使用 Hewlett-Packard HP-8453 紫外光可見光光譜儀，並且搭配 Agilent UV-visible ChemStation software 軟體，偵測六種鹵化安非他命 的紫外光吸收。
圖 4-1 為紫外光吸收測量的結果，波長的測量範圍選在 190 -300 nm，六種鹵化安非他命特徵波長約在 260 nm-280 nm 附近，最高峰 ortho-fluoroamphetamine:262 nm, meta-fluoroamphetamine:262 nm, para-fluoroamphetamine:265 nm, ortho-chloroamphetamine:266 nm, meta-chloroamphetamine:267 nm, para-chloroamphetamine:267 nm。.
圖 4-1 六種鹵化安非他命的吸收光譜圖，濃度均為 100 mg/L a. para-fluoroamphetamine (265 nm)
b. meta- fluoroamphetamine (262 nm) c. ortho-fluoroamphetamine (262 nm) d. para-chloroamphetamine (267 nm) e. meta- chloroamphetamine (267 nm)
4-2 毛細管區帶電泳(CZE)條件確立
(一) 緩衝溶液配製
將 50 mM NaH2PO4、100 mM Na2HPO4及 7.5 mM ß-CD 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積比 70/17.5/12.5 的混合溶液中，以 H3PO4將 pH 值調整至 3.15。此最佳化條件所跑出來的電泳圖如圖 4-3。
(二) 緩衝溶液未添加 ß-CD
為了確定緩衝溶液的最佳條件，一開始先不添加 ß-CD，使用的 緩衝溶液為 50 mM NaH2PO4及 100 mM Na2HPO4配製於
H2O/MeOH/ACN 體積比 70/17.5/12.5 的混合溶液中，以 H3PO4將 pH 值調整至 3.15。跑出來的電泳圖如圖 4-2 所示，發現 meta-、
para-chloroamphetamine 無法分離。
(三) 分析樣品配製
將六種鹵化安非他命的粉末溶於甲醇中，配製成濃度為 100 mg/L 的 6-mix 混合溶液。
(四) 樣品進樣方式
注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端 約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。
圖 4-2 緩衝溶液未添加 ß-CD 電泳圖
毛細管 : 全長 50 cm，有效長度 41 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4
H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 六種鹵化安非他命混合物
虹吸進樣時間 : 5 秒 偵測波長 : 214 nm 電壓 : 15 kV
Time (s)
Intensity (mV)
23.5
0
o m
p
p m
o
圖 4-3 最佳化緩衝溶液的 CZE 電泳圖
毛細管 : 全長 50 cm，有效長度 41 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15
分析物 : 100 mg/L 六種鹵化安非他命混合物 虹吸進樣時間 : 5 秒
偵測波長 : 214 nm 電壓 : 15 kV
Time (s)
Intensity (mV)
20
0
o
o
m m p p
4-3 以電動進樣方法偵測氟、氯安非他命
(一) 緩衝溶液
和前一章節所提到的 CZE 緩衝溶液一樣。
(二) 進樣方式
將材料放入塑膠管中，泡至配製在緩衝溶液中的樣品溶液五分 鐘，將拉細一端的塑膠管置於毛細管進樣端後置於緩衝溶液中，電動 進樣的電壓約為電泳電壓的 1/3-1/2 大小，進樣時間約 30-60 秒，進 樣完成後把塑膠管取下再跑電泳圖。
(三) 材料選擇
電動進樣的材質選用三種，分別是濾紙、J. T. Baker 固相萃取 C18
管柱中的粉末，以及台北醫學大學生醫材料暨工程研究所的陳建中教 授實驗室所合成的 50 % PLA 中空纖維，所得到的電泳圖分別為圖 4-4、4-5、4-6，所測的樣品濃度有 100 mg/L 和 10 mg/L 兩種。表 4-1 為三種材質電動進樣和虹吸進樣所得電泳圖之鄰-氟安非他命 S/N 比 統整出的表格。由於當樣品濃度為 10 mg/L 時，以抬高虹吸進樣之方 法無法測到訊號，但由電動進樣的方法發現 S/N 比約可提高十倍，
同樣大小 1 cm*0.1 cm 的濾紙和 50 % PLA 中空纖維重量分別約為 431.41 µg 和 57.87 µg，濾紙的重量約為中空纖維的 7.5 倍。
(四) 固相萃取效果的探討
由於一次電動進樣無法將樣品溶液全部從材料中電出，為了探 討萃取效果，以 50 % PLA 中空纖維當材料，發現電泳圖由第一次到 第四次，每次都可以維持良好的 S/N 比，直至第五次 S/N 比有顯著
圖 4-4 以 50 % PLA 中空纖維電動進樣電泳圖 毛細管 : 全長 74 cm，有效長度 60 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15
分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) 電動進樣時間 : 60 秒；進樣電壓 : 5 kV
Time (s)
Intensity (mV)
4.0
0
0 0.7
o
m p
p m o
o o m
p m p
圖 4-5 以濾紙電動進樣電泳圖 毛細管 : 全長 74 cm，有效長度 60 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15
分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) Time (s)
Intensity (mV)
o
o
m m
p p
p o p
o m
m
5.5
0
0 1.2
圖 4-6 以固相萃取粉末電動進樣的電泳圖 毛細管 : 全長 84 cm，有效長度 70 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15
分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) 電動進樣時間 : 30 秒；進樣電壓 : 9 kV
Time (s)
Intensity (mV)
0.5
0 0 0.25
o m p o
m p
o m
m p o
p
進樣方式 濃度 s/n 比 (n=5) 進樣時間 虹吸進樣 100 ppm 10.23 ± 0.32 5 秒
10 ppm 無法測到 5 秒
電動進樣 (50 % PLA)
100 ppm 106.33 ± 0.78 60 秒 10 ppm 13.70 ± 0.84 60 秒 電動進樣
(濾紙)
100 ppm 110.70 ± 0.53 60 秒 10 ppm 10.83 ± 0.49 60 秒 電動進樣
(SPE 粉末)
100 ppm 18.48 ± 0.78 30 秒 10 ppm 8.11 ± 0.66 30 秒
表 4-1 電動進樣和抬高虹吸進樣所得電泳圖之 S/N 比
圖 4-7 探討電動進樣固相萃取效果的電泳圖 毛細管 : 全長 84 cm，有效長度 70 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15
分析物 : 100 mg/L 混合物 (上圖:第一次；下圖:第四次) 電動進樣時間 : 30 秒；進樣電壓 : 9 kV
偵測波長 : 214 nm；電壓 : 18 kV Time (s)
Intensity (mV)
o m p
m p o
o o m
m
p p
0.5
0 0.65
0
4-4 毛細管微胞電動層析(MEKC)及線上掃集濃縮 (sweeping-MEKC)電泳條件探討
由於毛細管區帶電泳(CZE)對分析物的偵測靈敏度較差，在毛細 管電泳中，一般會使用微胞電動層析法(MEKC)以及線上掃集濃縮技 術(sweeping-MEKC)來改善靈敏度不佳的問題，而線上掃集的方法和 微胞電動層析相比靈敏度較好。圖 4-8 為毛細管微胞電動層析法的電 泳圖，圖 4-9 為線上掃集濃縮技術的電泳圖。
4-5 最佳化 MEKC 電泳條件確立
(一) 緩衝溶液
將 50 mM NaH2PO4及 90 mM SDS 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積 比 65/20/15 的混合溶液中，以 H3PO4將 pH 值調整至 2.15。此最佳化 條件的電泳圖如圖 4-8。
(二) 分析樣品配製
將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度為 25 mg/L 的 6-mix 混合溶液。
(三) 樣品進樣方式
注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端 約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。
圖 4-8 最佳化背景溶液的 MEKC 電泳圖
毛細管 : 全長 65 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；90 mM SDS
H2O/MeOH/ACN (65/20/15,v/v)；pH=2.15 分析物 : 25 mg/L 六種鹵化安非他命混合物
虹吸進樣時間 : 5 秒 偵測波長 : 214 nm 電壓 : -18 kV
Time (s)
Intensity (mV)
0.014
0
p
p m
m o
o
4-6 最佳化 sweeping-MEKC 電泳條件確立
(一) 緩衝溶液
將 50 mM NaH2PO4及 75 mM SDS 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積 比 65/30/5 的混合溶液中，以 H3PO4將 pH 值調整至 2.15。此最佳化 條件所跑出來的電泳圖如圖 4-9。
(二) 非微胞緩衝溶液
配製條件與緩衝溶液組成相同，但不含界面活性劑 SDS 的溶液。
(三) 分析樣品配製
將保存於去離子水中的六種鹵化安非他命混合物溶液，以非微 胞背景溶液稀釋至想要分析的濃度。
(四) 樣品進樣方式
先測樣品在毛細管中的流速，如圖 4-10，流速約 0.26 mm/s。將 待測樣品抬高虹吸進樣，注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，
進樣時間由實驗幾次後得到最佳化的結果約 9 分鐘，換算進樣長度約 為 13.8 cm。
圖 4-9 最佳化的 sweeping-MEKC 電泳圖
毛細管 : 全長 75 cm，有效長度 61 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；75 mM SDS
H2O/MeOH/ACN (65/30/5,v/v)；pH=2.15
分析物 : 1 mg/L 六種鹵化安非他命混合物溶於非微胞背景溶液 虹吸進樣長度 : 13.8 cm
偵測波長 : 214 nm 電壓 : -22 kV
Time (s)
Intensity (mV)
0.005 0.045
p
p m
m o
o
圖 4-10 sweeping-MEKC 流速圖
毛細管 : 全長 75 cm，有效長度 61 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；75 mM SDS
H2O/MeOH/ACN (65/30/5,v/v)；pH=2.15
分析物 : 1 mg/L 六種鹵化安非他命混合物溶於非微胞背景溶液 偵測波長 : 214 nm
樣品抵達偵測窗時間 : 2390 s 流速 : 0.26 mm/s
Time (s)
Intensity (mV)
Part II. 以毛細管螢光電泳儀偵測氯、氟安非他命
由於毛細管螢光電泳和紫外光電泳相比之下，靈敏度較高，為 了增加偵測靈敏度選用兩種收光器 PMT 和 CCD 來收光，
4-7 氯、氟安非他命衍生後螢光光譜量測
在使用毛細管螢光電泳儀前，需先知道鹵化安非他命衍生後的 螢光範圍，將安非他命和衍生試劑 FITC 反應 12 小時候拿去偵測放 光，圖 4-11 為六種鹵化安非他命衍生後所測得的螢光光譜，偵測範 圍選在 480 -680 nm，FITC 本身的螢光波長大約在 488 nm，和鹵化 安非他命衍生後的螢光放光特徵波長約落在 520 nm-580 nm，最高峰 分別為 ortho-fluoroamphetamine:547 nm, meta-fluoroamphetamine:545 nm, para-fluoroamphetamine:547 nm, ortho-chloroamphetamine:547 nm, meta-chloroamphetamine:546 nm, para-chloroamphetamine:542 nm，所 以之後實驗偵測波長鎖定在 550 nm。
之後跑電泳實驗所使用的光源為 100 mW 的藍光雷射光源，其最 強發光波長約在 473 nm，發光範圍約在 440-520 nm 之間。實驗以藍 光雷射為激發光源，需選擇適當的光學濾片，隔絕掉 520 nm 之前的 光源干擾。
圖 4-11 六種安非他命衍生後的螢光放光光譜圖，濃度為 1 mg/L a. para-fluoroamphetamine (547 nm)
b. meta- fluoroamphetamine (545 nm) c. ortho-fluoroamphetamine (547 nm) d. para-chloroamphetamine (542 nm) e. meta- chloroamphetamine (546 nm)
Fluorescence Intensity
Wavelength (nm)
4-8 衍生試劑 FITC 反應之探討
由於分析物六種鹵化安非他命本身的螢光強度較弱，為了使其 螢光性質更為明顯，此部分嘗試利用衍生技術來進行實驗。所選用的 衍生試劑為異硫氰酸螢光黃(fluorescein isothiocyanate isomer I)，簡稱 FITC，在鹼性的環境下與分析物進行衍生反應之後，所得到的六種 衍生物即為本實驗的分析樣品，圖 4-12 為六種鹵化安非他命與 FITC 進行衍生反應之反應式。
FITC 衍生試劑一般常用來針對一級胺類和二級胺類藥物進行衍 生，而本實驗所用的鹵化安非他命系列藥物即為一級胺類，故適用於 FITC 衍生，且經由實驗測試之後，發現其衍生物螢光強度強且再現 性佳，故 FITC 十分適合用於衍生本研究的分析物。
由於 FITC 衍生試劑在水中會產生水解反應[83]，形成螢光黃胺 (fluorescein amine)，並與 FITC 進行衍生反應，故衍生反應中會伴隨 一些副產物，在電泳圖中可以看見這些副產物的譜峰，圖 4-13 即為 FITC 水解反應之反應式。此外，由於反應中 FITC 衍生試劑是過量 添加來進行實驗，衍生產物中也會存在未反應完的 FITC 試劑。
圖 4-12 六種鹵化安非他命與 FITC 進行衍生之反應式
圖 4-13 FITC 水解之反應式
4-9 使用光電倍增管偵測分析物產生的螢光
(一) 緩衝溶液
將 75 mM SDS 配製於 10 mM sodium tetraborate 溶液中，以 0.1 M 的 NaOH 將 pH 值調整至 9.70。以 PMT 當收光儀，此最佳化條件的 電泳圖如圖 4-14。
(二) 分析樣品配製
將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度各為 20 mg/L 的混合溶液，取 100 µL 的混合液和 50 µL 10 mM sodium tetraborate 均勻混合後，加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中，
在暗處衍生 12 小時，最後以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，
得到欲分析的濃度 0.5 mg/L。
(三) 樣品進樣方式
注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端 約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。
(四) 檢量線
利用上述所獲得的 MEKC 最佳化實驗條件來製作檢量線，六種 鹵化安非他命衍生分析物以 0.10、0.075、0.05 mg/L (ppm)，以及 25、
12.5 µg/L (ppb)五種濃度進行毛細管電泳，再以各分析物所產生的譜 峰面積進行檢量線的製作，圖 4-15 為製作的檢量線圖。由於 meta-和 para-fluoroamphetamine 在低濃度時不易分離，所以將這兩種化合 物合併製作一條檢量線。
圖 4-14 毛細管螢光電泳的 MEKC 電泳圖
毛細管 : 全長 55 cm，有效長度 45 cm，內徑 50 µm
緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate； pH=9.70 分析物 : 0.5 mg/L 六種鹵化安非他命室溫衍生 12 小時混合物 虹吸進樣時間 : 2 秒
偵測波長 : 550 nm 電壓 : 13 kV
PMT 電壓 : -900 V
Time (min)
Fluorescence Intensity
o m
m
m p
o p
p
圖 4-15 六種鹵化安非他命衍生後的檢量線圖
ortho-fluoroamphetamine y = 189.41x + 0.1891 R2 = 0.9991 meta-、para-fluoroamphetamine y = 235.45x + 0.3263 R2 = 0.9990 ortho-chloroamphetamine y = 123.08x + 0.3745 R2 = 0.9955 meta-chloroamphetamine y = 107.76x + 0.3719 R2 = 0.9966 para-chloroamphetamine y = 137.32x + 0.2588 R2 = 0.9976
4-10 使用 CCD 偵測分析物產生的螢光
(一) 緩衝溶液
將 75 mM SDS 配製於 10 mM sodium tetraborate 溶液中，以 0.1 M 的 NaOH 將 pH 值調整至 9.70。以 CCD 當收光儀，此最佳化條件的 電泳圖如圖 4-16。
(二) 分析樣品配製
將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度各為 2 mg/L 的混合溶液，取 100 µL 的混合液和 50 µL 10 mM sodium
tetraborate 均勻混合後，加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中，
在暗處衍生 12 小時，最後以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，
得到欲分析的濃度 50 µg/L。
(三) 樣品進樣方式
注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端 約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。
注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端 約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。