第三章、 實驗材料與方法
第二節、 實驗方法
以傳統鑑定法針對金銀花莖部、葉部及花部的外觀型態、生長型態進行比 對，並以 Wanger 於 1999 年中對於 Lonicera japonica 外觀型態敘述作為鑑定 之依據 (Wagner et al.,1999)。另與台東藥用植物學會提供之金銀花植株進行外觀 比對。
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第二部分菌種來源及培養 1. 菌種選擇
過去研究利用不同乳酸菌進行共培養發酵海帶萃取物，發現以 L. plantarum subsp. plantarum BCRC 10069 與 L. plantarum BCRC 12250 共培養時期有機 酸含量與乳酸菌數皆為各試驗組中之最高者 (吳等，2010)。另有研究以 L.
plantarum subsp. plantarum BCRC 10069 與 L. plantarum BCRC 12250 發酵山 藥之乳酸優酪乳餵食高油脂飲食大鼠，發現發酵物具有提高糞便中三酸甘油脂 的含量。增加糞便中乳酸菌與總厭氧菌的數量減少肝臟中脂質的堆積 (江等，
2005)。因此，乳酸菌菌株選用 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum BCRC 10069、Lactobacillus plantarum BCRC 12250。
過去研究以 Saccharomyces cerevisiae 發酵麵包，其具有降低血清中低密度 脂蛋白含量及肝臟中膽固醇之效果 (Kim et al., 2011)。且 Saccharomyces cerevisiae BCRC 22905 為食品中所分離之菌株，故選用此菌株做為試驗菌株。
2. 菌種來源
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum BCRC 10069 、 Lactobacillus plantarum BCRC 12250 與 Saccharomyces cerevisiae BCRC 22905 皆購自食品 工業發展研究所生物資源保存中心 (Hsinchu，Taiwan)。L. plantarum 以 MRS 培養基作為平面培養基，於 37oC 培養 48 hr，並至於 4oC 冰箱中保存。S.
cerevisiae 以 YPD 培養基作為平面培養基，於 28oC 培養 48 hr，並至於 4oC 冰箱中保存。
3. 種菌培養
將培養 48 hr 後的 L. plantarum 與 S. cerevisiae 的平面培養基，以 loop 取一菌落分別接入 100 mL 之 MRS broth 與 YPD broth 中，L. plantarum 以起 始 pH 值為 6.5、培養溫度 37oC 靜置培養，而 S. cerevisiae 則以起始 pH 值 為 6.5、培養溫度 28oC、100 rpm 振盪培養培養至對數生長期 (log phase) 與 菌數穩定期 (stationary phase)，進入實驗階段。
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根據前人研究，初步設定以 YPD broth 作為共培養之培養基 (Kawarai et al., 2007)，實驗過程中將進一步比較為 YPD broth 與 MRS broth 及兩者混合之 培養基對於第一階段菌數生長之效果。
4. L. plantarum 與 S. cerevisiae 之基礎培養條件
L. plantarum 液 態 培 養 條 件 : Lactobacillus plantarum subsp. plantarum BCRC 10069、Lactobacillus plantarum BCRC 12250 種菌培養液各取 5 mL 置於 含 100 mL 共培養之培養液的血清瓶中，此為 5% 接種量，並以靜置培養進行 最共培養條件之探討。S. cerevisiae 液態培養條件:取 5 mL 種菌培養液置於含 100 mL 培養之培養液的血清瓶中，此為 5% 接種量，並以 100 rpm 振盪培養 進行培養條件之探討。
5. 探討 L. plantarum 與 S. cerevisiae 最適培養條件
選擇三種因子 (X1、X2、X3)，以反應曲面法找出最適培養條件。本實驗 採用 Box 和 Behnken 所提出的三變數三階層之中心旋轉 (three-variable and three level central rotatable design) 及反應曲面法實驗設計。以 (X1、X2、X3) 為 變數因子，每一變數有三階數值，經編碼後分別以標準值 -1、0、+1 代表，每 個平面皆有一可旋轉之中心點 (座標為 0，0，0) 進行重複實驗。以此中心向 兩端各擴展一單位，因此本實驗設計共有 15 組試驗點數。
RSM 之實驗設計如表二所示，X1、X2、X3 之變數因子分別為培養溫度、
起始 pH 值與培養時間。試驗後分析各組之益生菌菌數 (Y) 作為反應性狀，
所得數據再以 Microsoft Excel 中的數據回歸程式進行分析，可得益生菌群之菌 數模式之回歸係數值，並以此求得下列之三變數二次方程式:
Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A12X1X2+A13X1X3+A23X2X3+A11X12+A22X22+A33X32 (A 表示各項係數)。
進行變異數分析可以得到變異度 (R2)、不適合度 (lack of fit)、顯著性、回 歸方程式之各項細數及各因子對反應觀測值的顯著程度，再將求得之回歸方程
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式利用 Sigma plot 10.0 統計與繪圖軟體完成反應曲面圖及等高線圖繪製，找出 最適培養條件。
第三部分 金銀花葉萃取物之益生菌發酵 1. 金銀花葉萃取物之製備
自台東大學採集新鮮之野生金銀花葉放置 50oC 熱風烘箱中，待烘乾後 以研磨機研磨成粉末以進行萃取。秤取 25 g 金銀花葉加水至 500 mL 搖勻。
於 50 oC 水浴 30 min、60 min、120 min 進行萃取時間之篩選，再以所得之萃 取時間於 37oC、50oC、90oC 進行萃取溫度篩選。萃取物以抽氣過濾將殘渣過 濾。取得含有 5% 金銀花葉水萃物之水溶液，以此溶液配製基礎培養基 MRS．
L (2% tryptone、1% yeast extract、0.2% K2HPO4、0.4% triammonium citrate、0.5%
sodium acetate、0.028% MnSO4、0.058% MgSO4、0.074%CaCl2、0.1% Tween 80、
2% Dextrose) (Tada et al., 2007)。
2. 益生菌共培養金銀花葉萃取物之成分變化
利用第一階段所得之最適培養條件，培養 L. plantarum 與 S. cerevisiae 各 100 mL 菌液並以 950 g 離心 5 min 後去除上清液取得菌體，分別將菌體 加入含有 5% 金銀花葉水萃物之 MRS．L 基礎培養基進行發酵。於發酵 0 hr、12 hr、24 hr 及 30 hr 進行採樣。
3. 益生菌共培養金銀花葉萃取物之菌數變化
L. plantarum 以 pour plate 方式進行活菌數計數。培養基為 MRS agar，
於 37oC 培養 48 hr 後進行計數。S. cerevisiae 則以 spread plate 方式進行活菌 數計數。培養基為 YPD agar，於 28oC 培養 36 hr 後進行計數。
4. 益生菌對酚類代謝之探討
利用第一階段所得之最適培養條件，將益生菌菌體加入含有 300 μg/mL 兒
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茶酚、兒茶素及綠原酸標準品之 MRS．L 基礎培養基進行發酵。於發酵 0 hr、
12 hr、18 hr 及 24 hr 進行採樣。檢測兒茶酚、兒茶素及綠原酸之含量變化。
5. 單因子條件探討
探討起始 pH 與培養溫度對多酚成分之影響。將含有 5% 金銀花葉水萃物 之 MRS．L 基礎培養基的起始 pH 以 HCl 及 NaOH 定至 pH 4、pH 6 及 pH 8 ，接入以最適培養條件培養之益生菌菌體於 30oC 培養 24 hr 後檢測其兒茶 酚、兒茶素及綠原酸之變化。起始 pH 6 之金銀花葉水萃物之 MRS．L 基礎 培養基接菌後分別培養於 23oC、30oC 及 37oC 下，培養 24 hr 後檢測其兒茶 酚、兒茶素及綠原酸之變化。
6. 探討益生菌群最適發酵金銀花葉萃取物之條件
RSM 之實驗設計如表三所示，X1、X2、X3 之變數因子分別為培養時間、
起始 pH 值與培養溫度。試驗後分析各組發酵液之有兒茶酚含量 (Y1)、兒茶素 含量 (Y2) 與綠原酸含量 (Y3) 作為反應性狀，所得數據再以 Microsoft Excel 中的數據回歸程式進行分析，可得益生菌群之各酚類含量模式之回歸係數值，
並以此求得下列之三變數二次方程式:
Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A12X1X2+A13X1X3+A23X2X3+A11X12+A22X22+A33X32 (A 表示各項係數)
進行變異數分析可以得到變異度 (R2)、不適合度 (lack of fit)、顯著性、回 歸方程式之各項細數及各因子對反應觀測值的顯著程度，再將求得之回歸方程 式利用 Sigma plot 10.0 統計與繪圖軟體完成反應曲面圖及等高線圖繪製，找出 最適發酵條件。
7. 金銀花葉萃取物成分分析
以 HPLC 測定發酵液中兒茶酚、兒茶素與綠原酸含量，並以兒茶酚、兒 茶素與綠原酸之標準品製作檢量線，並以內插法求得濃度。HPLC 條件如表四
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所示。
第四部分 抗疲勞動物試驗 一、實驗動物飼養與實驗時程
動物飼養及照顧方法根據 Chen 等人之研究方法 (Chen et al., 2008)。本研 究中所採用之動物為購自樂斯科 Sprague Dawley (SD) 品系雄性大鼠，週齡為 10 週齡，每組 8 隻，共七組，分別為控制組、咖啡因組、金銀花組、益生菌 組、發酵物一倍劑量組、發酵物三倍劑量組及 Catechin 組。咖啡因組餵食咖 啡因，金銀花組餵食金銀花葉萃取物之水溶液、益生菌組則餵食含 9.06 log CFU/mL 之 L. plantarum 與 7.22 log CFU/mL 之 S. cerevisiae 菌液、金銀花 葉之益生菌發酵物一倍劑量組及金銀花葉之益生菌發酵物三倍劑量組則餵食金 銀花葉之益生菌發酵物一倍劑量及三倍劑量、Catechin 組餵食 catechin。飼養 於控制相對溼度 60%，室溫 25oC，光照時間為 8:00~20:00 之 12 hr 光照循 環。依規定控制動物室控制溫度、清潔及燈光調節，並保持安靜。飲水以逆滲 透水隨時補給；墊料每 2 天換一次；飼料須保持充足，而餵食採取自由攝食方 式進行。大鼠預養 2 週後，進行實驗分組後，開始進行 10 週的正式實驗。每 週測定攝食量與體重，實驗時程如圖八所示。
二、餵食劑量之計算方法
人體與高等實驗動物間試驗劑量之換算，根據 2005 年美國食品藥物管 理局 (US Food and Drug Administrtion, 2005) 所公告之實驗初期估算方法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)，而以 60 kg 之成人為基準，使用高等實驗動物進行 試驗時，劑量之換算原則上以人體每日每公斤體重之建議攝取量的 6.2 倍為大 鼠之 1 倍劑量。各組餵食劑量如表五所示。
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表二、L. plantarum 與 S. cerevisiae 最適培養條件之 RSM 三變數-三階層之中 心旋轉組合設計
Table 2. The response surface design of the optimum culture condition to L.
plantarum and S. cerevisiae
Runs
Response value Code value Initial pH value Culture temperature
(oC)
Culture time
(hr) X1 X2 X3
1 8 37 18 1 1 0
2 8 19 18 1 -1 0
3 4 37 18 -1 1 0
4 4 28 18 -1 -1 0
5 8 28 24 1 0 1
6 8 28 12 1 0 -1
7 4 28 24 -1 0 1
8 4 28 12 -1 0 -1
9 6 37 24 0 1 1
10 6 37 12 0 1 -1
11 6 19 24 0 -1 1
12 6 19 12 0 -1 -1
13 6 28 18 0 0 0
14 6 28 18 0 0 0
15 6 28 18 0 0 0
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表三、最適發酵金銀花葉萃取物之 RSM 三變數-三階層之中心旋轉組合設計 Table 3. The response surface design of the optimum fermentation condition of honeysuckle leaf extract by probiotics
Runs
Response value Code value Culture time
(hr)
Initial pH value Culture temperature
(oC) X1 X2 X3
1 30 8 30 1 1 0
2 30 4 30 1 -1 0
3 12 8 30 -1 1 0
4 12 4 30 -1 -1 0
5 30 6 37 1 0 1
6 30 6 23 1 0 -1
7 12 6 37 -1 0 1
8 12 6 23 -1 0 -1
9 21 8 37 0 1 1
10 21 8 23 0 1 -1
11 21 4 37 0 -1 1
12 21 4 23 0 -1 -1
13 21 6 30 0 0 0
14 21 6 30 0 0 0
15 21 6 30 0 0 0
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三、動物犧牲 (sacrifice) 法
於游泳力竭試驗及運動表現恢復評量後以二氧化碳窒息犧牲老鼠。確定老 鼠無呼吸心跳開始準備解剖、抽血。
1. 臟器處理
解剖動物後取其肝臟、腎臟周圍脂肪組織及大腿肌肉。肝臟需以 10 mL 之 針筒及生理食鹽水注入肝臟血管中，將血液洗滌出後放置夾鏈袋。脂肪組織浸 泡至生理食鹽水中，將血水去除後放置夾鏈袋。大腿肌肉則取下後直接放入夾 鏈袋。所有臟器需立刻放置於液態氮，並儲存於 -80oC 冷凍備用，以便評估相 關因子表現。
四、體能挑戰 1. 游泳力竭試驗
運動後通常造成肌肉損傷 (muscle damage)、發炎與氧化傷害 (oxidative damage) 增加、疼痛、肌力衰退。上述指標回復到運動前水準的快慢可反映疲 勞恢復的程度。
(1) 實驗前一週，在餵食 30 min 後，先進行游泳適應。
(2) 在試驗前禁食 4 hr，將大鼠放入直徑 50 cm、水深 80 cm、水溫 27±1 oC的 塑膠桶中進行負重游泳，負重比率為體重之 5%，強迫大鼠進行游泳掙扎，直到 體力消耗殆盡下沉為止，計算自落水開始至鼻孔沉入水中 10 秒即為游泳時間。
五、疲勞恢復指標之評量
經過體能挑戰後，疲勞恢復指標將產生改變，為了解試驗物質是否有加速 恢復的功效，測定游泳後 0、30、90 min 之各項指標，並計算游泳前後的上升 率及游泳後的回復率。
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表四、Polyphenol 之 HPLC 分析條件
Table 4. The polyphenol analysis conditions of HPLC
Column RP-18 GP 250-4.6 (5μm) Kanto Chemical Co. Inc, Tokyo, Japan Gradient solvent Solvent A:MeOH
Solvent B: 9% acetic acid
Gradient elution 0 – 4 min 0% Solvent A 0 – 4 min 100% Solvent B 4 – 30 min 0 – 0.1% Solvent A 4 – 30 min 100 – 99.9% Solvent B Photodiode array 230 nm – 450 nm
Pump L - 2130 HTA pump, Hitachi, Tokyo, Japan
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圖八、抗疲勞動物實驗日程
Fig. 8 The schedule of animal test for anti-fatigue 游泳力竭試驗 疲勞恢復指標分析 游泳訓練
0 week
-1 weeks 10 weeks
-2 weeks
正式實驗
9 weeks 爬梯訓練
運動表現恢復 代謝指標
運動表現恢復 代謝指標