隨著經濟越趨富裕繁榮，高血脂症與肥胖是導致心血管疾病與糖尿病之危險 因子，此二者已然成為健康之頭號殺手。根據衛生署統計國人 2008 年的十大死 因中，發現第二位心臟疾病與第三位腻血管疾病兩者的死亡原因皆是屬於心血管 疾病的一種 (行政院衛生署，2008)，如何減緩肥胖發生、降低血中脂質含量是 當今備受矚目之課題。
近年深層海水因具有低溫安定性、清淨性、熟成性、富營養性、礦物特性，
而被多元化的應用於各種產業，產出數倍乃至數百倍的附加價值，故被諭為藍色 的黃金，而亦有研究指出深層海水具有促進麴菌之活性作用、可降低體脂肪、血 脂等研究。紅麴為我國傳統之發酵菌種，而近年來養生保健主義抬頭，保健食品 促使紅麴之研究更趨完備，也讓普羅大眾了解紅麴具有降血脂、降血壓、降血糖、
防癌等功效。本研究目的在於探討以深層海水為水分來源發酵之紅麴山藥是否能 提升降血脂與降低體脂肪之效果，並進一步以反應曲面法探討其功效成分之最適 發酵條件。
第二節 實驗架構
本研究實驗實驗大綱架構如圖 2-1 所示，利用紅麴以山藥為基質進行固態 培養，並利用深層海水與 RO 水為不同之水分來源進行紅麴山藥之發酵，發酵 產物分別為深層海水發酵之紅麴山藥與 RO 水發酵之紅麴山藥，本試驗將此二 者做為試驗物質。將深層海水發酵之紅麴山藥與 RO 水發酵之紅麴山藥分別進 行成分分析與降血脂與降低體脂肪之保健功效評估。成分分析結果顯示深層海水 發酵之紅麴山藥具有較高的 monascin 產量，所以將 monascin 做為降血脂與降 低體脂肪之功效成分探討。雖然 ankaflavin 之產量與 RO 水發酵之紅麴山藥相 近，但亦做為降血脂與降低體脂肪動物實驗之功效成分探討。目前本研究降血脂 之保健功效評估結果顯示，深層海水發酵之紅麴山藥具有降血脂之功效，且降血 脂之功效成分為 monascin 與 ankaflavin。綜合成分分析與降血脂保健功效評估 之結果後，即進行功效成分 monascin 與 ankaflavin 之最適發酵條件探討。建立 基礎發酵條件與探討條件後，再以反應曲面法探討 monascin 與 ankaflavin 之最 適發酵條件。
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紅麴菌
以淮山藥為基質進行發酵
DSW-RMD 以深層海水為水分來源 以 RO 水為水分來源
RO-RMD
成分分析 保健功效評估
分析 ankaflavin、
monascin、
citrinin 含量
以高膽固醇飲食之倉鼠 進行降血脂之功效評估
以高油脂飲食之大鼠進行 降低體脂肪之功效評估
由成分分析、降血脂與降體脂肪之試驗結果評估功效成分，並以反應曲面法 探討其最適發酵條件
紅麴山藥固態發酵之基礎條件：
山藥片的起始量為 300 g；起始 pH 為 3；水分來源為 100% 的深層海水；
發酵天數為 7 天；接種量為 60 mL；每天的補水量為 100 mL
圖 2-1 實驗大綱架構圖
Fig. 2-1 Outline of the experiment.
探討 monascin 與 ankaflavin 最適發酵條件之單因子探討條件：
1. 培養天數分別為 5、7、9 天 2. 培養 pH 值為 3、5、7
3. 起始接種量為 60、80、100 mL 4. 加水量為 40、70、100 mL 5. 深層海水含量為 20%、60%、100 %
利用探討 monascin 與 ankaflavin 之最適發酵條件之初步結果，再 以反應曲面法探討 monascin 與 ankaflavin 之最適發酵條件並驗證
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第三章 材料與方法 第一節 實驗材料
一、儀器設備
1. 純水製造機 (Ultrapure water system)
RO-1070, PA-E Machinery Industrial CO., Taichung, Taiwan 2. 恆溫振盪培養箱 (Vertical shaker incubator)
LM-570RD, Yihder Scilab Technology Co. Ltd., Jhonghe, Taiwan 3. 殺菌釜 (Autoclave)
Model ss-320, Tomy CO., Tokyo, Japan 4. 離心機 (Centrifuge)
Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Fisher Scientific Inc., Germany 5. 無菌操作台
Kansin Co., Taipei, Taiwan 6. 倒立式顯微鏡
BI-500, Motican co., USA 7. 均質機
D-130, Wiggen hauser, Germany
8. 酵素免疫分析儀 (Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) SUNRISE, Tecan Trading AG, Switzerland
9. 恆溫水浴槽 (Water bath)
FirstTek scientific, Taipei, Taiwan 10. 酸鹼測定器 (pH meter)
MP220, Mettler Toledo, UK 11. 熱風烘箱
DK63, Yamato, Japan 12. 高速冷凍離心機
HIMAC CR22E, Hitachi Co., Tokyo, Japan
13. 高效能液相層析儀 (High performance liquid chromatography, HPLC) Model L-2130, Hitachi Co., Tokyo, Japan
14. HPLC 積分儀 (Integrator)
Model D-2500, Hitachi Co., Tokyo, Japan 15. HPLC 偵測器（UV/VIS Detector）
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Model L-2455 DAD, Hitachi Co., Tokyo, Japan 16. HPLC 螢光偵測器 (Fluorescence detector)
Model L-2485 FL Detector, Rainin Co, USA 17. HPLC 層析管柱 (column)
RP-18 GP 250-4.6 (5 μm), Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan
二、其他
1. 數位相機 (Digitale camera)
Coolpix 800, Nicon Co., Tokyo, Japan 2. 數位攝影機
Motic 1000, Motic Incorporation Ltd., Hong Kong, China 3. 影像分析軟體
ImageJ, U. S. NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA) 三、 溶液配製
1. Phosphate Buffered Saline (PBS)：
Chemicals Content (g)
NaCl 38
Na2HPO4 10.15
將上述藥品加入 800 mL 逆滲透水中，調整 pH 至 7.0 ，加水定量至 1000 mL。
第二節 藥劑
一、標準品
Monacolin K、monascin、ankaflavin 與 citrinin 標準品皆由國立台灣大學微 生物與生化學研究所潘子明教授實驗室所提供
二、市售套組
TC (CH 201)、TG (TR1697)與 Ketone bodies (RB 1007) 分析套組皆購買 Randox Laboratories Ltd. (Antrim, UK)
三、一般試藥
1. Dulbecco's Modified Eagle (DMSO)、chloroform、methanol、tricholoroacetic acid (TCA)、acetonitrile、triflouroacetate (TFA) 購自 Merck & Co., Inc. (Darmstadat,
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Germany)
2. Ethanol 購自臺灣菸酒公司
3. Sudan IV 購自 Panreac Química S.A. (Barcelona, Spain)
4. 1,1,3,3-Tetramethoxypropane (TMP)、2-Thiobarbituric acid (TBA) 購自 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)
四、其它
1. 深 層 海 水 購 自 台 灣 海 洋 深 層 水 股 份 有 限 公 司 ( 第 2AAA0002246 批 號 , Hualien, Taiwan)
2. 深層海水水質檢驗委託財團法人自強工業科學基金會進行檢驗 (Hsinchu, Taiwan)
3. 酥油粉末購買自詮亞股份有限公司 (Gene Asia Biotech Co. LTD., Nang-Tou Hsien, Taiwan)
4. 粉狀飼料購買自 PMI Co. (Labdiet 5001, USA)
5. 酪蛋白 (casein)、玉米澱粉 (corn starch)、纖維素 (cellulose)、膽鹼 (Choline bitartrate)、半胱胺酸 (cysteine)、膽酸 (cholic acid)、膽固醇 (cholesterol)、維 生素 (vitamin)、礦物質 (mineral) 均購自 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA) 6. 統一大豆沙拉油購自統一企業 (Tainan, Taiwan)
第三節 紅麴山藥之培養條件
一、試驗菌株
本實驗使用由國立台灣大學微生物與生化學研究所潘子明教授實驗室所提 供 Monascus purpureus NTU568 紅麴菌株，其適合生長溫度在 25-35℃ 之間，
保存於 Potato dextrose agar (PDA) 培養基中培養基組成。
二、培養基成份
(一) 菌株保存用培養基
Potato dextrose agar (PDA)
Potato dextrose broth 24 g
Agar 15 g
Distilled water 1000 mL
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(二) 種菌培養基
Dioscorea medium with deep sea water
Dioscorea 3 g
Deep sea water 60 mL
三、種菌之培養
由帄板培養基中培養一段時間之菌體，挖取約 1×1 cm 大小之菌塊，接種至 含 60 mL 種菌培養基之 500 mL Hinton flask 中，於 28℃，轉速為 100 rpm 培 養 48 小時。在接種前觀察種菌液中菌體生長狀況，以至少可觀察到菌絲球之狀 態為標準。
四、固態培養
(一) 培養基
本研究中，固態培養所使用之培養基為山藥 (購自台東市場)。
(二) 固態培養之步驟及條件 (蘇等，1970)
紅麴之固態培養是以山藥為基質，取 300 g 山藥切至小片狀 (2 - 5 cm2)，包 於麴布之中，加入 180 mL 以深層海水海水配製之 PBS buffer (pH = 3)，置於紗 布之上，上覆另一層紗布，鋪帄在麴盤中，殺菌 (121℃, 25 min) 之後冷卻進行 接菌，取種菌液接入固態基質中 (5%)，並充分攪拌均勻。接種後操作管理如下：
第一天：接種 接種後用紗布包妥，置於 28℃ 恆溫箱中，將固態基質集中於麴 盤之中央。
第二天：翻拌 菌絲急速繁殖，為防止品溫過度升高，適時給予翻拌，且視繁殖 情況，將蒸飯厚度逐漸改薄，以控制保持紅麴菌之最適繁殖條件。
第三天：頭水 因紅麴菌急速繁殖，固態基質中之水分，除一部份溫度上升被蒸 發外，大部分被繁殖所消耗，因此基質變成乾燥。為了使紅麴菌 順利繁殖起見，需施行浸水，給予適當水分。此項操作稱為頭水。
加水時以針筒吸取，加入深層海水 100 mL 後，將半製品放入 28
℃ 恆溫箱培養。
第四天：次水 此時半製品變紅，繁殖最為旺盛，水分被紅麴菌繁殖及蒸發所消 耗，故需實行第二次浸水，此項操作稱為次水。以針筒注射之方
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式加入 100 mL 之深層海水，並將其拌勻，使水分均勻分散於基 質中。
第五天：完水 為調節半製品使含適當水分，促進繁殖與菌絲之滲透，需施行第 三次加水，水量為 100 mL 每隔 24 hr 加一次，共加三次，此項 操作稱為完水。
第六至九天：後熟 完水後漸進入後熟階段。此時需給予適當翻拌，約 24 小時 翻拌一次。
第九天：收麴 將完成醱酵後的深層海水之紅麴醱酵產物置於烘箱內乾燥 (45℃, 24 hr)，之後以磨粉機磨成粉末狀以進行功效成分含量分析與體內 動物實驗。
五、培養之狀況
以傳統麴盤進行培養，製作較小型之麴盤，長、寬、高各約 20 ×30 × 5 cm；培養時以麴布包裹固態基質，置於紗布之上，上覆另一層紗布，鋪帄在 麴盤中放置，此有利於翻麴，同時可以保持濕度；上層再蓋上一層麴布以隔 絕外界之污染，同時並可保持發酵過程紅麴山藥的濕度。整個培養過程於開放 式之空間進行。
第四節 Monascin、ankaflavin 與 citrinin 之分析方法
一、Monascin、ankaflavin 與 citrinin 之分析方法
(一) 固態培養 monascin、ankaflavin 與 citrinin 之萃取
樣品秤取 1 g，加入 10 mL 的 75% ethanol，於 50℃ 水浴加熱萃取 1 hr 後 ， 以 0.45 μm 濾 膜 過 濾 後 進 行 高 壓 液 相 層 析 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 分析。
(二) Monascin、ankaflavin 與 citrinin 濃度之測定 (Lee et al. 2007a)
以 HPLC 測定 monascin、ankaflavin 與 citrinin 之含量，並以 monascin、
ankaflavin 之純物質與 citrinin 標準品之製作標準檢量線，由檢量線以內差法求 得濃度 (佐藤恭子等，1998)。HPLC 之操作條件如下表所示：
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Monascin, ankaflavin, citrinin 之 HPLC 分析條件
Colum RP-18 GP 250-4.6 (5 μm)
Mobile phase Water：acetonitrile：triflouroacetate (38：62：0.05)
Flow rate 1.0 mL/minFlorescence detector L-2485 FL Detector
Florescence detection Excitation max = 330 nm，
Emission max = 500 nm UV detection L-2455 DAD (A 238 )
Pump L-2130 HTA pump
第五節 以反應曲面法探討最適培養條件之實驗設計
本研究因先前的實驗得知，以深層海水作為水分來源發酵的紅麴山藥具有 較高含量的紅麴黃色素 monascin 與較低量的 citrinin，故在設立單因子預試驗 的條件時，主要是以水分的變化作為主軸。單因子預試驗的條件分為 5 大項目，
分別為不同的培養天數、培養 pH 值、深層海水的含量、種菌的接種量與加水 量。在基礎條件設立時，是以培養 7 天、pH 值為 3、深層海水含量 100%、種 菌接種量 60 mL 與加水量為 100 mL，進行培養。單因子預試驗的條件設立是 以基礎條件延伸探討，故培養天數設立為 6、8 與 10 天；培養 pH 值為 2、3 與 4；深層海水含量分為 20%、60% 與 100%；種菌接種量分為 60、80 與 100 mL；加水量 40、70 與 100 mL。
以 M. purpureus NTU 568 為實驗菌株，反應曲面法試驗設計中培養 pH 值、深層海水與 RO 水比例、完水時的加水量之實驗組合，根據 Box 及 Behnken 等之三變數、三階層因子設計 (表 3-1)；在中心旋轉設計的中心點的決定，是先 經由單因子的預試驗篩選所得。培養 pH 值與其數值是由先前不同添加物試驗 中所決定並以 pH 值 3 為中心點；在先前單因子條見探討，發現添加 100% 深 層海水的紅麴山藥具有較高含量的功效成分，故以 100% 深層海水為中心點；
而加水量主要是針對完水階段時的添加，每隔 24 hr 添加一次，共添加四次，並 在固態培養的預備實驗中得知加水量 100 mL 較適合紅麴固態發酵，故以 100 mL 加水量為中心點。
反應曲面實驗設計採用三變數-三階層之中心旋轉組合設計，共經 15 個組 合實驗，如表 3-2 所示，試驗後進行分析各組合 monascin、ankaflavin 與 citrinin
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表 3-1 三變數-三階層反應曲面設計之操作條件變數及階層
Table 3-1 Process variables and levels in the three variables – three levels response surface design.
Variable Symbol Coded-variable level
-1 0 1
pH X1 2 3 4
pH X1 2 3 4