以反應曲面法探討益生菌共培養金銀花葉萃取物最適發酵條件.66

件，三變數分別為培養時間 (X1)、起始 pH 值 (X2)、培養溫度 (X3)，其各變 數階層與對應結果如表十四所示。將金銀花葉萃取物以益生菌轉換後分析兒茶 酚 (Y1)、兒茶素 (Y2) 與綠原酸 (Y3) 等含量，並將實驗數據以 Microsoft Excel 中的數據迴歸程式進行分析，可得上述分析模式之迴歸係數值，並以此求得下 列之三變數二次方程式：

兒茶酚含量 (μg/mL) Y₁=147.494438873188+( 0.74258136566688)X₁+( 21.19159 10748473)X2+( -0.561747880390195)X3+( -62.317719254262)X1X2+( -20.87475499 13392)X₁X₃+( 15.633609490382)X₂X₃+( 0.824961254444346)X₁²+( -0.1041115872 00287)X22

+( 0.688269213237305)X32

兒茶素含量 (μg/mL) Y2=170.837155984506+( 9.6878969409546)X1+( 5.7871980 4753585)X₂+( -0.0197534459328259)X₃+( -17.2001772656257)X₁X₂+( -55.520378 6134916)X1X3+( 27.8567464939771)X2X3+( -1.25156696341903)X12

+( 1.7522603 1006464)X₂²+( 0.439047896386283)X₃²

67

表十四、益生菌發酵金銀花葉萃取物最適條件之三變數三階層反應曲面實驗結果 Table 14. Experiential data of the three variables three levels response surface design for the optimal fermentation condition of honeysuckle leaf extract by probiotics

Runs

68

綠原酸含量 (μg/mL) Y3=181.608325769037+( 2.63333396369137)X1+( -45.88123 4871407)X₂+( 2.63964447806354)X₃+( -34.3730433686334)X₁X₂+( -1.66924609178 013)X1X3+( 39.0170511850731)X2X3+( -16.1206278366112)X12

+( 1.928702723146 75)X₂²+( 2.62302950075644)X₃²

並將結果進行變異數分析如表十五所示，在表中可看兒茶酚、兒茶素與綠原 酸含量模式迴歸具有顯著性差異，表示其模式適合反應性狀之探討；不適合度亦 沒有顯著性差異，所以此迴歸方程式也適合代表真實的反應曲面結果，加上 R ² 值分別高達 99%、97% 與 96% 表示三者的變異大部分可由所選取的控制條件 之變異來解釋，可信度相當高，因此可以將所得到的迴歸方程式進行繪製反應曲 面圖。

圖十八 (A) 為培養溫度 37^oC下探討起始 pH 值以及培養時間對兒茶酚含 量之反應曲面圖。其結果顯示，兒茶酚含量隨起始 pH 值上升而上升。但在 pH 值超過 7.0 後兒茶酚含量便隨起始 pH 值上升而下降，表示在起始 pH 值較高 時並不利於兒茶酚生成。起始 pH 值 7.0 時兒茶酚含量可達最大量。在圖十八 (B) 與 (C) 都有相同的現象。但相較於起始 pH 值，培養時間對兒茶酚含量之 影響不如起始 pH 值，由圖十八 (A) 的結果可以看出兒茶酚含量在 20 hr 前隨 著時間的增加而上升，並在 20 hr 後隨著時間增加而有下降的趨勢。而圖十八 (B) 與 (C) 的結果中亦有相同的情形，表示在培養時間為 20 hr 時其兒茶酚含量可 達最高。將三張圖重疊比較可發現，在培養溫度為的 23^oC 時兒茶酚的含量將有 最大值。

圖十九 (A) 為培養溫度 37^oC 下探討起始 pH 值以及培養時間對兒茶素含 量之反應曲面圖。可圖十九 (A)、(B)、(C) 三圖可歸納出，兒茶素的含量在 23 hr 前會隨時間的增加而上升，並於 23 hr 後含量隨時間增加而下降，由此可得知培 養時間在 23 hr 時兒茶素含量可達最高。起始 pH 值對兒茶素含量影響則較培 養時間明顯。起始 pH 值低於 6.1 時，兒茶素含量則隨 pH 上升而增加，但在 高於 pH 6.1 後兒茶素含量反而隨起始 pH 值得上升而下降，故兒茶素最高含量 在起始 pH 6.1。將三張圖相互比較後可得知培養溫度 23^oC 時可獲得最高含量

69

表十五、最適益生菌發酵金銀花葉萃取物條件之反應曲面試驗設計之變方分析 Table 15. Analysis of variances for the response surface design of the optimum fermentation condition of honeysuckle leaf extract by probiotics

Degree of freedom

Sum of squares

Catechol Catechin Chlorogenic acid Regression 9 20641.80 17118.79 28857.95

Residual 5 105.21 354.39 1037.87 Sum 14 20747.01 17473.18 29895.82 Variability explain (R²) 0.99 0.97 0.96

70

圖十八、培養時間 (hr)、起始 pH、培養溫度 (^oC) 對 catechol 含量影響之反應 曲面圖

Fig. 18 The response surface for the catechol concentration at various culture time, various initial pH and various culture temperature

20

Culture temperature 37^oC

20

Culture temperature 30^oC

20

Culture temperature 23^oC

(A)

(B)

(C)

71

圖十九、 培養時間 (hr)、起始 pH、培養溫度 (^oC) 對 catechin 含量影響之反 應曲面圖

Fig. 19 The response surface for the catechin concentration at various culture time, various initial pH and various culture temperature

60

Culture temperature 37^oC

60

Culture temperature 30^oC

60

Culture temperature 23^oC

(A)

(B)

(C)

72

之兒茶素。

圖二十 (A) 為培養溫度 37^oC 下探討起始 pH 值以及培養時間對綠原酸 含量之反應曲面圖。如圖所示，當培養時間在 23 hr 以下時綠原酸的含量會隨著 時間的增加而增加，並在培養時間為 23 hr 時達最大，23 hr 後則綠原酸含量則 隨時間的增加而降低。起始 pH 值對綠原酸含量的影響則呈現 pH 值越低時其 綠原酸含量則越高，而在 pH 4 時綠原酸含量達最高。上述趨勢於圖二十 (B) 與 (C) 皆可發現，將不同培養溫度的三張圖同時比較則可發現其最大值位於 23^oC 時。

綜合上述結果，兒茶素、兒茶酚及綠原酸含量在 23^oC 有最大值，故以 23^oC 為最適發酵培養溫度。並由圖二十一中可得知在兒茶酚在起始 pH 7.0 培養 20 hr 會有最大值，兒茶素則是在起始 pH 6.1、培養 23 hr 有最大值，綠原酸在起 始 pH 4.0、培養 23 hr 會有最大值。因此選擇多數含量較高之起始 pH 6.5、 培 養時間 21 hr、培養溫度 23^oC 為最適發酵條件。其驗證結果如表十六所示，在 起始 pH 6.5、培養溫度 23^oC、培養時間 21 hr 條件下可得兒茶酚 127 μg/mL、

兒茶素 228 μg/mL、綠原酸 176 μg/mL。相較於未發酵之金銀花葉萃取物，兒茶 酚與兒茶素含量均有顯著提高 (p < 0.05)。且其兒茶酚、兒茶素、綠原酸含量與 起始 pH 6、培養溫度 30^oC、培養時間 24 hr 的條件下所培養之發酵物相比，亦 顯著較高 (p < 0.05)。由此可知，起始 pH 6.5、培養溫度 23^oC、培養時間 21 hr 為最適 L. plantarum 與 S. cerevisiae 發酵金銀花葉萃取物之條件。

第六節、金銀花葉之益生菌發酵物抗疲勞功效

1. 餵食金銀花葉之益生菌發酵物對生理代謝及游泳時間之影響

由表十七可得知，餵食試驗物質十週後動物體重、攝食量與飲水量與 control 組並無顯著差異 (p > 0.05)，代表所餵食之試驗物質對生理代謝無不良之 影響。金銀花葉之益生菌發酵物組其游泳時間如圖二十二，可由圖中發現金銀花 葉之益生菌發酵物組及 catechin 組游泳時間提升至 27 min、27 min 及 26 min。與 control 組相比其游泳時間均有顯著較高 (p < 0.05)。金銀花葉萃取物組

73

圖二十、 培養時間 (hr)、起始 pH、培養溫度 (^oC) 對 chlorogenic acid 含量影 響之反應曲面圖

Fig. 20 The response surface for the chlorogenic acid concentration at various culture time, various initial pH and various culture temperature

100

Culture temperature 37^oC

100

Culture temperature 30^oC

100

Culture temperature 23^oC

(A)

(B)

(C)

74

圖二十一、培養時間與起始 pH 對 catechol、catechin 與 chlorogenic acid 含量 之等高線交疊圖 (培養溫度 23^oC)

Fig. 21 Overlapped contour plot for the concentration of catechol、catechin and chlorogenic acid under culture time and initial pH (culture temperature at 23^oC)

catechin ( g/mL)

(μg/mL)

catechol ( g/mL)

(μg/mL)

chlorogenic acid ( g/mL)

(μg/mL)

75

表十六、益生菌對金銀花葉萃取物最適發酵條件之驗證結果

Table 16. Experiential data of the optimum condition fermentation honeysuckle leaf extract fermentation probiotics

Environmental factors Effectors

Culture time (hr)

Initial pH Culture temperature (^oC)

Catechol concentration

(μg/mL)

Catechin concentration

(μg/mL)

Chlorogenic acid concentration

(μg/mL) Unfermented

honeysuckle leaf extract

- - - 49.2 ± 0.1^a 105 ± 15^a 171 ± 7^ab

Basal condition 24 6 30 102 ± 3^b 145 ± 24^a 168 ± 3^a RSM verification 21 6.5 23 127 ± 20^c 228 ± 26^b 176 ± 4^b Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p<0.05) (n=3).

75

76

表十七、餵食金銀花葉之益生菌發酵物對體重、攝食量與飲水量之影響

Table 17. Effect of probiotic-fermented honeysuckle leaf extract on weight, total food intake and total water intake

Groups

0th week weight (g)

10th week weight (g)

Total food intake (g/cage)

Total water intake (mL/cage) Control 361 ± 11^a 471 ± 37^a 3049 ± 53^ab 6701 ± 976^ab Caffeine 362 ± 12^a 470 ± 22^a 2874 ± 210^a 7271 ± 519^ab H-1X 357 ± 19^a 467 ± 16^a 2886 ± 83^a 6127 ± 68^a LS-1X 360 ± 16^a 479 ± 19^a 2892 ± 92^a 6207 ± 512^a H．LS-1X 358 ± 18^a 480 ± 28^a 2944 ± 73^a 6970 ± 765^ab H．LS-3X 356 ± 18^a 474 ± 30^a 3051 ± 251^ab 6786 ± 1249^ab Catechin 359 ± 11^a 490 ± 26^a 3169 ± 38^b 7687 ± 889^b Control group was orally administrated with RO water. The others rats were administrated with caffeine (Caffeine group;58 mg/kg b.w./d), honeysuckle leaf extract (H-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotics (LS-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotic-fermented honeysuckle leaf extract (H．LS-1X group, H．LS-3X group;7.6 mL/kg b.w./d, 25.3 mL/kg b.w./d) and catechin (catechin group;2 mg/kg b.w./d).

Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p < 0.05) (n=8).

77

圖二十二、餵食金銀花葉之益生菌發酵物對游泳時間之影響

Fig. 22 Effect of probiotic-fermented honeysuckle leaf extract on exhausted swimming time

Control group was orally administrated with RO water. The others rats were administrated with caffeine (Caffeine group;58 mg/kg b.w./d), honeysuckle leaf extract (H-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotics (LS-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotic-fermented honeysuckle leaf extract (H．LS-1X group, H．LS-3X group;7.6 mL/kg b.w./d, 25.3 mL/kg b.w./d) and catechin (catechin group;2 mg/kg b.w./d).

Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p < 0.05) (n=8).

Control caffeine H SL H．SL 0.3 XH．SL 1 X Catechin

Swimm ing ti me (mi n)

0 10 20 30 40 50

Control Caffeine H-1X LS1X H．LS -1X

H．LS -3X

Catechin

a

c

abc

bc bc

ab

bc

78

游泳時間雖有較高但與 control 組相比卻沒有顯著差異 (p > 0.05)，而益生菌組 與 control 組亦無顯著差異 (p > 0.05)，證實發酵物具有提升基礎體力之效果。

2. 餵食金銀花葉之益生菌發酵物對運動表現恢復之影響

經過體能挑戰後可得知發酵物具有提升體力之功效。表十八為游泳力竭試 驗後肌力回復之結果，可發現各組肌力在經過游泳力竭試驗後皆下降，並隨著 休息時間延長而有回升的趨勢，各組肌力大小與肌力下降率與 control 組相比 均無顯著差異 (p > 0.05)。但餵食金銀花之益生菌發酵物及 catechin 組之 30 min 回復率達到約 40%，並顯著高於 control 組 (p < 0.05)，表示發酵物具提 升肌力回復之功效，而金銀花葉之益生菌發酵物三倍劑量組 30 min 回復率與 control 組並無顯著差異 (p > 0.05)。

3. 餵食金銀花葉之益生菌發酵物對游離脂肪酸含量之影響

代謝壓力回復指標結果如表十九至表二十二所示。游離脂肪酸為提供肌肉 運動的能量來源之一，經力竭游泳試驗後游離脂肪酸含量如表十九所示，由結 果可知，在經游泳力竭試驗後游離脂肪酸含量會上升而後下降，但餵食試驗物 質在休息 30 min 與 90 min 後各組游離脂肪酸與 control 組相比均無顯著差 異 (p > 0.05)。control 組於 30 min 游離脂肪酸已停止釋放，而金銀花組及發 酵物組在 30 min 時游離脂肪酸仍在持續釋放。表示餵食金銀花及發酵物能促 進游離脂肪酸在運動後持續提升，進而加速肌肉能量的回復。

4. 餵食金銀花葉之益生菌發酵物對乳酸含量之影響

表二十為游泳力竭試驗後乳酸含量之變化，由結果可發現經過游泳力竭試 驗後乳酸含量會因運動而迅速增加，於休息期間使乳酸經由代謝後而使其含量 逐漸降低。金銀花葉之益生菌發酵物組與 catechin 組在游泳力竭試驗前乳酸含 量為 24 mg/dL、20 mg/dL、20 mg/dL，相較於 control 組其乳酸含量則顯著較

79

表十八、餵食金銀花葉之益生菌發酵物對游泳力竭試驗後肌力回復之影響

Table 18. Effect of probiotic-fermented honeysuckle leaf extract on muscle strength after exhausted swimming

Groups

Muscle strength (g) Increase rate (%)

Recovery rate (%) Before

swimming

0 min 30 min 90 min 30 min 90 min

Control 211 ± 56^a 163 ± 44^a 163 ± 44^a 241 ± 115^a 21.1 ± 16.3^a 0.0 ± 0.0^a 44.5 ± 52.3^a Caffeine 254 ± 70^a 157 ± 43^a 206 ± 42^ab 261 ± 75^a 34.8 ± 21.1^a 35.2 ± 29.5^b 71.0 ± 45.1^a H-1X 234 ± 54^a 139 ± 32^a 162 ± 55^a 202 ± 68^a 38.3 ± 17.2^a 14.3 ± 16.2^ab 43.1 ± 27.1^a LS-1X 211 ± 51^a 162 ± 44^a 198 ± 61^ab 247 ± 82^a 23.3 ± 11.0^a 21.1 ± 18.8^ab 53.1 ± 45^a H．LS-1X 214 ± 54^a 162 ± 35^a 230 ± 55^b 250 ± 49^a 23.2 ± 10.9^a 42.2 ± 19.2^b 55.1 ± 17.3^a H．LS-3X 211 ± 47^a 162 ± 30^a 187 ± 34^ab 216 ± 44^a 18.4 ± 29.2^a 16.6 ± 17.0^ab 35.9 ± 30.8^a Catechin 225 ± 45^a 151 ± 39^a 198 ± 38^ab 225 ± 37^a 31.2 ± 19.4^a 39.8 ± 53.6^b 60.3 ± 63.7^a

Control group was orally administrated with RO water. The others rats were administrated with caffeine (Caffeine group;58 mg/kg b.w./d), honeysuckle leaf extract (H-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotics (LS-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotic-fermented honeysuckle leaf extract (H．LS-1X group, H．LS-3X group;7.6 mL/kg b.w./d, 25.3 mL/kg b.w./d) and catechin (catechin group;2 mg/kg b.w./d).

Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p < 0.05) (n=8).

79

80

表十九、餵食金銀花葉之益生菌發酵物對游泳力竭試驗後游離脂肪酸含量之影響

Table 19. Effect of probiotic-fermented honeysuckle leaf extract on free fatty acids concentration after exhausted swimming.

Groups

Free fatty acids concentration (mmol/L) Increase rate (%)

Recovery rate (%) Before

swimming

0 min 30 min 90 min 30 min 90 min

Control 0.98 ± 0.44^a 1.87 ± 0.49^ab 1.28 ± 0.36^a 1.34 ± 0.47^a 138 ± 157^a 29.8 ± 15.3^b 23.6 ± 35.3^a Caffeine 1.24 ± 0.23^a 1.94 ± 0.55^ab 1.49 ± 0.32^a 1.53 ± 0.74^a 55 ± 32^a 19.0 ± 25.4^ab 13.3 ± 54.5^a H-1X 0.95 ± 0.68^a 1.51 ± 0.44^a 1.44 ± 0.31^a 1.62 ± 0.59^a 111 ± 110^a -1.1 ± 34.4^a -12.1 ± 40.5^a LS-1X 0.99 ± 0.54^a 2.14 ± 0.35^b 1.83 ± 0.47^a 1.66 ± 0.47^a 160 ± 115^a 13.5 ± 22.8^ab 18.3 ± 37.5^a H．LS-1X 0.91 ± 0.32^a 1.55 ± 0.39^a 1.69 ± 0.48^a 1.67 ± 0.33^a 90 ± 86^a -10.5 ± 31.4^a -11.6 ± 30.6^a H．LS-3X 0.94 ± 0.29^a 1.60 ± 0.51^ab 1.74 ± 0.81^a 1.67 ± 0.58^a 74 ± 36^a -6.7 ± 27.1^a -11.4 ± 43.2^a Catechin 0.91 ± 0.51^a 1.83 ± 0.74^ab 1.71 ± 0.41^a 1.91 ± 0.36^a 148 ± 143^a -2.0 ± 32.7^a -14.3 ± 34.5^a Control group was orally administrated with RO water. The others rats were administrated with caffeine (Caffeine group;58 mg/kg b.w./d), honeysuckle leaf extract (H-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotics (LS-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotic-fermented honeysuckle leaf extract (H．LS-1X group, H．LS-3X group;7.6 mL/kg b.w./d, 25.3 mL/kg b.w./d) and catechin (catechin group;2 mg/kg b.w./d).

Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p < 0.05) (n=8).

80

81

表二十、餵食金銀花葉之益生菌發酵物對游泳力竭試驗後乳酸含量之影響 Table 20. Effect of probiotic-fermented honeysuckle leaf extract on lactate concentration after exhausted swimming

Groups

Lactate concentration (mg/dL) Before

swimming

0 min 30 min 90 min

Control 40.2 ± 13.2^bc 162 ± 30^b 106.7 ± 40.5^b 64.6 ± 36.3^b Caffeine 33.6 ± 8.7^abc 137 ± 25^ab 77.0 ± 18.7^ab 49.2 ± 15.0^ab H-1X 44.4 ± 30.1^c 141 ± 58^ab 82.5 ± 25.3^ab 43.3 ± 10.8^ab LS-1X 25.8 ± 11.6^ab 145 ± 72^ab 61.3 ± 34.1^a 40.1 ± 23.6^ab H．LS-1X 23.7 ± 6.7^a 94 ± 36^a 69.4 ± 25.1^a 46.1 ± 23.8^ab H．LS-3X 19.6 ± 6.4^a 106 ± 47^a 64.3 ± 40.7^a 33.6 ± 25.5^a Catechin 19.8 ± 12.6^a 109 ± 30^a 61.5 ± 20.1^a 37.6 ± 15.3^a Control group was orally administrated with RO water. The others rats were administrated with caffeine (Caffeine group;58 mg/kg b.w./d), honeysuckle leaf extract (H-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotics (LS-1X group;7.6 mL/kg b.w./d), probiotic-fermented honeysuckle leaf extract (H．LS-1X group, H．LS-3X group;7.6 mL/kg b.w./d, 25.3 mL/kg b.w./d) and catechin (catechin group;2 mg/kg b.w./d).

Mean values within each column with different superscripts are significantly different (p < 0.05) (n=8).

82

低 (p < 0.05)。經游泳力竭試驗後，金銀花葉之發酵物組與 catechin 組的乳酸 含量仍顯著低於 control 組 (p < 0.05)。在休息 30 min 後則餵食益生菌組乳酸 含量顯著低於 control 組 (p < 0.05)，而發酵物及 catechin 各組乳酸含量依然 與 control 組具顯著差異 (p < 0.05)。休息 90 min 後餵食發酵物一倍劑量組及 catechin 組有顯著低於 control 組 (p < 0.05)，其餘各組乳酸含量並無差異 (p >

0.05)。其結果顯示益生菌、金銀花發酵物及 catechin 可提升乳酸的代謝率而加

0.05)。其結果顯示益生菌、金銀花發酵物及 catechin 可提升乳酸的代謝率而加

在文檔中 國立臺東大學 生命科學系 碩士論文 (頁 78-102)