatum）、夏 塊菌、棕紅塊菌（Tuber rufum）、波奇塊菌與 T. foetidum 等。

2.中國地區

塊菌在中國主要分布於西南的四川與雲南，西北的新疆和西藏等地，而山西、

陜西、遼寧、吉林及福建等省份也都陸續發現有塊菌的分布；中國地區最早發現 的 塊 菌 種 類 ， 即 是 印 度 塊 菌 ， 之 後 又 有 中 國 塊 菌 、 喜 馬 拉 雅 塊 菌 （Tuber himalayense）、凹孔塊菌、擬凹孔塊菌、偽喜馬拉雅塊菌（Tuber pseudohimalayense）、 遼東塊菌（Tuber liaotongense）、天山塊菌（Tuber tianshanese）、陀孢塊菌（Tuber turbinatosporum）及會東塊菌（Tuber huidongense）等，其中有許多新發現的塊菌 菌種，對於其相關的分類問題與確切分布狀態，仍然有待深入之研究（陳應龍與 弓明欽，2000）。

3.其他區域

在美國的喬治亞州，則有德州塊菌（Tuber texense）的發現，而在奧勒岡州，

則有兩種主要塊菌，即奧勒岡白塊菌（Tuber oregonese）與 T. gibbosum 的分布，

此二種塊菌亦為美洲最主要的商業塊菌。在南半球的紐西蘭與澳大利亞，也都有 塊菌的分布，例如Chu-Chou 與 Grace（1981）在花旗松（Pseudotsuga menziesii）

林下採集到一種未定名的塊菌（Tuber sp.），以及歇爾氏塊菌（Tuber shearii）。

4.台灣地區

台灣地區至目前為止發現了兩種塊菌菌種的分布，Hu（1992）在 1987 年於台 灣省南投縣東埔地區，海拔約1,300 公尺的青剛櫟天然林分下，採集到了一種形態 與黑孢塊菌相似的子囊果，經過以電子顯微鏡將孢子與產孢組織等作詳細觀察 後，確定為新種，並命名為台灣塊菌（Tuber formosanum）。之後，Hu 與 Wang（2005）

於台大實驗林和社營林區之青剛櫟根圈附近，又發現了一種褐色的塊菌子囊果，

經過觀察比對孢子形態及產孢組織等發現，與大陸發現的會東塊菌等相當類似，

但子實體的外部形態略有不同，因果皮表面有頭屑狀特徵，故命名為屑塊菌（Tuber furfuraceum）。

六、本試驗之研究方向

目前台灣對於塊菌之研究，除已發表兩種新種外，也成功以人工合成方法栽 培出塊菇子實體（Hu et al., 2005），然而每一種菌根菌皆有其最適生長之環境與各 自之較佳忍受性與功能，例如彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）可耐較高溫（Marx, 1973），有菌索之菌根菌可增加根系之耐旱力（Bowen, 1973），並有助於養分吸收

（胡弘道等，1999）。因此，若比較此兩種菌根菌在同一介質下對宿主林木生長及 養分吸收之影響，與不同溫度下對菌根化育產生之效益，將可作為日後選擇接種 源之依據，尤其以溫度不同時所產生之變化，將可以預知各菌種之適應力。菌根 的質與量對苗木之生長與養分吸收影響甚大（Marx et al., 1989），而菌根的質與量 又受溫度影響最大，故本研究即基於溫度作為首要考慮。

外生菌根分類原本是仰賴傳統的外部形態觀察（Agerer, 1995），然而傳統的形 態學鑑定方法，常因環境和地理條件等因素的影響而發生分歧，塊菌的分類原本 多是利用子實體的外觀與孢子形態來進行，然而此一方式容易有所爭議（Ceruti et al., 2003），因此最近年來以分子生物技術如 PCR、RFLP、RAPD 等，來進行菌根 之分類，以技術方面來講不僅日新月異，以分類來講更是提供更精確的結果（王 曉娥與姚方杰，2006）。台灣塊菌與屑塊菌是目前台灣已發表的兩種塊菌，因此利 用PCR 技術分析台灣塊菌與屑塊菌，兩種台灣特有且瀕臨滅絕的塊菌菌種，與世

界其他各種塊菌間，在rDNA 內轉錄區間（internal transcribed spacer）、ß-微管蛋白

（ß-tubulin）基因之差異，並進行親緣關係分析，將有助於確定台灣塊菌與屑塊菌 之分類地位。

七、研究目的

本研究之目的為（1）比較台灣塊菌、屑塊菌及世界其他塊菌屬在以 5.8S-ITS2 以及ß-微管蛋白基因的親緣關係比較；（2）以分子鐘（molecular clock）模式建立 台灣與大陸塊菌間之分化時間（divergence time）；（3）確定溫度對台灣塊菌及夏塊 菌接種青剛櫟後，菌根形成、形態、菌根感染率之影響；（4）確定溫度對青剛櫟 苗木接種台灣塊菌及夏塊菌生長之影響。

第二章、以內轉錄區間（ITS）、ß-微管蛋白

（ß-tubulin）基因進行塊菌之親緣分析

一、前人研究

（一）塊菌形態特徵鑑定

菌根的分類向來是研究菌根最基礎工作，菌種種類繁多卻無有規則的菌根形 態特徵可供分類時，則會產生相互間不易比較差異且混亂之情形，因此，為了進 一步瞭解林木－真菌間的關係，作好菌根分類確有其必要性。胡弘道（1990）指 出，基於四種研究需求而須針對菌根進行分類：（1）生理研究－因真菌種間之生 理特徵不同，故菌種能改變菌根之生理與形態，並間接影響林木生理之行為；（2）

病理研究－菌根因有菌毯形成機械障礙、分泌抗生素以及避免根吸收土壤毒素等 因素，因而有抗病之機制；（3）生態研究－針對暸解外生菌根之地理分布與其在 自然環境中季節變化等關係；（4）研究結果之應用－目前菌根接種仍少應用在苗 圃及森林之原因，即是因為分類不全之故，若分類健全，則對接種或野外之菌根 型，自能預知其功用。

傳統之外生菌根分類及形態特徵研究，是以光學顯微鏡為基礎，進行菌根或 子實體表面觀察，但是如菌毯菌絲表面之微細差異，只靠光學顯微鏡之觀察是無 法分辨的，因此利用電子顯微鏡技術來觀察菌根之微細構造，給予菌根鑑定、分 類等提出更可靠之方法（Massicotte et al., 1987）。其他如利用不同化學試劑進行菌 根試劑反應、細胞化學的利用與其他染色技術等，都可以增加顯微鏡在區別鑑定 菌根之效率（胡弘道，1990）。描述新發表的塊菌菌種時，也多藉由上述幾種方法，

塊菌的形態特徵描述，可以從兩大方向來作觀察，第一種為進行肉眼可觀察到的 宏觀特徵（macroscopic character），另外一種則是以電子顯微鏡進行微觀特徵

（microscopic character）。宏觀特徵如塊菌子實體的外形、果皮形態是否具疣

（warts）、基部有無凹孔、果肉顏色、產孢組織之菌脈特徵等作簡單的區分，而微

觀特徵則是針對孢子構造、孢子飾紋（spore ornamentation）、孢子在子囊內的排列、

菌絲形態等，作為分類的依據，依據孢子形態更可將塊菌細分為兩大類，一為具 刺狀（spines），另一種則為蜂巢網狀（reticulata）（Trappe, 1979）。

最先進行塊菌菌根的外部形態描述為Fontana 與 Palenzona（1979），他們是以 義大利白塊菌接種毛櫟（Quercus pubescens）後，以顯微鏡觀察塊菌菌根並描述特 徵，之後有許多研究者（Fontana et al., 1990；Zambonelli et al., 1993）也以苗木接 種塊菌，在形成菌根後，進行形態上的描述。Comandini 與 Pacioni（1997）則是 首先針對兩種形態相類似的塊菌，進行詳細比對形態的研究人員，他們指出兩種 亞洲塊菌－印度塊菌與喜馬拉雅塊菌，均與在歐洲有黑色金剛鑽（black diamond）

之稱的黑孢塊菌有著相類似的外形，此二種亞洲塊菌於1993 年引進歐洲後，即有 許多商人因為他們的價錢較低，而將亞洲塊菌的菌根苗以黑孢塊菌的菌根苗名義 出售，造成歐洲地方性塊菌族群受到生物性污染（biopollution）的風險，有鑑於此，

他們針對此二種亞洲塊菌的菌根形態作詳細的描述與比較。試驗結果發現，以菌 根的外部形態來講，兩者之間非常相近，僅可藉由菌毯最外層的部分作區別，喜 馬拉雅塊菌的菌毯表面相當明顯，菌絲大多為同種形式且菌絲細胞皆有相似的形 狀與大小；印度塊菌的菌毯表面結構異質性相當高，菌絲通常由四邊形或形狀不 規則的細胞所組成，且菌絲細胞間隙比較大。此外，Zhang 與 Minter（1988）的研 究指出，印度塊菌的孢子屬於刺狀，喜馬拉雅塊菌的孢子則為網狀，但是研究中 卻發現，印度塊菌與喜馬拉雅塊菌，均可發現同時有兩種孢子存在於同一子囊的 情形，因此，以形態來觀察兩種亞洲塊菌的方法至今仍存在許多爭議。

Halász 等（2005）以外觀形態法進行歐洲白塊菌之分類，他們使用子實體外 部形態（平滑或具疣狀突起）、子囊盤（excipulum）外部特徵、表皮囊狀體

（dermatocystidia）、孢子大小、每一個子囊內的孢子數目等五種特徵進行分類，結 果成功的將歐洲白塊菌分成五大類，分別為波奇塊菌、T. foetidum、T. maculatum、

T. puberulum、T. rapaeodorum。而 Halász 等更表示，在他們所研究的塊菌屬中，

表皮囊狀體與子囊盤外部特徵為相當可信賴的分類特徵，然而表皮囊狀體卻在塊 菌老化時，會有分解（collapse）與消失的情形（Mello et al., 2000）。此外，Halász 等也針對塊菌形態會因外在環境條件而改變的特性作出建議，他們認為如果要以 形態來分類，應該要在各種子實體形成的過程中，針對氣候因子作控制，以減少 環境的干擾。

Moreno 等（1997）則是在進口自亞洲的喜馬拉雅塊菌中，發現有一些在形態 上與傳統的喜馬拉雅塊菌略有不同的新種，因此將其命名為偽喜馬拉雅塊菌，他 們也是以孢子與子實體的形態來作區別，結果發現，偽喜馬拉雅塊菌的孢子有一 種獨特的特徵，即是網刺狀孢子（reticulated-spiny），而且其孢子壁較其他種塊菌 薄，子實體顏色與喜馬拉雅塊菌比較起來呈較偏暗褐色；然而此一塊菌菌種若以 子實體外部形態來觀察，與喜馬拉雅塊菌、印度快菌、黑孢塊菌與T. spinoreticulatum 等四種塊菌容易混淆。

Wang 等（1998）從中國四川地區的雲南松林下發現另一塊菌新種－擬凹孔塊 菌，擬凹孔塊菌的最大特徵即是具有褐色的子實體，呈現橢圓狀，且果皮有很深 的孔（deeply excavate），每一個子囊內具有1～8 個孢子，孢子形態呈刺網狀。Wang 等指出，世界上主要的有孔塊菌原為兩種，一為凹孔塊菌，另一則為中果塊菌，

擬凹孔塊菌為第三種發現的有孔塊菌，三者之間明顯差異為，凹孔塊菌具有較平 滑的子實體果皮，每一子囊有3～5 個孢子，孢子的形態為網狀不具刺；中果塊菌 的子實體則呈暗黑色，每一子囊內有一個孢子，但孢子形態亦為網狀不具刺。Wang 與He（2002）則發現另一新種，稱之為會東塊菌，他們指出此種塊菌與波奇塊菌、

T. maculatum 等兩種塊菌，在形態上相當類似，但在孢子的彎曲度不同，且子囊比 上述兩種塊菌小很多，子實體的外壁有兩層，孢子形態亦是刺網狀。有趣的是，

Wang 與 He 指出，在會東附近所採集到的四種塊菌（中國塊菌、擬凹孔塊菌、T.

giagansporum 與會東塊菌），孢子形態均為刺網狀。

在台灣，Hu（1992）所發現的塊菌新種－台灣塊菌，依據其菌根與子實體的

特徵觀察後發現，台灣塊菌與黑孢塊菌的形態相類似，因此將台灣塊菌、黑孢塊 菌以及冬塊菌的子實體形態作一比較（表 2），供作分類時的參考。此外，該研究 中也提到，依據塊菌的孢子形態可分成刺狀或網狀兩大類，而子實體的果皮形態 亦可分成兩大類，分別為表面有疣或表面無疣。但是若以子實體果皮顏色來分，

可以分成四大類：Excavatum、Rufum、Puberulum 與 Aestivum，其中前三類屬非黑 色，最後一類則為黑褐色到黑色，台灣塊菌可以明確的分類為孢子網刺狀與 Aestivum 類。此外，冬塊菌也被認為易與台灣塊菌混淆，但是主要可以藉由產孢組 織的菌脈顏色與芳香氣味作出區別（表2）。

表2. 冬塊菌、黑孢塊菌與台灣塊菌的形態區分（引自 Hu, 1992）

Species

difference in brumale melanosporum formosanum

gleba

dark grayish brown to black

dark violet to reddish brown, stained by spore to black

dark brown to black

spore

26-34 x 18-26μm,

20-30 x 15-20μm, 21-42 x 17-28μm

27-35 x 21-28μm, 40-55 x 22-33μm, 29-55 x 22-35μm

12-35 x 10-18μm

vein

young and mature light gray to slightly white, color not changed when exposed to air

young roseate, mature yellow, color changed to red when exposed to air

white only when very

young, mature yellowish brown to light purple, color not changed when exposed to air

odor

aromatic like nutmeg very aromatic slight aromatic

Hu 與 Wang（2005）發現台灣的另一塊菌新種－屑塊菌，研究報告指出，屑 塊菌與大陸的會東塊菌相當類似，但是其子實體果皮顏色較淡，果皮上有頭屑狀 特徵，孢子比會東塊菌大且窄（屑塊菌孢子長度平均1.3～2.3 mm；會東塊菌 1.1

～1.4 mm）。有趣的是，屑塊菌之形態與生育環境條件和會東塊菌相類似，同樣情 形亦發生在台灣塊菌與印度塊菌等大陸黑塊菌上，這樣的結果證明且支持台灣與 大陸間的塊菌，可能有著相同的親緣關係，但是仍需作進一步的分子生物技術分 析方可確認。

一般認為形態研究僅限於種間（interspecific），而無法使用在種內（intraspecific）

的區別，但是Giomaro 等（2000）則使用共軛焦（confocal）顯微鏡，觀察五種不 同品系（1BO、71BO、43BO、17BO 與 10RA）的波奇塊菌，波奇塊菌在接種 Tilia platyphyllos 後，由其所形成菌根之形態與解剖上的特徵發現，五種品系之菌根形 態與菌絲囊狀體（cystidia）均相似而無法區分；但是觀察其菌毯表面及內部菌絲 解剖形態，則可以將五種品系區分出來，分別為菌絲細胞呈多邊形的有 1BO 與 71BO 兩個品系；細扁平狀的有一個品系為 43BO；處於兩者之間的形態者為 17BO 與10RA 兩個品系。

胡弘道與黃鏡諺（2004）則是以青剛櫟接種印度塊菌及台灣塊菌，在形成菌 根後，藉由菌根外部形態與電子顯微鏡技術觀察菌根之微細構造，並比較兩者之 間的區別。該試驗結果得知印度塊菌及台灣塊菌與青剛櫟所形成之菌根特徵歸納 敘述如下：（1）印度塊菌：菌根為單根或不規則羽狀，菌根表面粗糙，菌根顏色 在幼期為淺褐色，成熟期為褐色，老化期為深褐色；菌毯外層為毯狀原形菌絲結 構，內層為規則密實菌絲結構，菌絲表面粗糙有明顯的突紋構造，哈替氏網延伸 菌絲侵入至皮層細胞第三層，有菌絲侵入至皮層細胞第三層，菌毯內層菌絲及哈 替氏網菌絲內有球狀內容物。（2）台灣塊菌：菌根為單根或不規則羽狀，菌根表 面平坦，菌根顏色在幼期為淺褐色，成熟期為金黃色，老化期為黃褐色－深褐色；

菌毯外層為毯狀原形菌絲結構，內層為規則密實菌絲結構，菌絲表面是平滑狀，

哈替氏網延伸菌絲侵入約皮層細胞第二層。此外，胡弘道與黃鏡諺亦以不同化學 試劑進行菌根試劑反應，結果發現印度塊菌（Ti）及台灣塊菌（Tf）菌根元素對化 學試劑反應之明顯差異分別為（1）Ti 之菌根外延伸菌絲與濃硫酸呈紅褐色，與濃 氨水呈淡綠色，與37﹪formalin 呈淺灰色，然 Tf 者與濃硫酸、濃氨水及 37﹪formalin 皆不變色；（2）Ti 之菌毯與 10﹪FeSO4溶液呈深褐色，Tf 者呈深綠色；（3）Ti 之 哈替氏網與10﹪FeSO4溶液呈淺藍色，與Tf 者則是綠色；（4）Ti 之哈替氏網與濃 氨水呈綠色，然Tf 者則呈深褐色。

最近幾年以形態學來分類的技術，因科技的進步有所突破，例如以電腦數值 化的方法、資料庫整理、套裝統計軟體運用，以及自動影像分析、電子粒子大小 等等，均可提供在形態上的分析運用（陳怡君，2004）。DELTA（Description Language for Taxonomy）為一套可供查詢各種不同塊菌之所有鑑定資料庫，主要是將十八種 已被描述之塊菌形態特徵，包括宏觀與微觀特徵、菌根形態、子實體描述、孢子 形態、原產地、宿主、生態特性與該種類的DNA 序列等，屬於可描述的特性全部 輸入建檔，結合可供上網查詢與下載的方式供研究人員利用。此外，還提供許多 塊菌在電子顯微鏡下之照片，或是利用手繪圖解外觀的方式作為輔助參考，並結 合許多搜尋的功能，例如可以單一或重複輸入某種特徵，即可找出具有此種特徵 之所有可能的塊菌種類。而且還有交叉比對的功能，如果欲找出兩種不同塊菌之 差異性，則將該兩種塊菌進行交叉分析後，即可出現兩種塊菌間，所有特徵上的 差異（Zambonelli et al., 2000）。

雖然塊菌以孢子、子實體與菌根等形態作分類，可以鑑定與分類出不少種類，

然受限於環境因子可能產生之差異，以及人為判斷錯誤等因素而導致誤判，另一 方面，常會有不同種菌根卻因外部形態過於相似，而將其歸納為同一種之情形：

因此許多學者仍舊對形態分類方式有著爭論（Riousset et al, 2001；Ceruti et al., 2003；Wang et al., 2006a）。隨著分子生物技術開發，而有新興鑑定模式的發展，

從分子生物的層次配合傳統分類形態鑑定，來探討分類演化關係，將能提供另一

項更佳的分類參考依據。

（二）分子生物技術之應用與發展

近年來，分子生物技術如雨後春筍般的蓬勃發展，例如：同功異構脢（isozyme）

圖譜（Marlatt et al., 1996）、脈衝電泳（pulsed field gel electrophoresis, PFGE）染色 體多形性DNA 分析（Segal et al., 1992）、南方雜合反應（Southern blot hybridization）

（Lee et al., 1993 ）、 限 制 片 段 長 度 多 形 性 圖 譜 （ restriction fragment length polymorphism, RFLP）（Gardes et al., 1990）、隨機增幅核酸多形性圖譜（random amplified polymorphic DNA, RAPD）（Warburton et al., 1996）、聚合酶連鎖反應

（Polymerase chain reaction, PCR）（Young et al., 2002）等，其中，最常使用在真菌 分類鑑定的方法為後四種。

（1）南方雜合分析

南方雜合分析是利用 ITS 序列設計核酸探針進行雜合分析，藉此可以分析真 菌菌種間之差異，其所需的核酸濃度約為0.1～1 ng。雖然南方雜合分析可以同時 檢測許多樣本，但是相對地步驟繁雜、耗時、費用高，且有時會有非專一性反應 的問題發生，靈敏度也多半較低，目前侷限於實驗室以純量DNA 層次作測試，極 少延伸至田間進行實務檢測的應用（Martin et al., 2002）。

（2）限制片段長度多形性圖譜

限制酶具有切割雙股 DNA 的活性，能夠辨識一段特定核酸序列並予以切割，

產生各種大小的 DNA 片段。由於不同生物個體其染色體上限制酶切位之分佈情 形 ， 以 限 制 酶 切 割 後 產 生 的 核 酸 片 段 會 有 差 異 ， 與 此 DNA 片 段 作 雜 合

（hybridization）後，經自動顯影（autoradiography）可在 X 光底片上看到不同分 子量之DNA 片段，檢定個體間的遺傳變異；然而進行 RFLP 分析時，要特別慎重，

因為RFLP 是對不同大小的 DNA 片段進行分析，故對於帶有不同的核酸序列卻具 有相近大小的DNA 片段，用電泳的方法是不易區分開的（弓明欽等，1997）。

（3）隨機增幅核酸多形性圖譜

RAPD 是應用一任意設計約 10 個核苷酸左右的引子（arbitrarily-designed primer），與欲鑑識樣品之核酸，以較低之黏合溫度（annealing temperature）條件 下進行聚合酶連鎖反應，可以產生高度多形性 PCR 產物，所以 RAPD 又稱之為 Arbitrarily primed-PCR（AP-PCR）（Paavanen-Huhtala et al., 1999）。利用 RAPD 分 析遺傳變異的特性有四：（1）無須解序的資訊即可設計引子；（2）不必經過選殖 序列或放射性的探針；（3）經由設計引子偵測不等程度的變異；（4）可以應用於 大量分離株與可分析一個位點以上之差異性（Paavanen-Huhtala et al., 1999）。

（4）聚合酶連鎖反應

PCR 反應的檢測流程有簡便、靈敏且快速等優點，利用 PCR 大量增幅 DNA 的技術，配合一些後續分析技術之應用，已蔚為分子檢測的發展主流（黃麗君，

2003）。最常利用的檢測方法，就是藉由專一性引子對的設計，進行PCR 擴增反應，

產物則由瓊脂膠體電泳進行分析來做檢測（Schubert et al., 1999），而 PCR 試驗則 已 廣 泛 應 用 於 實 務 檢 測 的 工 作 。PCR 的基本循環反應分為三個階段：變性

（denaturation），使雙股 DNA 分開變成單股；黏合（annealing），引子黏合至模版 DNA 上序列與其鹽基互補之片段，操作溫度視需求而有所不同，一般溫度介於 37

～60℃間；延長（extension），以聚合酶之作用形成互補之目標 DNA。

此外，PCR 還有一些改良的方法，例如 Nested-PCR、Multiplex-PCR、PCR-ELSA 技術等，可以使整個分析流程更加便利與迅速，並可增加分析時的靈敏度與專一 性（Bailey et al., 2002）。近年來，定量 PCR（real time PCR）在微生物檢測方面也 有相當多的應用（Weller et al., 2000），可以在進行 PCR 時，同步偵測原始 DNA 量，並且省去膠體電泳分析的步驟，簡便且靈敏度高，但相對成本也較高。

（三）內轉錄區間與 ß-微管蛋白基因的特性

近年來越來越多的研究，傾向以分子生物學的方法，來解決形態分類無法解 決的問題，PCR 即提供了快速且特異性高的診斷方式。核酸為所有生物的遺傳物 質，在所有現存的生物體中，rDNA、ß-微管蛋白基因等都具有相同的遺傳功能，

由此可知在演化發生之前，核醣核酸基因即已存在於生物體內，在演化上是高度 保留的基因（Blaxter et al., 1998），因此這些基因片段適用於親緣關係分析的研究 上。

利用rDNA 來作為分類的依據，已經被許多分類學者廣泛應用，rDNA 因為具 有下面特性：（1）普遍存在於所有生物細胞內；（2）DNA 片段長度適中；（3）具 高重複數（high copy number），在生物體內有數百到數千個重複的特性，所以極適 合用於分子層次的研究（徐希世，2006）。此外，rDNA 中有保守性較高的編碼區

（coding regions），也有變異性高的間隔區（spacer regions），在真核細胞中，一個 轉錄單位（transcribed unit）主要是由小的次單位核醣體 DNA（small subunit ribosomal DNA, 18S）、ITS1（internal transcribed spacer 1）、5.8S rDNA、ITS2（internal transcribed spacer 2），與大的次單位核醣體DNA（large subunit ribosomal DNA, 28S）

所組成，其中ITS1、5.8S、ITS2 合稱為 internal transcribed spacer，簡稱 ITS 區域，

此區域乃為非保守區域，因此該區域之序列常被用來作為分類鑑定與分析親緣關 係之依據（Hibbet et al., 1995）。

選用真核生物核醣核酸基因來作為分類的依據，小的次單位核醣體DNA（18S）

可作為偵測的目標，因為細胞內存有多量且充足的演化資訊，可供推論其相近的 親緣關係，同時具有演化中高保留性（Woese and Olsen, 1996）與高重複數等優點，

因此演化速率較慢，雖經過百萬年的歷史，序列變異有限，可用於遠緣生物

（distantly related organism）之比較，故多作為屬之間的分類依據（Dams et al., 1988）。至於 ITS 區域，因不受功能限制，可以保留較多的突變（mutation），演化 速率較快，在屬內種（species）間有高度的變異存在，可以用在近緣生物間的比較

（White et al., 1990）。

微管蛋白是由球狀多肽微管蛋白（globular polypeptide tubulin）所組成的管狀 聚合物，主要是由 α-微管蛋白及 ß-微管蛋白兩種主要的微管蛋白所組成，分子量 皆約為 50 Kilo Dalton（陳炳宏，2000）。在真核生物的整個演化過程中，微管蛋 白氨基酸序列是屬於保留性相當高的序列，且不同物種間的微管蛋白氨基酸序列 的同質性（identity）也相當高，例如蕈類與動、植物間的微管蛋白氨基酸序列相 似性約為70%（Silflow et al., 1987）。由藻類、真菌、動物以及植物等的微管蛋白 基因結構比對發現，微管蛋白基因的插入子（intron），分布位置的保留現象多發生 於相同生物界內的相近物種間，推測不同生物界的微管蛋白基因結構間具有演化 上的歧異性，因此可進一步在種間的分類上作使用（Cleveland and Sullivan, 1985）。

（四）分子生物鑑定在研究塊菌方面的應用

塊菌有其重要的商業價值，許多塊菌因子實體形態過於相似，致使常有以較 低價的塊菌充當高價塊菌買賣之情形，有鑑於此，發展分子生物鑑定塊菌的種類 有其必要性。

在塊菌的分子生物技術中，種內的鑑定多以ITS、5.8S-ITS2 與 ß-微管蛋白等 基因來進行，而屬之間的分類依據則是以在演化中具有高保留性、高重複數的18S 核醣體 DNA 來進行。Percudani 等（1999）以真菌的 18S rDNA 通用引子對 NS1/NS8，進行塊菌屬與地菇屬（Terfezia）的 PCR 反應，根據最大可能性

（maximum-likelihood, ML）分析方法繪出親源關係圖，結果顯示六種塊菌屬（T.

panniferum、T. magnatum、T. excavatum、T. rapaeodorum、T. borchii 與 T. gibbosum）

與兩種地菇屬（Terfezia terfezioides、T. arenaria）分別位於不同的支序群（clade）

中。O´Donnell 等（1997）也是以 18S rDNA 來作塊菌科內，屬間的親緣分析，結 果顯示塊菌科下有 5 個屬，包含 Dingleya 屬、Reddellomyces 屬、網黏菌屬

（Labyrinthomyces）、Choiromyces 屬以及塊菌屬，這均表示 18S rDNA 確實可作為 塊菌屬與其他屬間的分類依據。

Iotti 等（2002）成功分離出六種塊菌（T. maculatum、T. rufum、T. melanosporum、

T. aestivum、T. brumale、T. macrosporum），並以菌絲體培養繁殖後，使用通用引子 對ITS1、ITS4 進行 PCR 反應，獲得該六種塊菌之 ITS 區域後，至 NCBI 進行 Blast search，比對 GenBank 中與該六種塊菌菌種最相近的 ITS 序列，結果發現 T.

maculatum 最相近序列為 T. maculatum（AF003919）、T. rufum 最相近序列為 T. rufum

（AY112894）、T. melanosporum 最相近序列為 T. melanosporum（U89359）、T.

aestivum 最相近序列為 T. aestivum（AF106886）、T. brumale 最相近序列為 T. brumale

（AF001010）、T. macrosporum 最相近序列為 T. macrosporum（AY112895）；之後 再 以 搜 尋 自 GenBank 的 ITS 序列與該六種塊菌之 ITS 序列，進行演化樹

（phylogenetic tree）分析，得到的演化樹可以分成六個支序群，而六種分離成功的 塊菌，與各自在GenBank 所 Blast search 最相近的序列，均落在同一支序群中，再 次確認該實驗所分離的菌絲為其目標塊菌。

Baciarelli-Falini 等（2006）以毛櫟接種黑孢塊菌的塊菇園為研究對象。他們從 試驗地中採集到 140 個菌根樣本，初步以形態方式分類後，發現所有樣本中有 6 種為塊菌屬的菌根，而此 6 種又可以藉由形態判定出四種分別為波奇塊菌、冬塊 菌、黑孢塊菌與夏塊菌，其他兩種（ECMm1、ECMm3）則僅能判斷至屬（Tuber sp.）。 Baciarelli-Falini 等針對該 6 種塊菌進行 PCR 增幅反應，在獲得 ITS 區域後，至 NCBI 進行Blast search，結果發現 ECMm1 與 T. scruposum 有極高的相似度（92～98％）， 而ECMm3 則是與棕紅塊菌有極高相似度（91％）；此6 種塊菌與從 GenBank 中獲 得的13 種塊菌之 ITS 區域作親緣分析後，發現 ECMm1 確實與 T. scruposum 為同 一支序群中，ECMm3 則是與棕紅塊菌及 T. ferrugineum 位於同一支序群中

（bootstrap=100％）。

Frank 等（2006）以美國奧勒岡州所發現的兩種新種塊菌（T. quercicola、T.

whetstonense），與該兩種形態類似的塊菌（T. candidum）作分子生物鑑定，該研究 使用另一種通同引子對 ITS1F 與 ITS4 進行 PCR 反應，所得到的 ITS 序列與從

GenBank 中選出的七種白塊菌（波奇塊菌、T. malculatum、T. puberulum、T.

dryophilum、T. foetidum、T. rufum、T. ferrugineum），以 PAUP 4.0 作親緣分析，所 得到的結果與孢子形態分類相同，分成兩個支序群，一種為網狀孢子群（波奇塊 菌、T. malculatum、T. puberulum、T. dryophilum、T. foetidum、T. whetstonense），另 一支序群則為刺狀孢子群（T. rufum、T. ferrugineum、T. quercicola、T. candidum）。

許多塊菌的外部形態過於相類似，因此造成研究人員間的爭論，夏塊菌與勃 良第塊菌即是最典型的例子。Riousset 等（2001）提出兩者之間應該是兩個種，孢 子網紋的長度與氣味不同，是兩者間最大區別特徵；然而卻也有些學者（Gandeboeuf et al., 1997；Urbanelli et al., 1998）認為勃良第塊菌僅是夏塊菌的亞種（subspecies）。 Mello 等（2002）從不同生育地蒐集了 20 個品系的勃良第塊菌，以及 12 個品系的 夏塊菌，於增幅兩種塊菌的 ITS 區域後，繪出親緣關係圖，結果成功的將夏塊菌 與勃良第塊菌分成兩個支序群，因此Mello 等推斷兩者為不同的種。然而 Paolocci 等（2004）再以不同品系的夏塊菌與勃良第塊菌作 ITS 區域之增幅，另外並以 EFtFw/EFtBw 引子對，進行 ß-微管蛋白基因之增幅作佐證；結果卻發現無論是 ITS 區域或 ß-微管蛋白基因之分析，兩者間均呈現為同一個種，因此 Paolocci 等認為 生態環境的差異，使兩者間產生些微的基因、孢子形態、氣味等差異。

此外，黑孢塊菌與大陸的黑色塊菌群（印度塊菌、喜馬拉雅塊菌、中國塊菌）

間，也有著形態相似的困擾，前文有提到許多商人將兩者混合之後以高價買賣，

因此有許多學者投入研究黑孢塊菌與中國黑塊菌間的區別。Paolocci 等（1997）以 通用引子對 ITS1/ITS4 增幅黑孢塊菌與四品系印度塊菌之 ITS 區域後，根據 alignment 結果顯示可以明顯發現黑孢塊菌與印度塊菌間的區別。Rubini 等（1998）

則使用了三種黑色塊菌（黑孢塊菌、冬塊菌與印度塊菌）作PCR 試驗，結果發現 三種塊菌間的ITS 區域長度呈現多型性（polymorphism），尤其冬塊菌的ITS1 區域 較其他兩種塊菌長約300 bp。Roux 等（1999）蒐集了 10 種歐洲與大陸的塊菌（黑 孢塊菌、印度塊菌、偽喜馬拉雅塊菌、冬塊菌、夏塊菌、凹孔塊菌、義大利白塊