第三章 材料與方法
第五節 以反應曲面法探討最適培養條件之實驗設計
本研究因先前的實驗得知，以深層海水作為水分來源發酵的紅麴山藥具有 較高含量的紅麴黃色素 monascin 與較低量的 citrinin，故在設立單因子預試驗 的條件時，主要是以水分的變化作為主軸。單因子預試驗的條件分為 5 大項目，
分別為不同的培養天數、培養 pH 值、深層海水的含量、種菌的接種量與加水 量。在基礎條件設立時，是以培養 7 天、pH 值為 3、深層海水含量 100%、種 菌接種量 60 mL 與加水量為 100 mL，進行培養。單因子預試驗的條件設立是 以基礎條件延伸探討，故培養天數設立為 6、8 與 10 天；培養 pH 值為 2、3 與 4；深層海水含量分為 20%、60% 與 100%；種菌接種量分為 60、80 與 100 mL；加水量 40、70 與 100 mL。
以 M. purpureus NTU 568 為實驗菌株，反應曲面法試驗設計中培養 pH 值、深層海水與 RO 水比例、完水時的加水量之實驗組合，根據 Box 及 Behnken 等之三變數、三階層因子設計 (表 3-1)；在中心旋轉設計的中心點的決定，是先 經由單因子的預試驗篩選所得。培養 pH 值與其數值是由先前不同添加物試驗 中所決定並以 pH 值 3 為中心點；在先前單因子條見探討，發現添加 100% 深 層海水的紅麴山藥具有較高含量的功效成分，故以 100% 深層海水為中心點；
而加水量主要是針對完水階段時的添加，每隔 24 hr 添加一次，共添加四次，並 在固態培養的預備實驗中得知加水量 100 mL 較適合紅麴固態發酵，故以 100 mL 加水量為中心點。
反應曲面實驗設計採用三變數-三階層之中心旋轉組合設計，共經 15 個組 合實驗，如表 3-2 所示，試驗後進行分析各組合 monascin、ankaflavin 與 citrinin
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表 3-1 三變數-三階層反應曲面設計之操作條件變數及階層
Table 3-1 Process variables and levels in the three variables – three levels response surface design.
Variable Symbol Coded-variable level
-1 0 1
pH X1 2 3 4
DSW concentration (%) X2 60 80 100 Amount of water added (mL) X3 80 100 120
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表 3-2 固態發酵之三因子-三階層之中心旋轉組合設計
Table 3-2 Three variables – three levels of rotatability central composite design arrangement.
Runs
Response value Code value
pH
DSW concentration
(%)
DSW added
(mL) X1 X2 X3
1 4 100 100 1 1 0
2 4 60 100 1 -1 0
3 2 100 100 -1 1 0
4 2 60 100 -1 -1 0
5 4 80 120 1 0 1
6 4 80 80 1 0 -1
7 2 80 120 -1 0 1
8 2 80 80 -1 0 -1
9 3 100 120 0 1 1
10 3 100 80 0 1 -1
11 3 60 120 0 -1 1
12 3 60 80 0 -1 -1
13 3 80 100 0 0 0
14 3 80 100 0 0 0
15 3 80 100 0 0 0
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產量，所得結果再以 SAS (Statistic Analysis System) 電腻套裝軟體中 RSREG (Response Surface Regression) 程式進行反應曲面分析 (Giovanni 1983)，以培養 pH 值 (X1)、深層海水與 RO 水比例 (X2) 與加水量(X3) 作為條件變數因子，
以 monascin (Y1)、ankaflavin (Y2) 與 citrinin (Y3) 生成量作為反應曲面性狀，求 出如下之三變數二次多項式：
Y=a0+a1X1+a2X2+a3X3+a12X1X2+a13X1X3+a23X2X3+a11X12+a22X22+a33X32 (a 表示各項之係數)
進行變異數分析 (ANOVA) 以得到總迴歸係數 (R2)、欠和度 (lack of fit) 顯 著性、複迴歸方程式之各項係數及各因子對反應觀測值得顯著程度，再將求得之 迴歸方程式利用 STATISTICA 與 Sigma Plot 2000 統計與繪圖軟體繪出反應曲 面圖與等高線，探討最適培養條件。
第六節 體內動物試驗
一、降低體內血脂肪之動物實驗評估方法
(一) 實驗動物之飼養
實驗動物飼養與照料動物實驗方法參考 Usman 與 Hosono 兩位學者於 2000 年發表文獻之模式加以修改。本研究中所採用之動物為購自財團法人國家 實驗動物研究院實驗動物中心之 Syrian 品系雄性倉鼠，週齡 4 ~ 6 週，每組 8 隻，共 64 隻。飼養於控制相對溼度 60%，室溫 23 ± 1℃，光照時間為 8:00 ~ 20:00 之 12 hr 光照循環，食物與水供給不予限制之環境下。倉鼠預養 2 週後，
進行實驗分組後，開始進行 8 週正式實驗。實驗期間每週測定並記錄體重。餵 食採用管餵法供給固定量之樣品於倉鼠。
(二) 餵食劑量之計算
以 FDA 所提供之體表面積換算公式計算以體表面積方式換算，人體表面積 以身高 170 cm，體重 65 kg 為基準，代入 Boyd’s 公式，BSA (m2) = 0.003207 × Height (cm)0.3 × Weight(grams)(0.07285-(0.0188×LOG (grams)))
，求出人體表面積約為 1.762 m2。
倉鼠體表面積則依 FDA 提供之公式換算 (http://www.fda.gov/cder/cancer/
animalframe.htm) ， 以 體 重 0.13 kg 為 基 準 ， BSA (m2) = 8.99 × Weight (kg)(0.6899))/100，求出倉鼠表面積約為 0.022 m2。則可由人體每帄方公尺表面積
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所需劑量，求出倉鼠每公斤體重所需劑量。
(三) 試驗物質
紅麴山藥是以基礎條件所發酵製成，其中以 1 g 深層海水發酵之紅麴山藥 為成人之一倍劑量，以 monacolin K 為正控制組。探討以深層海水為水分來源 發酵之紅麴山藥是否具有較佳的降血脂與預防動脈粥狀硬化的效果。本研究將每 人 (體重 65 kg) 每天建議攝取 1 g 的深層海水為水分來源發酵之紅麴山藥為 一倍劑量，則每帄方公尺所需劑量為 1000 mg/1.762 m2 = 567.54 mg/m2。
倉鼠每公斤體重所需劑量則為 567.54 mg/m2 × 0.022 m2/ 0.13 kg ，可得 96.045 mg/kg/bw 。此為本試驗倉鼠之一倍劑量，故 0.13 kg 之倉鼠每日每隻以 深層海水為水分來源發酵之紅麴山藥攝取量為 96.045 mg/kg/bw × 0.13 kg = 12.486 mg/day。
(四) 飼料配方配置與投予方法
將 AIN-76 飼料配方加以修正。8 週期間之實驗分組與劑量如表 3-3 所 示，NOR 組為正常飲食組、HC 組為高膽固醇飲食組、RO-RMD 1X 組為食用 1 倍劑量之紅麴山藥組、DSW-RMD 1X 組為食用 1 倍劑量之添加深層海水為水 分來源之紅麴山藥組、DSW-RMD 2X 組為食用 2 倍劑量之添加深層海水為水 分來源之紅麴山藥組、MK 組為食用降膽固醇物 monacolin K 之正對照組、MS 組為食用 2 倍劑量之紅麴次級代謝物 monascin 組、AF 組為食用 2 倍劑量之 紅麴次級代謝物 ankaflavin 組。飼料成分配方如表 3-4 所示。因紅麴山藥粉末 顆粒可能會阻圔管灌餵食針，試驗前先以乾淨研缽磨碎，再依不同劑量組合稱取 所需之量，以無菌蒸餾水配製成懸浮樣品溶液。每日以 1.0 mL 無菌圕膠針筒套 上不鏽鋼餵食針餵食各組所需之劑量。不鏽鋼餵食針帄時浸泡在絕對酒精溶液 中，使用前再以無菌蒸餾水潤溼。試驗樣品每週研磨配製。各組老鼠每週經口投 予七天，計畫執行時間共投予八週。
(五)
動物犧牲、採血及肝臟病理切片鏡檢 1. 動物犧牲 (sacrifice) 法禁食 12 小時後以二氧化碳窒息犧牲老鼠。確定老鼠無呼吸心跳開始準備解 剖、抽血。
2. 抽血法：
本實驗以針筒自鼠體腹腔大靜脈抽血。使鼠體仰臥腹面朝上，自下 (近尿道
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表 3-3 實驗動物 Syrian 倉鼠分組與樣品劑量之配置
Table 3-3 Syrian hamster experimental animal dose group and sample configuration.
Groups Experimental
samples Dose Intake (mg/day) Experimental diets
NOR - - - normal diet
HC - - - high cholesterol diet RO-RMD 1X RO-RMD 1 12.486 high cholesterol diet DSW-RMD 1X DSW-RMD 1 12.486 high cholesterol diet DSW-RMD 2X DSW-RMD 2 24.972 high cholesterol diet MK Monacolin K 2 0.240 high cholesterol diet MS Monascin 2 0.245 high cholesterol diet AF Ankaflavin 2 0.036 high cholesterol diet
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表 3-4 降血脂動物試驗各組之飼料配方組成 (g/kg diet) (Reeves 1997) Table 3-4 The composition of diet each group in hypolipidemic animal test (g/kg diet).
Normal diet High-cholesterol diet
Casein 200 140
Corn starch 650 680
Cel1ulose 50 50
Soybean oil 50 78
Mineral 35 35
Vitamin 10 10
L-cysteine 3 1
Choline bitartrate 2 2
Cholesterol - 2
Cholic acid - 2
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出口處附近) 沿中線向上剪開皮毛層，剪至肋骨下方。再剪開肌肉層，於肋骨下 方向左右各剪一刀，使腹腔整個暴露。注意勿剪破橫隔膜，以保持胸腔完整。將 腸等翻開並推向右側，使下腔靜脈露出，以鈍頭鑷子小心撕扯(或以棉花輕拭)，
除去包覆下腔靜脈血管之結締組織。將抽血管推到底後與下腔靜脈血管約成 20~30° 角，針頭插入血管中緩緩抽出血液，放入 2 mL eppendorf tube 中靜置，
待 30 分鐘後有明顯分層出現時，以 1.2 ×g，離心 15 分鐘，取其上層血清分 裝入 eppendorf tube，於 - 20℃ 冰箱冷凍儲存，待日後送檢分析。
3. 血液中脂質濃度與肝功能之測定：
血液中脂質濃度之檢測項目分別為血清中之三酸甘油酯、總膽固醇、高密度 脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量，肝功能為血液中 AST、ALT 之含量，
皆為委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman-700, Fullerton, CA, USA) 檢測。
4. 血清脂質過氧化測定－TBARS 分析法
【脂質過氧化程度測定原理】
利用 TBA 之呈色法測定脂質過氧化丙二醛 (MDA) 產量。MDA 產物愈 多，其吸光值愈高，因此若樣品可降低此系統之吸光值，則表示具有抗氧化效應。
血 清 脂 質 過 氧 化 分 析 法 是 參 考 Tarladgis 等 人 之 方 法 ， 以 TMP (1,1,3,3-tetramethoxypropane) 為標準品，先 以二次蒸餾水將 TMP 稀釋為 1 mM ，再以 1 N H2SO4 將其濃度分別稀釋為 0、2、4、6、8、10 μM，各取 100 μL，分析方法與樣品相同。
取 25 μL 的血清加入 150 μL 的 5% trichloroacetic acid 及 50 μL 60 mmol/L 的 TBA ，於 80℃ 反應 90 min 後，冷卻於室溫，再於 4℃ 下離心 15 min，測定其吸光值並與標準溶液之吸光值對照換算得 MDA 濃度。
5. 糞便或肝組織脂質分析 (1) 糞便或肝組織脂質萃取
取 0.1 g 糞便或肝組織，於 1 mL chloroform-methanol (v/v = 2:1) 溶劑中均 質。過濾後之濾液含有糞便或肝組織中大部分之脂質，以 chloroform-methanol (v/v = 2:1) 溶劑定量至 1 mL 後，儲存於 -20℃，作為日後分析糞便中 TG 及 TC 之樣品 (Folch et al., 1957)。
(2) 檢測糞便或肝組織中總膽固醇及三酸甘油酯濃度
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檢測糞便或肝組織脂質濃度分別使用市售生化試劑 (CH 201, Randox) 分析 總膽固醇含量，以市售生化試劑 (TR 1697, Randox) 分中三酸甘油酯含量，操作 方法如套組說明書所示。
【TC 測定原理】(CH 201, Randox)
Cholesterol ester + H2O Cholesterol + Fatty acids
Cholesterol + O2 Cholestene-3-one + H2O
2 H2O2 + phenol + 4-Aminoantipyrine quinoneimine + 4 H2O
在 96 孔盤中加入 5 μL 血清樣品及 200 μL reagent，於 37℃ 下反應 5 min 或在室溫下反應 10 min。利用 ELISA reader 測量 495 nm 波長之吸光值，
並與標準曲線比較，進行定量。
【TG 測定原理】(TR 1697, Randox) 測定原理與前述相同。
先將 buffer 及 enzyme reagent 混合均勻，作為呈色劑。取 5 μL 血清樣品 加至 96 孔盤中，接著加入 200 μL 呈色劑，於 37℃ 下反應 5 min，或於室溫 下反應 10 min。1 hr 內利用 ELISA reader 測量 495 nm 波長之吸光值，並與標 準曲線比較，進行定量。
6. 動脈粥狀硬化之血管生理切片
將餵食約八週後的倉鼠以二氧化碳窒息犧牲後取出主動脈至胸主動脈之血 管，清除血管周圍外膜及脂肪組織，將處理過後的血管以縱向方式切開。將切開 的血管放入 Sudan IV (2% w/v) 溶於 100% methanol，染色約 3 分鐘，再依 100%、90%、80%、70%、60% methanol 及 PBS 去染後攤帄於培養皿上。
Sudan IV 為一種嗜脂性之染料，會與脂肪結合而產生紅色斑塊，以解剖顯 微鏡觀察並照相，再利用電腻影像分析軟體 Photoshop 分析其動脈硬化斑塊與 血管面積之比值，依此依據評估以深層海水發酵為來源發酵之紅麴山藥是否可改 善粥狀動脈硬化之情形。
7. 肝、腎病理鏡檢：
Cholestrol esterase Cholestrol
oxidase
Peroxidase
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犧牲老鼠後，各組標的臟器 (肝、腎臟) 皆委託財團法人台灣動物科技研究 所，進行組織切片、染色及組織病理鏡檢。
二、降低體脂肪動物實驗評估方法
(一) 實驗動物飼養與照料
動物實驗方法參考 Usman 與 Hosono 兩位學者於 2000 年發表文獻之模 式加以修改。本研究中所採用之動物為購自樂斯科生物科技股份有限公司之 SD 品系雄性大鼠，週齡 6 週，每組 8 隻，共 64 隻。飼養於控制相對溼度 60%，
室溫 23 ± 1℃，光照時間為 8:00~20:00 之 12 小時光照循環，食物與水供給不 予限制之環境下。大鼠預養 2 週後，進行實驗分組後，開始進行 8 週正式實驗。
每週測定攝食量與體重。餵食樣品採用固定量樣品與定量 RO 逆滲透水，加入
每週測定攝食量與體重。餵食樣品採用固定量樣品與定量 RO 逆滲透水，加入