利用毛細管紫外光/螢光電泳及紙噴灑技術對六種鹵化安非他命狡詐家濫用藥物的分析研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授︰林震煌博士（Cheng-Huang Lin）. 利用毛細管紫外光/螢光電泳及紙噴灑技術對六種鹵化安非他命狡詐家濫用藥物的分析研究. Determination of Six Halogen Amphetamines Designer Drugs by Capillary Electrophoresis Ultraviolet Absorbance/Laser-Induced Fluorescence and Paper Spray. 研究生：李珣（Hsun Lee）中華民國一百零一年六月.

(2) 謝誌晃眼即逝，兩年的研究生涯就要在此畫下句點了，這段時間受到很多人的幫助與鼓勵，如今希望能和你們共享我的喜悅。首先要感謝我的指導教授–林震煌博士的悉心教導與栽培，給予我許多實驗上的指導與建議，讓我順利完成論文。在口試期間，感謝呂家榮教授及丁望賢教授不辭辛勞的來聆聽，並給予指正與建議，使得本論文更加完善。一路走來，很感謝實驗室各位學長姐在實驗上的幫助，特別感謝怡珊、建宏、嘉嘉、伊璿，你們總是提供了我很多做實驗的方法與方向，感謝同屆的冠甫、智勝，謝謝你們總是幫我架設儀器並討論實驗，很開心可以一起畢業了。另外也很感謝實驗室的學弟妹卉馨、亞薇、榮華、建霖、桓安，你們五位總是帶給實驗室歡樂，希望這個好氣氛可以一直延續下去，也祝福你們實驗順利。最後，我要感謝我的家人以及朋友，謝謝李先生和李小姐的辛苦栽培，謝謝李海倫和李馬仕總是聆聽我的煩惱，要不是有你們的支持，我沒有動力撐完這兩年。也要感謝我的愛人們，綠綠兒、美人、阿逼、奶油、啾逼、柔、心，這兩年謝謝你們陪我遊山玩水分擔壓力，我很慶幸這一路走來有你們的陪伴。再一次感謝所有給予我支持與鼓勵的人，謝謝你們的協助，如今我畢業了，希望能和你們所有人分享這份喜悅。. 李珣.

(3) 中文摘要為了規避法律的規範，近幾年來許多毒犯會合成一系列安非他命的衍生物在街頭販售，使得濫用藥物氾濫的情形愈趨嚴重。本篇研究選用鄰、間、對-氯安非他命和鄰、間、對-氟安非他命這六種安非他命濫用藥物當待測樣品。首先利用毛細管紫外光電泳結合線上掃集濃縮技術，偵測分離六種鹵化安非他命的混合溶液。並利用毛細管螢光電泳偵測安非他命衍生後的唾液真實樣品，衍生方法採取一般暗處靜置衍生和微波加熱衍生兩種方法。由於對-氯安非他命在 2011 年被歸列為第三級毒品，利用筆尖紙噴灑質譜技術(novel nib-assisted paper spray-mass spectrometry, NAPS-MS)以對-氯安非他命當樣品做偵測，分別偵測了標準品以及唾液真實樣品。實驗中有比較四種紙噴灑的材質對於對氯安非他命的偵測極限，由結果發現，紙噴灑的技術對於安非他命濫用藥物的偵測極限可達 0.1 mg/L 以下。. 關鍵字:紙噴灑質譜法、毛細管電泳、氯安非他命、氟安非他命. I.

(4) Abstract Substitutions to the amphetamine molecule give rise to a group of derivatives, and, as a result, a number of illegal, amphetamine-like drugs are produced in underground labs for sale on the street. In this study, we selected o-, m-, p-chloro- and o-, m-, p-fluoro-amphetamines as model compounds. Optimal conditions for the separation and detection of a mixture of six halogen amphetamines are described, by the use of capillary electrophoresis ultraviolet absorbance in conjunction with online sample concentration techniques. And the six designer drugs in a human saliva are also separated by use of the capillary electrophoresis laser-induced fluorescence. The results obtained by the microwave assisted fluorescent labeling method was compared and discussed to regular analytical method. In Taiwan, p-chloroamphetamine (PCA) was permanently placed in Schedule III in 2011. A method for the rapid screening and determination of PCA in saliva by a novel nib-assisted paper spray-mass spectrometry (NAPS-MS) procedure is described. The detection limits and precision of PCA by use four of the paper spray materials are discussed and the complete data are reported herein. Under optimized conditions, the limit of detections (LODs) for amphetamine derivatives were determined to 0.1 µg/mL by the NAPS-MS method.. keywords: paper spray-mass spectrometry, capillary electrophoresis, chloroamphetamine, fluoroamphetamine II.

(5) 目錄中文摘要 ............................................................................................... I 英文摘要 ..............................................................................................II 目錄......................................................................................... III 圖目錄 ..................................................................................... VI 表目錄 .................................................................................. VIII. 第一章緒論 ....................................................................................... 1 1-1 研究目的 ......................................................................................... 1 1-2 研究介紹 ......................................................................................... 2 1-3 分析物簡介 ..................................................................................... 3. 第二章分析方法及原理 ................................................................. 7 2-1 毛細管電泳分析法之發展 .............................................................. 7 2-2 毛細管電泳分離模式 ..................................................................... 8 2-2-1 毛細管區帶電泳（Capillary zone electrophoresis, CZE） .. 9 2-2-2 微胞電動層析法（Micellar electrokinetic chromatogray, MEKC）....................................................................................... 10 2-2-3 毛細管電泳線上掃集法（sweeping） .............................. 11 2-2-4 毛細管電泳線上堆積法（stacking） ................................ 12 2-3 液相層析電噴灑串聯式質譜儀 LCQMS...................................... 13. III.

(6) 2-3-1 電噴灑離子化 (ESI) 發展歷史 ........................................ 14 2-3-2 電噴灑游離 (ESI) 中離子形成機制 ................................ 15 2-3-3 離子阱質量分析器簡介 .................................................... 17 2-3-4 質量偵測器 ........................................................................ 18. 第三章儀器、藥品與實驗方法.................................................. 19 3-1 毛細管電泳/紫外光分析儀 (CE-UV) .......................................... 19 3-2 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (CE-LIF) ................... 23 3-3 液相層析串聯質譜儀 (LCQ) ....................................................... 26 3-4 儀器及周邊設備列表 ................................................................... 28 3-5 藥品列表 ....................................................................................... 33 3-6 FITC 衍生物製備........................................................................... 36 3-7 唾液真實樣品前處理 ................................................................... 37. 第四章結果與討論 ........................................................................ 38 Part I. 以毛細管紫外光電泳儀偵測氯、氟安非他命 4-1 氯、氟安非他命吸收光譜量測 .................................................... 38 4-2 毛細管區帶電泳(CZE)條件確立 .................................................. 40 4-3 以電動進樣方法偵測氟、氯安非他命 ........................................ 43 4-4 毛細管微胞電動層析(MEKC)及線上掃集濃縮(sweeping-MEKC) 電泳條件探討 ...................................................................................... 49 4-5 最佳化 MEKC 電泳條件確立 ...................................................... 49 4-6 最佳化 sweeping-MEKC 電泳條件確立 ...................................... 51. IV.

(7) Part II. 以毛細管螢光電泳儀偵測氯、氟安非他命 4-7 氯、氟安非他命衍生後螢光光譜量測 ........................................ 54 4-8 衍生試劑 FITC 反應之探討 ......................................................... 56 4-9 使用光電倍增管偵測分析物產生的螢光 .................................... 59 4-10 使用 CCD 偵測分析物產生的螢光 ............................................ 62 4-11 真實樣品 ..................................................................................... 65 Part III. 以 Paper spray 技術偵測氯、氟安非他命 4-12 標準品的偵測 ............................................................................. 68 4-13 尖端不同角度對於訊號強度的影響 .......................................... 72 4-14 不同材質的比較 ......................................................................... 75 4-15 真實樣品偵測 ............................................................................. 77. 第五章結論 ..................................................................................... 79 參考文獻 ............................................................................................ 80 論文發表 ............................................................................................ 85 附錄. V.

(8) 圖目錄第一章緒論圖 1-1 安非他命類的基本結構 ............................................................. 6. 第二章分析方法及原理圖 2-1 CZE 分離模式下不同粒子遷移之示意圖 .................................. 9 圖 2-2 MEKC 分離模式示意圖 ........................................................... 10 圖 2-3 掃集（sweeping）濃縮機制示意圖 ........................................ 11 圖 2-4 堆積（stacking）濃縮機制示意圖 .......................................... 12. 第三章儀器、藥品與實驗方法圖 3-1 自組式毛細管電泳/紫外光分析儀裝置圖 .............................. 20 圖 3-2 自組式毛細管電泳/紫外光分析儀電動進樣裝置圖 ............... 21 圖 3-3 毛細管電泳電動進樣所使用的塑膠管 ................................... 22 圖 3-4 電動進樣所使用的塑膠管放入材料端示意圖 ......................... 22 圖 3-5 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (使用光電倍增管偵測分析物產生的螢光) ......................................................................... 24 圖 3-6 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (使用電荷耦合元偵測分析物產生的螢光) ......................................................................... 25 圖 3-7 paper spray 儀器架設簡單示意圖............................................. 27. 第四章結果與討論圖 4-1 圖 4-2 圖 4-3 圖 4-4 圖 4-5. 六種鹵化安非他命的吸收光譜圖，濃度均為 100 mg/L ....... 39 緩衝溶液未添加 ß-CD 電泳圖 ................................................ 41 最佳化緩衝溶液的 CZE 電泳圖 ............................................. 42 以 50 % PLA 中空纖維電動進樣電泳圖................................. 44 以濾紙電動進樣電泳圖 ........................................................... 45 VI.

(9) 圖 4-6 以固相萃取粉末電動進樣的電泳圖 ....................................... 46 圖 4-7 探討電動進樣固相萃取效果的電泳圖 ................................... 48 圖 4-8 最佳化背景溶液的 MEKC 電泳圖 .......................................... 50 圖 4-9 最佳化的 sweeping-MEKC 電泳圖 ......................................... 52 圖 4-10 sweeping-MEKC 流速圖 ......................................................... 53 圖 4-11 六種安非他命衍生後的螢光放光光譜圖，濃度為 1 mg/L .. 55 圖 4-12 六種鹵化安非他命與 FITC 進行衍生之反應式 ................... 57 圖 4-13 FITC 水解之反應式 ................................................................ 58 圖 4-14 毛細管螢光電泳的 MEKC 電泳圖 ........................................ 60 圖 4-15 六種鹵化安非他命衍生後的檢量線圖 ................................. 61 圖 4-16 以 CCD 偵測衍生 12 小時 50 µg/L 六種安非他命電泳圖 ... 63 圖 4-17 以 CCD 偵測微波衍生 5 分鐘六種安非他命的電泳圖 ........ 64 圖 4-18 以 PMT 當收光儀偵測衍生 12 小時真實樣品電泳圖 .......... 66 圖 4-19 以 CCD 當收光儀偵測微波衍生真實樣品電泳圖 ................ 67 圖 4-20 0.1 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖 ........................ 69 圖 4-21 為 0.5 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖 ................... 70 圖 4-22 時間和訊號強度 TIC 圖 ........................................................ 71 圖 4-23 濾紙尖端角度和 S/N 比的關係圖 .......................................... 73 圖 4-24 濾紙尖端角度和強度的關係圖 .............................................. 74 圖 4-25 不同材質所測得的質譜圖 ..................................................... 76 圖 4-26 paper spray 真實樣品質譜圖 .................................................. 78. VII.

(10) 表目錄第一章緒論表 1-1 安非他命衍生物 ........................................................................ 6. 第二章分析方法及原理表 2-1 毛細管電泳發展史 .................................................................... 7 表 2-2 毛細管電泳常見分離模式與機制 ............................................. 8. 第四章結果與討論表 4-1 電動進樣和抬高虹吸進樣所得電泳圖之 S/N 比 .................... 47 表 4-2 不同材質的 LOD 估計值......................................................... 75. VIII.

(11) 第一章. 緒論. 1-1 研究目的近幾年來，台灣濫用藥物的趨勢愈來愈嚴重，本研究目的主要利用毛細管紫外光電泳和毛細管螢光電泳分離六種狡詐家安非他命化合物，分別為 ortho-chloroamphetamine、meta-chloroamphetamine、 para-chloroamphetamine、ortho-fluoroamphetamine、metafluoroamphetamine、para-fluoroamphetamine，並且利用毛細管螢光電泳做真實樣品的分析。此外，為了能夠在短時間內篩選出受測者是否有吸食狡詐家安非他命化合物，本研究利用 paperspray 針對 para-chloroamphetamine 做偵測可達到快速篩選的效果，並針對不同的材質以及尖端角度對於 ESI 效果的影響做研究。. 1.

(12) 1-2 研究介紹當今社會毒梟濫用藥物的情形日趨嚴重，許多不肖毒犯為了規避法規，合成主結構和安非他命一樣，但改變所接的官能基，其毒性和藥性都更勝安非他命，此類基本結構一樣但所接官能基不同的藥品稱之為「狡詐家藥物」。本研究所選的狡詐家安非他命藥物為鹵化安非他命中的氟安非他命和氯安非他命，台灣警方於前年發現毒梟大量合成氯安非他命，其藥性遠遠超過安非他命和甲基安非他命，政府於 2011 年 4 月將對-氯安非他命(PCA)列為第三級毒品。現今一般常見的濫用藥物檢測法包含了比色法、氣相層析質譜法[1-8]、液相層析質譜法、拉曼光譜法 [9-12] 、薄層層析法、毛細管電泳等等。目前檢測單位主要還是以氣相層析質譜法為主，因為其具有定性、定量、準確度及精確度高的特性，但由於氣相層析質譜法多以 EI 為游離源，此游離法能量較高，會使樣品結構斷裂，不易觀察母離子訊號，所以當離子斷裂碎片相同且化學結構類似時，不容易判定，且當樣品不具揮發性時，必須經過煩雜的衍生步驟才可進行氣相質譜的分析。因為質譜有不利於辨別同分異構物的缺點，所以本實驗以毛細管紫外光電泳和毛細管螢光電泳以及 paper spray 來進行藥物分析。本實驗所使用的真實樣品為唾液[13-17]，相較於血液取得不便且具侵入性，而尿液會有假物質的干擾，唾液的取得快速且安全，所以目前在濫用藥物的分析上，唾液為首選。 Paperspry 為近年來興起的快速篩選技術，本研究針對 paperspray 的材質以及濾紙的尖端角度做研究，此技術的優點在於可以快速的在短短幾分鐘內得知受測者是否有吸食狡詐家安非他命化合物。 2.

(13) 1-3 分析物簡介安非他命 (amphetamine) 為一種中樞神經興奮劑，學名為苯丙胺，又名為去甲麻黃素，為無色或淡黃色油狀物，其鹽酸鹽或硫酸鹽是帶有微苦味的白色結晶狀粉末，為台灣常見的氾濫毒品。吸食安非他命可提振精神興奮作用長達十幾個小時。安非他命最早是在 1887 年由德國化學家 Edeleano 合成，在 1932 年被應用在醫療上，多用於治療呼吸方面的疾病以及憂鬱症、長期疲乏…等症狀，後來還被作為食慾抑制劑，添加在減肥藥中，其主要副作用為：頭痛、高燒、血壓升高、盜汗、食慾喪失、瞳孔放大…等，若服用劑量太高會引起精神錯亂、幻聽幻覺、被害妄想等症狀，且有高血壓及腦中風之危險，成癮性很強，停用後的脫隱症狀包括精神呆滯、昏睡、易怒、煩躁憂鬱，有自殺傾向。雖然安非他命致死率不高，但因為其成癮性，荷蘭將其列為第一級毒品，美國以及英國則列為第二級以及 Class B 管制毒品，加拿大列為第三級毒品，我國政府也將其列為第二級管制毒品。 3,4-MDMA (3,4-methylenedioxymethamphetamine) 為一種結構類似安非他命的中樞神經興奮劑，俗稱忘我、亞當、狂喜、快樂丸、搖頭丸等，最早於 1912 年由德國 Merck 公司合成，1914 年獲得專利，主要作用和安非他命類似，但效用較安非他命強，通常在服用二十分鐘至一小時內即產生藥效，服用者會有意識昏迷、抽慉、幻聽幻覺、呼吸困難、大量出汗、體溫升高、呼吸衰竭、心律不整等現象，若長期大量服用會導致記憶力衰退、語言以及視覺均受到損害。美國於 1988 年將其列入一級毒品，其他如英、德國等國家亦分別將其列入 Class A 和第一級管制藥品，有鑒於近幾年來國內搖頭丸的濫用，政府已於民國 88 年將 MDMA 列為第二級毒品。 3.

(14) 由於政府陸續將安非他命、甲基安非他命以及 MDMA 列為第二級毒品，所以國內許多不肖業者為了規避法規，開始合成以及販售結構和效果類似安非他命的新興毒品，這些藥物在政府尚未立法前以狡詐家藥物稱之。而在這些新興毒品中，鹵化安非他命是近幾年來備受重視的，不肖業者常以 3,4-亞甲基雙氧甲基安非他命(即 MDMA、搖頭丸)名義販賣，鹵化安非他命為中樞神經興奮劑，而在台灣，自 98 年以來，又以氯安非他命(chloroamphetamine)和氟安非他命 (fluoroamphetamine)最為氾濫，其結構和作用類似安非他命和 MDMA。. 4.

(15) 氯安非他命 (chloroamphetamine) 氯安非他命俗稱白 C、氯環，外觀為藍、綠、褐、白等色的圓形或是五星型錠，原本應用在動物實驗，於神經生物學研究中殺死神經性細胞，具高毒性。服用後的症狀和 MDMA 類似，會導致血壓升高、失眠焦慮、情緒不穩、記憶衰退、妄想、精神分裂，值得令人擔憂的是毒性較 MDMA 強，造成致死的劑量範圍值小，具高度危險性。雖目前無關成癮性之研究文獻，但國內已有多起查獲案例，甚至破獲對 -氯安非他命之製毒工廠，且本身亦不具醫療用途，所以法務部於民國 100 年四月將其提列為第三級毒品，詳見附錄。. 氟安非他命 (fluoroamphetamine) 就氟安非他命而言，作用和結構類似氯安非他命，只是效用較氯安非他命低，外觀為黃色的圓形錠，立陶宛於 2009 年七月將其列為管制藥品，而瑞士則在 2010 年十二月列為管制藥品，其他像是波蘭以及瑞典均陸續將其列為管制藥品。台灣雖尚未立法，但其氾濫的情形也日趨嚴重。. 5.

(16) 圖 1-1 安非他命類的基本結構. 表 1-1 安非他命衍生物 Name. R1. R2. R3. ortho-fluoroamphetamine. F. H. H. meta-fluoroamphetamine. H. F. H. para-fluoroamphetamine. H. H. F. ortho-chloroamphetamine. Cl. H. H. meta-chloroamphetamine. H. Cl. H. para-chloroamphetamine (PCA). H. H. Cl.  PCA 為第三級毒品. 6.

(17) 第二章. 分析方法及原理. 2-1 毛細管電泳分析法之發展電泳（electrophoresis）指帶電粒子受外加電場作用，以不同速度朝與電荷電性相反的電極方向移動之現象。表 2-1 為其發展史。表 2-1 毛細管電泳發展史西元（年）科學家 1886. Lodge. 事件使用含有膠質的電解液，在兩端加以電壓，發現顏色產生的變化[18]. 1892. Picton. 使用含有離子性色素的電解液. 1899. Hardy. 使用含有膠質粒子的 U 型管，發現了電泳的現象. 1937. Tiselius. 應用於離子性物質的分離與精製[19]. 1948. Tiselius. Tiselius 因電泳法-吸附現象及分離血清蛋白等相關研究得諾貝爾化學獎. 1965. Konstantinov. 首度使用毛細管進行電泳分離的嘗試. 1967. Hjerten. 提出在高壓電場，直徑 3mm 毛細管中作自由溶液毛細管區帶電泳[20-21]. 1981. Jorgenson. 使用內徑 75 µ m 的石英毛細管，以螢光的方式進行型研究，確立了一般所稱毛細管區帶電泳法(CZE) [22-23]. 1984. Terabe. 提出了膠束電動層析法 (Micellar electrokinetic chromatography, MEKC)。 [24]. 1987. Hjerten. 把傳統的等電聚焦法，應用到毛細管電泳法來，提出了毛細管等電聚焦法(Capillary isoelectric focusing, CIEF) [25-26]. 1987. Cohen. 提出了毛細管凝膠電泳法(Capillary gel electrophoresis, CGE) [27]. 1990. Honda. 最早將毛細管電泳應用於中芍藥 Paeoniflorin 及 Oxypaeoniflorin 之定量[28-29]. 7.

(18) 2-2 毛細管電泳分離模式毛細管電泳具有多種操作模式，其分析原理主要利用電滲流及樣品溶液間的作用[30-32]，每種模式分離機制也都不盡相同，而毛細管電泳基本操作模式包含有：毛細管區帶電泳（CZE） [33-34]、毛細管微胞電動層析（MEKC） [35-37]、毛細管凝膠電泳（CGE） [38]、毛細管等電聚焦（CIEF） [39-40]、毛細管等速電泳（CITP） [41-44] 以及毛細管電層析法（CEC）[45-48]，其分離機制如表 2-2 所示。. 表 2-2 毛細管電泳常見分離模式與機制分離模式. 分離機制. 毛細管區帶電泳（CZE）. 自由溶液中電泳遷移率. Capillary zone electrophoresis 微胞電動層析（MEKC）. 分析物與微胞間相互作用力差異. Micellar electrokinetic chromatography 毛細管凝膠電泳（CGE）. 分析物大小及電荷不同. Capillary gel electrophoresis 毛細管等電聚焦（CIEF）. 依等電點不同（pKI）. Capillary isoelectric focusing 毛細管等速電泳（CITP）. 界面移動促使分析物分離. Capillary isotachophoresis 毛細管電層析法（CEC）. 分析物與靜相間作用力. Capillary electrochromatography. 8.

(19) 2-2-1 毛細管區帶電泳（Capillary zone electrophoresis, CZE） CZE 是毛細管電泳中最基本、最為廣泛的一種操作模式，如圖 2-1 所顯示[49]。在不同 pH 值之下，帶電荷粒子有不同的質荷比（m/z），會直接影響粒子遷移的速度，這也是關鍵。有時會針對不同的需求在背景溶液中添加修飾劑，像是有機修飾劑、界面活性劑或對掌性選擇劑（chiral selectors）等，藉由不同的作用機制，以達分離之效果 [50-54] 。. a. Detector - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -. N. N N. EOF. N N. - - - -. -- -- -- - - - - - - -. N. + + + + + + + +. + ++ + + + + + + +. - - - - - - - - - - - - - - - - - -. b t=0 t+. t+. t. N. t-. t-. 圖 2-1 CZE 分離模式下不同粒子遷移之示意圖（a）分離示意圖（b）層析圖譜示意圖. 9.

(20) 2-2-2 微胞電動層析法（Micellar electrokinetic chromatogray, MEKC）微胞電動層析（MEKC）技術起源於西元 1984 年，由 Terabe 等人首先提出[55-56]，此一技術最大之特點是可同時分離離子型化合物與中性物質。在 MEKC 模式中，是在背景溶液中加入界面活性劑，而加入界面活性劑之濃度大於其臨界微胞濃度（critical micelles concentration , CMC）時，界面活性劑之單體會聚集形成球狀體，稱微胞（micelle），以圖 2-2 所示[57]，在電泳過程中分析物身處在兩相之間分配，由於微胞與分析物之間親合力不同，造成其滯留程度有所差異。在一般狀況來說，電滲流流速大於微膠粒的遷移速度，微膠粒最終以較低速度朝陰極方向移動，進而達到分離分析物的目的。. 圖 2-2 MEKC 分離模式示意圖 S1 及 S2 分別代表不同的溶質粒子，因與微胞產生作用力之不同，而有不同的遷移速率（a）分離示意圖（b）層析圖譜示意圖 10.

(21) 2-2-3 毛細管電泳線上掃集法（sweeping）西元 1998 年，Quirino 與 Terabe 發表一種稱為掃集法（sweeping）的線上樣品濃縮技術[58-62]，本濃縮技術的特色在於利用界面活性劑形成的微胞，在電場中為移動相，由於親和力之關係來對樣品進行掃集濃縮，其機制如圖 2-3[63]，爾後結合 sweeping 的 MEKC 濃縮技術就被廣泛地運用在毛細管電泳分析上[64-66]。. 圖 2-3 掃集（sweeping）濃縮機制示意圖 A：首先毛細管內注入背景溶液（BGS），之後注射一段樣品（S）。 B：施加負電場後微胞進入 S 區將分析物掃集至一狹窄區帶，而圖中所標 PS vacancy 則是指前導 BGS 中的微胞往前移動，導致的一段不含微胞的背景溶液。 C：電泳時間的增長，所有樣品區帶都被掃集過後，分析物完全被濃縮在此一黑色區帶上，隨著微胞繼續遷移，被濃縮的分析物區帶（黑色部分）就此進行 MEKC 電泳分離機制。. 11.

(22) 2-2-4 毛細管電泳線上堆積法（stacking）由 Chien 與 Burgi 在西元 1991 年所發表的場放大樣品堆積（field amplified sample stacking）技術，特點在於樣品基質與背景溶液的場強差異甚巨，而樣品區段的導電度通常遠小於背景溶液區段，主要的原理機制於圖 2-4 所示[67]，本濃縮技術的成敗關鍵在於分析物在強場（樣品區帶）與弱場（背景溶液區帶）之間電泳遷移率的差異。. 圖 2-4 堆積（stacking）濃縮機制示意圖 A：在毛細管中注入背景溶液，接著注入一段低導電度的樣品基質（S），施加正電場進行電泳，基質中帶正電的分析物會往負極移動，達 BGS 與 S 的界面時，移動速度下降，分析物堆積在界面。 B：當所有的分析物都快速的移動到界面上後，分析物就開始進行一般的 CZE 電泳分離模式。 C：堆積過的分析物依次通過偵測點，達到分離與濃縮的效果。 12.

(23) 2-3 液相層析電噴灑串聯式質譜儀 LCQMS 液相層析電噴灑串聯式質譜儀(LCQMS)主要是將液相層析儀和質譜儀連接所組成的分析儀器，在大氣壓力下，利用電噴灑過程將溶液中的樣品離子化，形成帶電荷的離子，再進入質譜儀中進行質荷比量測，藉由質荷比可以計算分析物的分子質量。樣品先在液相層析儀中分離後，再進入質譜儀。液相層析主要是利用動相(mobile phase)推動分析物進入層析管柱，再與靜相 (stationary phase)產生不同極性作用而達到分離的效果。以下幾節簡單的介紹液相層析儀所包含的主要儀器元件。. 13.

(24) 2-3-1 電噴灑離子化 (ESI) 發展歷史電噴灑的現象是於二十世紀被 Zeleny 等人研究，1979 年 Zeleny 首次提出電噴灑的現象[68]，藉由施加高電壓毛細管出口端，當微量液體流經時，電荷會分佈在液體表面，當庫侖作用力大於表面張力時，進而產生許多帶電荷液滴。起初，這樣的電噴灑記述主要應用在工業用途上，如高壓電噴漆、燃油霧化點火系統等。而第一次以電噴灑做為一種游離方式是在 1968 年，由 Malcom Dole 等人成功的將電噴灑應用在大分子的游離上，如玉米膠質 (Zein, 50 kDa)與溶菌脢 (Lysozyme, 14.5 kDa) [69-70]，但由於偵測器為法拉第杯 (Faraday cage)，以偵測電流訊號為主，因此 Dole 只能推測經電噴灑游離後的大分子會產生帶有不同電荷的離子，無法提供足夠的數據證明帶有多價電荷的離子存在。直到 1984 年，M. Yamashita 與 J. B. Fenn 等人首度將電灑游離法和四極柱質譜儀結合，並成功的證明物質經電噴灑游離後會以多價電的離子形式存在[71-72]，同年，M. L. Aleksandriv 等人也成功將電噴灑游離質譜儀與液相層析儀結合 [73] 。. 14.

(25) 2-3-2 電噴灑游離 (ESI) 中離子形成機制電噴灑游離法中離子形成的機制大致可分為以下三個部份：（一）霧化（nebulization）：帶電液滴的形成當液體經未施加高電壓的金屬毛細管尖端時，由於缺乏電場作用，僅會因表面張力而形成液滴，此時的液滴含有分佈均勻的正負離子，若幫浦持續推動，溶液僅會在毛細管尖端形成一小水柱，並不會有噴灑的現象產生。但當液體流經一外加高電壓的金屬毛細管尖端時，毛細管尖端會產生一強大的電場作用，使得溶液中的正負離子會受到電場作用而產生電荷分離的現象。若施加一正電壓，則負離子會受正電場吸引而聚集在金屬毛細管壁，正離子則往毛細管尖端移動，在溶液表面大量聚集，當正電荷累積到一定的數量，此時所產生的排斥力與電場作用，正電荷的液體表面往低電場方向拉長，使得毛細管尖端出口呈現一圓錐狀，稱之為泰勒圓錐（Taylor cone），由於受到高電場的影響，使得愈多正電荷累積在溶液表面，當這些正電荷累積到一定數量時，因正電荷間所造成的斥力已大於溶液的表面張力，使溶液中的電荷密度突破雷利極限（Rayleigh limit），而以表面帶多電荷的微小液滴所產生的噴灑現象 [74-76] 。（二）去溶劑（desovation）：電噴灑液滴的揮發與分裂從帶電液滴到形成可被質量分析器偵測到的多電荷氣態離子，其間帶電液滴在由高電位往低電位飛行的過程中，因不斷的接觸大量空氣，使液滴中的溶劑分子快速揮發，而使液滴體積不斷減小，而當液滴體積減小到一定程度時，由於液滴在減小的過程中，液滴中的電荷數量沒有改變，造成液滴表面累積的電荷密度過高，電荷間所產生的強大斥力已大於表面張力，此時液滴會產生分裂現象，分裂的程度 15.

(26) 則與液滴本身的半徑大小、溶劑的表面張力和液滴內所帶的價數而有所不同。相同的過程會在電噴灑端與質量分析器間不斷重複，帶電液滴經多次分裂、體積不斷減少，最終能使溶劑去除。為了增加溶劑去除的效率，通常會將樣品溶在揮發性較強的有機溶劑與水的混合液中，也會利用儀器中霧化氣流來增加噴灑的效率，或是在質量分析器入口端往電噴灑端施予一輔助氣流來幫助溶劑的揮發。（三）游離（ionization）：氣態離子的形成帶電荷液滴形成氣帶離子，這樣的離子化是電噴灑游離法的關鍵，但產生此現象機制，並無定論，而目前較為被科學家接受的理論主要有兩個，一個是 M. Dole 在 1968 年所提出電荷殘留理論；另一個是 B. A. Thomson 在 1976 年所提出的離子揮發理論 [77] 。電荷殘留理論認為當帶電液滴溶劑經不斷的揮發而造成液滴多次分裂，每個液滴的體積與電荷數也跟著減少，最後當帶電液滴的溶劑完全揮發，液滴則無法進一步分裂，而液滴原本攜帶的電荷會殘留在分析物分子上，使得分析物形成帶多價電荷的氣態離子。而離子揮發理論認為氣態離子不一定要等到溶劑揮發才能形成，而是當帶電液滴的溶劑不斷揮發，液滴經多次分裂後，當液滴直徑縮小至 10-20 nm，液滴表面離子會受電場的影響，當達到臨界點時，較小的帶電液滴就會突破液滴表面形成帶有多價電荷的氣態離子。Fenn 於 1993 年將離子揮發理論加以改良，用來合理解釋大分子會帶多電荷的現象，其原因在於噴灑後的液滴就帶有多個電荷，而這些液滴中也同時包含異性電荷的離子。由於大分子在液滴中的布朗運動而移動到液滴表面，而取代部分液滴表面的電荷，再藉由熱能的驅動使大分子部分帶電區域突破液滴表面，大分子便能與液滴脫離而形成多價電荷的氣態離子。 16.

(27) 2-3-3 離子阱質量分析器簡介 LCQ 所使用之質量分析儀為離子阱分析儀，為雙曲線型的一個環狀電極（ring electrode）和兩個端蓋電極（end cap electrode）所形成的一個捕捉室（trap），環狀電極內徑（r0）與兩個端蓋電極間之距離（2Z0）維持著 r02 =2Z02 的關係。當射頻（radio frequency）之交流電壓施加到環狀電極時，便會在離子阱中產生三度空間的四級場（quadrupole electric field）。帶電荷的離子可以從端蓋電極中的一個小孔射入捕捉室內。在環狀電極上導通直流和射頻交流電位，將所需要之 m/z 範圍的樣品離子均捕捉至阱中。經過一段時間再改變直流和射頻電位或射頻頻率，使不同之 m/z 值的離子依序穿過端蓋電極小孔而進入偵測器。離子阱與其他質量分析器的不同點在於其是利用不同時間內射出的不安定離子以形成質譜圖。由於阱內電場不均勻因此需通入少量的氦氣作為緩衝氣體，以阻撓離子之運動，使離子停留於阱中心震盪，增加解析度與靈敏度。. 17.

(28) 2-3-4 質量偵測器質量偵測器主要可分為兩種：（1）光電倍增管（photo multiplier, PMT）與（2）電子倍增管（electron multiplier, EMT）。光電倍增管是利用由質量分析器出來的離子經過轉換極再透過光電倍增管放大；而電子倍增管則是利用由質量分析器出來的離子先撞擊到一銅/ 鈹合金之表面（dynode）以轉換成電子，再依序提高電極間之電位，讓電子束每撞擊一次，其數量就成等倍數之增加，經過多次反射而放大，每次反射增加兩倍，所以是為 2n 的倍數。LCQ 使用的質量偵測器為電子倍增管。. 18.

(29) 第三章. 儀器、藥品與實驗方法. 3-1 毛細管電泳/紫外光分析儀 (CE-UV) 圖 3-1 為自組式毛細管電泳/紫外光分析儀裝置圖，主要裝置包含紫外光/可見光光譜儀、高壓直流電源供應器、毛細管、緩衝溶液、自組式的訊號放大器、類比/數位轉換卡，使電腦可將訊號讀出。圖 3-2 為自組式毛細管電泳/紫外光分析儀電動進樣裝置圖。主要在毛細管進樣端，放置一端拉細的塑膠管如圖 3-3，塑膠管的總長約 2 公分，拉細端長 1 公分，放材料端 1 公分，如圖 3-4。材料選擇有濾紙、固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE) C18 粉末，或是台北醫學大學生醫材料暨工程研究所的陳建中教授實驗室所合成的中空纖維，用以上三種材料分別進行電動進樣，和抬高虹吸進樣比較，虹吸進樣為水動進樣，藉由壓力差使樣品流動。毛細管選用內徑為 50 µm 或是 75 µm 的石英熔矽毛細管柱，由於毛細管外壁會塗佈一層聚醯亞胺增強毛細管的韌性，所以在偵測前，必須將毛細管外壁的聚合物保護層去除，形成長約 1 cm 的偵測式窗。第一次使用毛細管時，必須先進行清洗以及活化，之後將所配置的緩衝溶液注入毛細管內。將待測物注入毛細管中的方法，套裝的毛細管電泳/紫外光分析儀採用壓力進樣的方式，用 50 mBar 的氮氣注射 5 秒鐘，而自組式毛細管電泳儀以虹吸抬高進樣的方式將待測物注入毛細管中，之後通入高壓電，進行待測樣品的電泳分離，實驗所選用的吸收波長為 214 nm，當分析樣品進入偵測窗，因為吸收度改變，而達到偵測的效果。 19.

(30) 圖 3-1 自組式毛細管電泳/紫外光分析儀裝置圖. 20.

(31) 圖 3-2 自組式毛細管電泳/紫外光分析儀電動進樣裝置圖. 21.

(32) 圖 3-3 毛細管電泳電動進樣所使用的塑膠管. 放入材料端的孔洞. 圖 3-4 電動進樣所使用的塑膠管放入材料端示意圖. 22.

(33) 3-2 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (CE-LIF) 圖 3-5 為自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀裝置圖，由光電倍增管 (PMT) 收光。圖 3-6 為自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀裝置圖，由電荷耦合元 (CCD) 收光。均以藍光雷射作為誘導雷射的光源，選用內徑為 50 µm 或是 75 µm 的石英熔矽毛細管柱分離待測物。當毛細管內注滿緩衝溶液後，以抬高虹吸進樣的方式注入待測樣品，接著施加以高壓電，跑電泳分離。實驗中所使用的光源為 100 mW，波長為 473 nm 的藍光雷射，利用光學顯微鏡的聚焦鏡聚光，聚焦於毛細管上作為誘導螢光的光源。在與入射光約 90 度角的位置上架設一個倍率為 20 倍的光學顯微鏡接物鏡，用以收集產生的螢光，接著放置一個直徑約 1 mm 的針孔 (pinhole)，在 pinhole 後面放置一片橘黃色的濾光片，主要目的是用來消除雷射聚焦於毛細管所產生的散射光。再由聚焦鏡聚光，經由單光器(ARC Model sp-300i)分光後，藉由光電倍增管(PMT)放大產生電位差，再經過訊號轉換器(PCI-6221)轉換，連接至電腦搭配 LabVIEW 程式讀取實驗數據，或是分光後直接由 CCD 連接至電腦做偵測。. 23.

(34) 圖 3-5 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (使用光電倍增管偵測分析物產生的螢光). 24.

(35) 圖 3-6 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (使用電荷耦合元偵測分析物產生的螢光). 25.

(36) 3-3 液相層析串聯質譜儀 (LCQ) 圖 3-7 為 paper spray 的儀器改裝架設示意圖，paper spray 的技術參考主要來自於近幾年來的文獻[78-82]。在 ESI 毛細管噴頭的地方改良成一個自製的銅平臺，可放置 paper spray 的濾紙，並結合市售的液相層析串聯質譜儀，所使用的質譜儀型號為 Thermo Finnigan LCQ LC/MS。銅平臺距離質譜儀的入口約 5-10 mm，將濾紙剪成三角形，底約 3 mm，高約 5 mm，浸泡到樣品溶液五秒鐘後將濾紙放置到銅的平臺上，或是直接滴加 10 µL 的樣品溶液到已放置在銅平臺的濾紙上。液相層析質譜儀的設定:毛細管電壓(capillary voltage)設定為 3 kV，通以流速為 6 µL/min 的鞘流液體甲醇，並使用 centroid 模式使質譜圖是連續的。數據處理使用 Xcalibur 質譜軟體程式，並結合 LabVIEW 做後續的數據處理。. 26.

(37) 圖 3-7 paper spray 儀器架設簡單示意圖. 27.

(38) 3-4 儀器及周邊設備列表毛細管紫外光電泳相關儀器名稱高壓直流電源供應器紫外光/可見光偵測器毛細管三用電表. LabVIEW. 製造廠商. 型號 Model RR30-2R. 示意圖及規格 ±0-30 kV, 0-2 mA, reversible. CE-971 UV. Wavelength 190-700 nm. Gamma, FL, USA Jasco, Japan. FS, J&W Scientific, CA, Undeactivated USA 16-2650 MIC 6600 C ------DMM. I.D. 50 µm O.D. 375 µm -------. LabVIEW 2010. National Instruments. 毛細管螢光電泳相關儀器名稱. Diode Laser. 製造廠商 BIO-ACCORD SCIENTIFIC & INSTRUMEN T CO.,. 型號. 示意圖及規格. Class III laser. Output power <100 mW Wavelength 430-490 nm 光柵 2400,1200 and 300 grooves/mm. Monochromator. Acton Research Corporation (ARC). Model SP-300i. 28.

(39) photomultiplier tube. Acton Research Corporation (ARC). Model PD-438. 光電倍增管. Hamamatsu. R928. CCD. Andor Technology. Newton 920. 電泳儀高壓電源供應器. Gamma, FL, USA. 資料處理系統. Andor Technology. Model RR 30-2R Andor SOLIS for Imaging. NESLAB. Model COOLFLOW CFT-33. 顯微鏡接物鏡. kyowa. MODEL BMO20. 三向微動平台. Thorlabs, Ltd, UK. 25 mm Travel. Onset Electro-optics. EP01N EP02N EP03N. 循環水冷機. Post and holder. 29. ±0-30 kV, 0-2 mA, reversible Verison 4.8.30000.0. H 20x N.A. 0.4 Focal Length 8.5 mm.

(40) ESB03S ESB01 ESB02S. Base and holder Onset Electro-optics 高通濾光片 (橘黃色). -------. -------. Size : 4x4x0.3 cm Wavelength pass : 540 nm. 毛細管. J&W Scientific, California. 160-2644 (2650) Undeact Fused Silica .075 (.05). I.D. 75µm I.D.. DAQ 介面卡. National Instruments. PCI-6221. Shielded I/O Connector Block for DAQ Devices with 68-Pin Connectors. National Instruments. SCB-68. LabVIEW. National Instruments. LabVIEW 2010. 訊華. ADC-9724. 訊華. SCSI 32. 類比/數位轉換器資料處理系統. 30. supply power 110 V output signal ±10 V -------.

(41) Paper spray 相關儀器名稱. 製造廠商. 型號. 再生液相層析質譜儀. Finnigan. LCQ. 迴轉泵. EDWARDS. E2M30. 示意圖及規格. 其他相關儀器及耗材名稱. 製造廠商. 型號. 電子天秤. AND. ER-120A. pH 測定儀. HORIBA. F-52. 微量吸量管. Eppendorf. Research micropipet. 超音波洗淨器. BRANSON. 3510. 31. 示意圖及規格 Max : 120 g d=0.1 mg. 100-1000 µL 10-100 µL 0.5-10 µL.

(42) 高速離心機. Serial no : 025720. Micro Centrifuge SD mode. 過濾器. Basic Life. PL-6054541. 紫外光可見光吸收光譜儀. HEWLETT PACKARD. 8453. 固相萃取管柱 (SPE). J. T. Baker. 7020-03. 32. Speed : 6000 rpm/min 1.5 mL 13 mm syringe filter with 0.45 µm nylon membrance.

(43) 3-5 藥品列表類藥名. 化學式及來源. 別 C9H12NCl 前憲兵司令部 o-chloroamphetamine. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供 C9H12NCl 前憲兵司令部. m-chloroamphetamine 分. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供. 析 C9H12NCl. 物. 前憲兵司令部 p-chloroamphetamine. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供 C9H12NF 前憲兵司令部. o-fluoroamphetamine. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供. 33. 結構式.

(44) C9H12NF 前憲兵司令部 m-fluoroamphetamine. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供 C9H12NF 前憲兵司令部. p-fluoroamphetamine. 刑事鑑識中心柳如宗中校提供. 衍生試劑. Fluorescein C21H11NO5S isothiocyanate isomer I (Acros) (FITC) Acetonitrile. CH3CN. 溶 (ACN). (Merck). 劑 Methyl alcohol. CH3OH. (MeOH). (Merck). Sodium dodecyl sulfate. NaC12H25SO4. (SDS). (Acros). 界面活性劑. 34.

(45) NaH2PO4 Monosodium phosphate (Sigma). Na2HPO4 Disodium phosphate (Acros). H3PO4 Phosphoric acid (J. T. Baker) 試藥 C42H70O35 ß -cyclodextrin (Acros). Na2B4O7 Sodium tetraborate (Acros) NaOH Sodium hydroxide (J. T. Baker). 35.

(46) 3-6 FITC 衍生物製備衍生步驟是取 100 µL 溶於去離子水中的分析物溶液(六種鹵化安非他命的藥物濃度各為 20 mg/L)，加入 50 µL 的基質，基質溶液為 10 mM 的 sodium tetraborate 水溶液，將分析物與基質混合均勻之後，再加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 12 小時衍生或是以 160 W 的微波爐加熱 5 分鐘微波衍生，待衍生完成後，以 10 mM 的 sodium tetraborate 水溶液稀釋 20 倍，最後得到的六種安非他命的濃度各為 0.5 mg/L。. 100 µL 分析物溶液. 50 µL Matrix (10 mM sodium tetraborate). 50 µL FITC. 靜置 12 小時或是微波 5 分鐘衍生. 以 10 mM 的 sodium tetraborate 稀釋 20 倍. 36.

(47) 3-7 唾液真實樣品前處理毛細管螢光電泳的真實樣品處理步驟 : 取 1000 µL 的唾液裝置離心管中，以高速離心機離心 5 分鐘，取上清唾液，將已溶於去離子水中的六種鹵化安非他命混合液溶於澄清唾液中，配製成 100 µL 20 mg/L 的安非他命分析液，再循著標準品的衍生步驟，加入 50 µL 10 mM 的 sodium tetraborate 基質溶液，混合均勻，最後再加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 12 小時衍生或是以 160 W 的微波爐微波衍生加熱 5 分鐘，衍生完成後，以 10 mM 的 sodium tetraborate 水溶液稀釋 20 倍，最後得到的六種安非他命的濃度各為 0.5 mg/L。 Paper spray 的真實樣品處理步驟 : 取 1000 µL 的唾液裝置離心管中，以高速離心機離心 5 分鐘，取上清唾液，將已溶於甲醇中的對氯安非他命溶於澄清唾液中，配製成 0.5 mg/L 的真實樣品分析液，直接滴加 10 µL 於濾紙上即可分析。. 37.

(48) 第四章. 結果與討論. Part I. 以毛細管紫外光電泳儀偵測氯、氟安非他命 4-1 氯、氟安非他命吸收光譜量測使用 Hewlett-Packard HP-8453 紫外光可見光光譜儀，並且搭配 Agilent UV-visible ChemStation software 軟體，偵測六種鹵化安非他命的紫外光吸收。圖 4-1 為紫外光吸收測量的結果，波長的測量範圍選在 190 -300 nm，六種鹵化安非他命特徵波長約在 260 nm-280 nm 附近，最高峰 ortho-fluoroamphetamine:262 nm, meta-fluoroamphetamine:262 nm, para-fluoroamphetamine:265 nm, ortho-chloroamphetamine:266 nm, meta-chloroamphetamine:267 nm, para-chloroamphetamine:267 nm。.. 38.

(49) 圖 4-1 六種鹵化安非他命的吸收光譜圖，濃度均為 100 mg/L a. para-fluoroamphetamine. (265 nm). b. meta- fluoroamphetamine. (262 nm). c. ortho-fluoroamphetamine. (262 nm). d. para-chloroamphetamine. (267 nm). e. meta- chloroamphetamine. (267 nm). f. ortho-chloroamphetamine. (266 nm) 39.

(50) 4-2 毛細管區帶電泳(CZE)條件確立 (一) 緩衝溶液配製將 50 mM NaH2PO4、100 mM Na2HPO4 及 7.5 mM ß-CD 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積比 70/17.5/12.5 的混合溶液中，以 H3PO4 將 pH 值調整至 3.15。此最佳化條件所跑出來的電泳圖如圖 4-3。 (二) 緩衝溶液未添加 ß-CD 為了確定緩衝溶液的最佳條件，一開始先不添加 ß-CD，使用的緩衝溶液為 50 mM NaH2PO4 及 100 mM Na2HPO4 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積比 70/17.5/12.5 的混合溶液中，以 H3PO4 將 pH 值調整至 3.15。跑出來的電泳圖如圖 4-2 所示，發現 meta-、 para-chloroamphetamine 無法分離。 (三) 分析樣品配製將六種鹵化安非他命的粉末溶於甲醇中，配製成濃度為 100 mg/L 的 6-mix 混合溶液。 (四) 樣品進樣方式注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。. 40.

(51) 23.5. m. p. Intensity (mV). m p o o. 0. Time (s). 圖 4-2 緩衝溶液未添加 ß-CD 電泳圖. 毛細管 : 全長 50 cm，有效長度 41 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4 H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 六種鹵化安非他命混合物虹吸進樣時間 : 5 秒偵測波長 : 214 nm 電壓 : 15 kV. 41.

(52) 20. o. p. p m. m. Intensity (mV). o. 0. Time (s). 圖 4-3 最佳化緩衝溶液的 CZE 電泳圖. 毛細管 : 全長 50 cm，有效長度 41 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 六種鹵化安非他命混合物虹吸進樣時間 : 5 秒偵測波長 : 214 nm 電壓 : 15 kV. 42.

(53) 4-3 以電動進樣方法偵測氟、氯安非他命 (一) 緩衝溶液和前一章節所提到的 CZE 緩衝溶液一樣。 (二) 進樣方式將材料放入塑膠管中，泡至配製在緩衝溶液中的樣品溶液五分鐘，將拉細一端的塑膠管置於毛細管進樣端後置於緩衝溶液中，電動進樣的電壓約為電泳電壓的 1/3-1/2 大小，進樣時間約 30-60 秒，進樣完成後把塑膠管取下再跑電泳圖。 (三) 材料選擇電動進樣的材質選用三種，分別是濾紙、J. T. Baker 固相萃取 C18 管柱中的粉末，以及台北醫學大學生醫材料暨工程研究所的陳建中教授實驗室所合成的 50 % PLA 中空纖維，所得到的電泳圖分別為圖 4-4、4-5、4-6，所測的樣品濃度有 100 mg/L 和 10 mg/L 兩種。表 4-1 為三種材質電動進樣和虹吸進樣所得電泳圖之鄰-氟安非他命 S/N 比統整出的表格。由於當樣品濃度為 10 mg/L 時，以抬高虹吸進樣之方法無法測到訊號，但由電動進樣的方法發現 S/N 比約可提高十倍，同樣大小 1 cm*0.1 cm 的濾紙和 50 % PLA 中空纖維重量分別約為 431.41 µg 和 57.87 µg，濾紙的重量約為中空纖維的 7.5 倍。 (四) 固相萃取效果的探討由於一次電動進樣無法將樣品溶液全部從材料中電出，為了探討萃取效果，以 50 % PLA 中空纖維當材料，發現電泳圖由第一次到第四次，每次都可以維持良好的 S/N 比，直至第五次 S/N 比有顯著的下降，到第六次時甚至看不到訊號，圖 4-7 為第一次和第四次以 50 % PLA 中空纖維當材料電動進樣所得到的電泳圖。 43.

(54) p. m 4.0. o. o. p. Intensity (mV). m. 0. o. p. p m. m. o. 0.7. 0. Time (s). 圖 4-4 以 50 % PLA 中空纖維電動進樣電泳圖毛細管 : 全長 74 cm，有效長度 60 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) 電動進樣時間 : 60 秒；進樣電壓 : 5 kV 偵測波長 : 214 nm；電壓 : 18 kV 44.

(55) m 5.5. p. o. o. p. Intensity (mV). m. 0. m o. p o. m. p. 1.2. 0. Time (s). 圖 4-5 以濾紙電動進樣電泳圖毛細管 : 全長 74 cm，有效長度 60 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) 電動進樣時間 : 60 秒；進樣電壓 : 5 kV 偵測波長 : 214 nm；電壓 : 18 kV 45.

(56) o. m. p o m. Intensity (mV). 0.25. p. 0. m o. p. o. m p. 0.5. 0. Time (s). 圖 4-6 以固相萃取粉末電動進樣的電泳圖毛細管 : 全長 84 cm，有效長度 70 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 混合物(上圖)、10 mg/L 混合物(上圖) 電動進樣時間 : 30 秒；進樣電壓 : 9 kV 偵測波長 : 214 nm；電壓 : 18 kV 46.

(57) 進樣方式. 濃度. s/n 比 (n=5). 進樣時間. 虹吸進樣. 100 ppm. 10.23 ± 0.32. 5秒. 10 ppm. 無法測到. 5秒. 電動進樣. 100 ppm. 106.33 ± 0.78. 60 秒. (50 % PLA). 10 ppm. 13.70 ± 0.84. 60 秒. 電動進樣. 100 ppm. 110.70 ± 0.53. 60 秒. (濾紙). 10 ppm. 10.83 ± 0.49. 60 秒. 電動進樣. 100 ppm. 18.48 ± 0.78. 30 秒. (SPE 粉末). 10 ppm. 8.11 ± 0.66. 30 秒. 表 4-1 電動進樣和抬高虹吸進樣所得電泳圖之 S/N 比. 47.

(58) Intensity (mV). 0.65. o. p o. m. m. p. 0. m 0.5. o. p o. p m. 0. Time (s). 圖 4-7 探討電動進樣固相萃取效果的電泳圖毛細管 : 全長 84 cm，有效長度 70 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；100 mM Na2HPO4；7.5 mM ß-CD H2O/MeOH/ACN (70/17.5/12.5,v/v)；pH=3.15 分析物 : 100 mg/L 混合物 (上圖:第一次；下圖:第四次) 電動進樣時間 : 30 秒；進樣電壓 : 9 kV 偵測波長 : 214 nm；電壓 : 18 kV. 48.

(59) 4-4 毛細管微胞電動層析(MEKC)及線上掃集濃縮 (sweeping-MEKC)電泳條件探討由於毛細管區帶電泳(CZE)對分析物的偵測靈敏度較差，在毛細管電泳中，一般會使用微胞電動層析法(MEKC)以及線上掃集濃縮技術(sweeping-MEKC)來改善靈敏度不佳的問題，而線上掃集的方法和微胞電動層析相比靈敏度較好。圖 4-8 為毛細管微胞電動層析法的電泳圖，圖 4-9 為線上掃集濃縮技術的電泳圖。. 4-5 最佳化 MEKC 電泳條件確立 (一) 緩衝溶液將 50 mM NaH2PO4 及 90 mM SDS 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積比 65/20/15 的混合溶液中，以 H3PO4 將 pH 值調整至 2.15。此最佳化條件的電泳圖如圖 4-8。 (二) 分析樣品配製將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度為 25 mg/L 的 6-mix 混合溶液。 (三) 樣品進樣方式注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。. 49.

(60) 0.014. m. o m. p. o. Intensity (mV). p. 0. Time (s). 圖 4-8 最佳化背景溶液的 MEKC 電泳圖. 毛細管 : 全長 65 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；90 mM SDS H2O/MeOH/ACN (65/20/15,v/v)；pH=2.15 分析物 : 25 mg/L 六種鹵化安非他命混合物虹吸進樣時間 : 5 秒偵測波長 : 214 nm 電壓 : -18 kV. 50.

(61) 4-6 最佳化 sweeping-MEKC 電泳條件確立 (一) 緩衝溶液將 50 mM NaH2PO4 及 75 mM SDS 配製於 H2O/MeOH/ACN 體積比 65/30/5 的混合溶液中，以 H3PO4 將 pH 值調整至 2.15。此最佳化條件所跑出來的電泳圖如圖 4-9。 (二) 非微胞緩衝溶液配製條件與緩衝溶液組成相同，但不含界面活性劑 SDS 的溶液。 (三) 分析樣品配製將保存於去離子水中的六種鹵化安非他命混合物溶液，以非微胞背景溶液稀釋至想要分析的濃度。 (四) 樣品進樣方式先測樣品在毛細管中的流速，如圖 4-10，流速約 0.26 mm/s。將待測樣品抬高虹吸進樣，注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間由實驗幾次後得到最佳化的結果約 9 分鐘，換算進樣長度約為 13.8 cm。. 51.

(62) 0.045. p. o m. p Intensity (mV). m o. 0.005. Time (s). 圖 4-9 最佳化的 sweeping-MEKC 電泳圖. 毛細管 : 全長 75 cm，有效長度 61 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；75 mM SDS H2O/MeOH/ACN (65/30/5,v/v)；pH=2.15 分析物 : 1 mg/L 六種鹵化安非他命混合物溶於非微胞背景溶液虹吸進樣長度 : 13.8 cm 偵測波長 : 214 nm 電壓 : -22 kV. 52.

(63) Intensity (mV). Time (s). 圖 4-10 sweeping-MEKC 流速圖. 毛細管 : 全長 75 cm，有效長度 61 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 50 mM NaH2PO4；75 mM SDS H2O/MeOH/ACN (65/30/5,v/v)；pH=2.15 分析物 : 1 mg/L 六種鹵化安非他命混合物溶於非微胞背景溶液偵測波長 : 214 nm 樣品抵達偵測窗時間 : 2390 s 流速 : 0.26 mm/s. 53.

(64) Part II. 以毛細管螢光電泳儀偵測氯、氟安非他命由於毛細管螢光電泳和紫外光電泳相比之下，靈敏度較高，為了增加偵測靈敏度選用兩種收光器 PMT 和 CCD 來收光，. 4-7 氯、氟安非他命衍生後螢光光譜量測在使用毛細管螢光電泳儀前，需先知道鹵化安非他命衍生後的螢光範圍，將安非他命和衍生試劑 FITC 反應 12 小時候拿去偵測放光，圖 4-11 為六種鹵化安非他命衍生後所測得的螢光光譜，偵測範圍選在 480 -680 nm，FITC 本身的螢光波長大約在 488 nm，和鹵化安非他命衍生後的螢光放光特徵波長約落在 520 nm-580 nm，最高峰分別為 ortho-fluoroamphetamine:547 nm, meta-fluoroamphetamine:545 nm, para-fluoroamphetamine:547 nm, ortho-chloroamphetamine:547 nm, meta-chloroamphetamine:546 nm, para-chloroamphetamine:542 nm，所以之後實驗偵測波長鎖定在 550 nm。之後跑電泳實驗所使用的光源為 100 mW 的藍光雷射光源，其最強發光波長約在 473 nm，發光範圍約在 440-520 nm 之間。實驗以藍光雷射為激發光源，需選擇適當的光學濾片，隔絕掉 520 nm 之前的光源干擾。. 54.

(65) Fluorescence Intensity. Wavelength (nm). 圖 4-11 六種安非他命衍生後的螢光放光光譜圖，濃度為 1 mg/L a. para-fluoroamphetamine. (547 nm). b. meta- fluoroamphetamine. (545 nm). c. ortho-fluoroamphetamine. (547 nm). d. para-chloroamphetamine. (542 nm). e. meta- chloroamphetamine. (546 nm). f. ortho-chloroamphetamine. (547 nm). 55.

(66) 4-8 衍生試劑 FITC 反應之探討由於分析物六種鹵化安非他命本身的螢光強度較弱，為了使其螢光性質更為明顯，此部分嘗試利用衍生技術來進行實驗。所選用的衍生試劑為異硫氰酸螢光黃(fluorescein isothiocyanate isomer I)，簡稱 FITC，在鹼性的環境下與分析物進行衍生反應之後，所得到的六種衍生物即為本實驗的分析樣品，圖 4-12 為六種鹵化安非他命與 FITC 進行衍生反應之反應式。 FITC 衍生試劑一般常用來針對一級胺類和二級胺類藥物進行衍生，而本實驗所用的鹵化安非他命系列藥物即為一級胺類，故適用於 FITC 衍生，且經由實驗測試之後，發現其衍生物螢光強度強且再現性佳，故 FITC 十分適合用於衍生本研究的分析物。由於 FITC 衍生試劑在水中會產生水解反應[83]，形成螢光黃胺 (fluorescein amine)，並與 FITC 進行衍生反應，故衍生反應中會伴隨一些副產物，在電泳圖中可以看見這些副產物的譜峰，圖 4-13 即為 FITC 水解反應之反應式。此外，由於反應中 FITC 衍生試劑是過量添加來進行實驗，衍生產物中也會存在未反應完的 FITC 試劑。. 56.

(67) 圖 4-12 六種鹵化安非他命與 FITC 進行衍生之反應式. 57.

(68) 圖 4-13 FITC 水解之反應式. 58.

(69) 4-9 使用光電倍增管偵測分析物產生的螢光 (一) 緩衝溶液將 75 mM SDS 配製於 10 mM sodium tetraborate 溶液中，以 0.1 M 的 NaOH 將 pH 值調整至 9.70。以 PMT 當收光儀，此最佳化條件的電泳圖如圖 4-14。 (二) 分析樣品配製將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度各為 20 mg/L 的混合溶液，取 100 µL 的混合液和 50 µL 10 mM sodium tetraborate 均勻混合後，加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中，在暗處衍生 12 小時，最後以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，得到欲分析的濃度 0.5 mg/L。 (三) 樣品進樣方式注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。 (四) 檢量線利用上述所獲得的 MEKC 最佳化實驗條件來製作檢量線，六種鹵化安非他命衍生分析物以 0.10、0.075、0.05 mg/L (ppm)，以及 25、 12.5 µg/L (ppb)五種濃度進行毛細管電泳，再以各分析物所產生的譜峰面積進行檢量線的製作，圖 4-15 為製作的檢量線圖。由於 meta和 para-fluoroamphetamine 在低濃度時不易分離，所以將這兩種化合物合併製作一條檢量線。. 59.

(70) m p. Fluorescence Intensity. m p o p. o m. Time (min). 圖 4-14 毛細管螢光電泳的 MEKC 電泳圖. 毛細管 : 全長 55 cm，有效長度 45 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate； pH=9.70 分析物 : 0.5 mg/L 六種鹵化安非他命室溫衍生 12 小時混合物虹吸進樣時間 : 2 秒偵測波長 : 550 nm 電壓 : 13 kV PMT 電壓 : -900 V. 60.

(71) 圖 4-15 六種鹵化安非他命衍生後的檢量線圖. ortho-fluoroamphetamine. y = 189.41x + 0.1891. R2 = 0.9991. meta-、para-fluoroamphetamine. y = 235.45x + 0.3263. R2 = 0.9990. ortho-chloroamphetamine. y = 123.08x + 0.3745. R2 = 0.9955. meta-chloroamphetamine. y = 107.76x + 0.3719. R2 = 0.9966. para-chloroamphetamine. y = 137.32x + 0.2588. R2 = 0.9976. 61.

(72) 4-10 使用 CCD 偵測分析物產生的螢光 (一) 緩衝溶液將 75 mM SDS 配製於 10 mM sodium tetraborate 溶液中，以 0.1 M 的 NaOH 將 pH 值調整至 9.70。以 CCD 當收光儀，此最佳化條件的電泳圖如圖 4-16。 (二) 分析樣品配製將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度各為 2 mg/L 的混合溶液，取 100 µL 的混合液和 50 µL 10 mM sodium tetraborate 均勻混合後，加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中，在暗處衍生 12 小時，最後以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，得到欲分析的濃度 50 µg/L。 (三) 樣品進樣方式注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。 (四) 微波衍生微波衍生的背景溶液如上所述，分析樣品配製也一樣，差別在於加入 FITC 混合後，以功率為 160 W 的微波爐微波 5 分鐘，再以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，得到欲分析的濃度 50 µg/L。圖 4-17 為微波衍生 5 分鐘所得到的電泳圖。. 62.

(73) 6.00E6. Amplitude. m. m o. p. o. p. p m. 0. Time (s). 圖 4-16 以 CCD 偵測衍生 12 小時 50 µg/L 六種安非他命電泳圖. 毛細管 : 全長 58 cm，有效長度 45 cm，內徑 75 µm 緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate； pH=9.70 分析物 : 50 µg/L 六種鹵化安非他命室溫衍生 12 小時混合物虹吸進樣時間 : 5 秒曝光時間 : 1 秒偵測波長 : 550 nm 電壓 : 15 kV slit : 200 Grating : 300 groove/nm. 63.

(74) 9×106. m. p m Amplitude. p o. p. o m. 0. Time (s). 圖 4-17 以 CCD 偵測微波衍生 5 分鐘六種安非他命的電泳圖. 毛細管 : 全長 76 cm，有效長度 60 cm，內徑 75 µm 緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate； pH=9.70 分析物 : 50 µg/L 六種鹵化安非他命微波衍生 5 分鐘混合物虹吸進樣時間 : 3 秒曝光時間 : 1 秒偵測波長 : 550 nm 電壓 : 20 kV slit : 200 Grating : 300 groove/nm. 64.

(75) 4-11 真實樣品 (一) 緩衝溶液將 75 mM SDS 配製於 10 mM sodium tetraborate 溶液中，以 0.1 M 的 NaOH 將 pH 值調整至 9.70。以 CCD 或 PMT 當收光儀。 (二) 分析樣品配製將六種鹵化安非他命的粉末溶於去離子水中，配製成濃度各為 1000 mg/L 的混合溶液，再取唾液離心後的上清液體，將安非他命混合液溶於唾液中，配成 100 µL 的 20 mg/L 混合液，加入 50 µL 10 mM sodium tetraborate 均勻混合後，再加入 50 µL 500 mg/L 的 FITC 溶於丙酮中，在暗處衍生 12 小時，最後以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，得到欲分析的濃度 0.5 mg/L。圖 4-18 為真實樣品衍生 12 小時，以 PMT 當收光儀的電泳圖。 (三) 樣品進樣方式注入樣品採取抬高虹吸進樣的方法，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒。 (四) 微波衍生微波衍生的背景溶液如上所述，分析樣品配製也一樣，差別在於加入 FITC 混合後，以功率為 160 W 的微波爐微波 5 分鐘，再以 10 mM sodium tetraborate 稀釋 20 倍，得到欲分析的濃度 0.5 mg/L。圖 4-19 為真實樣品微波衍生 5 分鐘，以 CCD 當收光儀得到的電泳圖。. 65.

(76) 2500. m. p. m p o o. p. Amplitude. m. 0 2500. 0. Time (min). 圖 4-18 以 PMT 當收光儀偵測衍生 12 小時真實樣品電泳圖毛細管 : 全長 55 cm，有效長度 45 cm，內徑 50 µm 緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate；pH=9.70 分析物 : 0.5 mg/L 真實樣品衍生 12 小時 (上圖)；唾液 blank (下圖) 虹吸進樣時間 : 2 秒；偵測波長 : 550 nm 電壓 : 13 kV；PMT 電壓 : -900 V 66.

(77) 18×106. m oo p. Amplitude. o. o. m. o. o. p. m. p. o. o. o. o. 0. 21×106. 0. Time (s). 圖 4-19 以 CCD 當收光儀偵測微波衍生真實樣品電泳圖毛細管 : 全長 62 cm，有效長度 52 cm，內徑 75 µm 緩衝溶液 : 75 mM SDS；10 mM sodium tetraborate；pH=9.70 分析物 : 0.5 mg/L 真實樣品微波衍生 5 分鐘(上圖)；唾液 blank (下圖) 虹吸進樣時間 : 3 秒；曝光時間 : 1 秒；偵測波長 : 550 nm 電壓 : 17 kV；slit : 300；Grating : 300 groove/nm 67.

(78) Part III. 以 Paper spray 技術偵測氯、氟安非他命 4-12 標準品的偵測 (一) 實驗條件將濾紙剪成三角形，底寬約 3 mm 高 5 mm，放置在自製的銅平臺上，直接滴加 10 µL 的樣品溶液，或是直接將濾紙浸泡到樣品溶液 5 秒鐘，再放到銅平臺上。鞘流液體甲醇的流速設定 6 µL/min，電壓設定 3 kV，質譜的偵測範圍 m/z 100-300。 (二) 樣品配製由於以 paper spray 技術結合 ESI-MS，雖然可以快速偵測質譜，但並沒有層析分離的效果，所以在 sample 的選擇上選用台灣去年開始列入第三級毒品的 para-chloroamphetamine，將藥品配製於甲醇中至欲分析的濃度。圖 4-20 為 0.1 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖。圖 4-21 為 0.5 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖。 (三) 訊號強度 v.s. 時間隨著時間的增加離子訊號強度會隨之減弱，圖 4-22 為在 m/z 170 的情況下所測得的 TIC 圖，訊號強度較高者濃度為 0.5 mg/L，另一濃度為 0.1 mg/L，可清楚觀察到隨著時間的增加，離子訊號強度愈來愈弱直到消失。. 68.

(79) Intensity (%). 100. 0. m/z. 圖 4-20 0.1 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖. 樣品濃度 : 0.1 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 69.

(80) Intensity (%). 100. 0. m/z. 圖 4-21 為 0.5 mg/L 的 para-chloroamphetamine 質譜圖. 樣品濃度 : 0.5 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 70.

(81) Intensity. 2×106. 1×106. 0.5 mg/L. 0.1 mg/L. 0 Time (min). 圖 4-22 時間和訊號強度 TIC 圖. 樣品濃度 : 0.5 mg/L、0.1 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 71.

(82) 4-13 尖端不同角度對於訊號強度的影響 ESI 的原理為尖端放電，所使用的材質尖端角度和離子訊號的強弱有相對關係。之前有相關研究指出此現象，其材質使用一般的市售木頭牙籤，在偵測之前會先將牙籤尖端削成內徑 0.2 mm，此篇研究指出牙籤較細尖的時候值譜訊號強度較好[82]。因此做了濾紙的尖端角度對於 S/N 比的影響，分別針對 15、25、30、45、60、75、90 七種角度對於 S/N 比的影響作圖，如圖 4-23 所示，實驗結果發現當濾紙尖端角度大於 30 度時，S/N 比有明顯下降的趨勢，甚至當尖端角度為 90 度時，是測不到離子訊號的。而圖 4-24 為分別針對 5、10、12.5、15、17.5、20、30 七種角度對於譜峰強度的影響作圖，每個點的實驗值均是取三次做平均。由以上兩圖的結果綜合可發現當尖端角度為 15 度時，ESI 效率最好，推測當尖端角度太大時會導致電場分布太分散，而角度太小時離子濃度數量較少，所以之後實驗尖端角度均固定在 15 度。. 72.

(83) S/N ratio. 角度. 圖 4-23 濾紙尖端角度和 S/N 比的關係圖. 樣品濃度 : 5 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 73.

(84) 圖 4-24 濾紙尖端角度和強度的關係圖. 樣品濃度 : 5 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 74.

(85) 4-14 不同材質的比較 (一) 材質選擇實驗選用四種材料當 paper spray 的基材，分別是一般的市售濾紙、藺草，以及台北醫學大學生醫材料暨工程研究所的陳建中教授實驗室所合成的中空纖維，分成兩種，一種是 100 % PLA，另一種是 60 % PLA，後者含有 40 % 的孔洞率，前者則為無孔洞。四種材料所測得的質譜如圖 4-25 所示。 (二) 實驗條件將材料剪成三角形放置在銅平臺上，直接滴加 10 µL 的樣品溶液，或將材料浸至樣品溶液 5 秒，再放到銅平臺上。鞘流液體甲醇的流速設定 6 µL/min，電壓 3 kV，質譜的偵測範圍 m/z 100-300。 (三) 偵測極限表 4-2 為統整出的四種材料偵測極限。分別為濾紙 0.07 ± 0.02、 60 % PLA 0.23 ± 0.05、100 % PLA 1.29 ± 0.15、藺草 3.27 ± 0.50，由結果發現濾紙的偵測極限最好，所以最後選用濾紙當基材。. 材質. LOD (n=5). 濾紙. 0.07 ± 0.02. 60 % PLA. 0.23 ± 0.05. 100 % PLA. 1.29 ± 0.15. 藺草. 3.27 ± 0.50. 表 4-2 不同材質的 LOD 估計值. 75.

(86) 100. A.. 0. Intensity (%). 100. B.. 0 100. C.. 0 100. D.. 0. m/z. 圖 4-25 不同材質所測得的質譜圖 A. 濾紙. 0.1 mg/L para-chloroamphetamine. B. 60 % PLA. 1 mg/L para-chloroamphetamine. C. 100 % PLA. 5 mg/L para-chloroamphetamine. D. 藺草. 10 mg/L para-chloroamphetamin 76.

(87) 4-15 真實樣品偵測 (一) 實驗條件將濾紙放置在自製的銅平臺上，直接滴加 10 µL 的樣品溶液，或是直接將濾紙浸泡到樣品溶液 5 秒鐘，再放到銅平臺上。鞘流液體甲醇的流速設定 6 µL/min，電壓設定 3 kV，質譜的偵測範圍 m/z 100-300。 (二) 真實樣品配製將 1000 µL 的唾液離心後，取上層的澄清液，將溶於甲醇中的 para-chloroamphetamine 稀釋至欲分析的濃度。圖 4-26 上圖為 0.5 mg/L 的 para-chloroamphetamine 真實樣品所打出來的質譜圖，下圖為單打唾液的質譜圖。. 77.

(88) Intensity (%). 100. A. 0. B. 0. m/z. 圖 4-26 paper spray 真實樣品質譜圖. A. 唾液含 0.5 mg/L para-chloroamphetamine (PCA) B. 唾液未添加 PCA 甲醇流速 : 6 µL/min 電壓 : 3 kV. 78.

(89) 第五章. 結論. 本研究以毛細管紫外光電泳、螢光電泳兩種技術，成功分離了六種安非他命狡詐家濫用藥物，另外利用 paper spray 技術快速且便利的偵測到對-氯安非他命的質譜圖。此外，在真實樣品的應用上，也可成功的分離及偵測到質譜圖，不受背景雜訊的干擾。研究成果統整如下: 1. 在毛細管紫外光電泳方面，以 CZE 方法成功分離六種鹵化安非他命狡詐家濫用藥物，並利用三種材料之電動進樣、MEKC 以及 sweeping-MEKC 三種方法增加了樣品的偵測極限。 2. 以毛細管螢光電泳偵測六種鹵化安非他命，相較於毛細管紫外光電泳可增加偵測極限，且在真實樣品的應用上，可成功測到法定標準 0.5 ppm。 3. 利用 paper spray 的技術，針對對-氯安非他命做偵測，可快速且有效的測得質譜圖，並在四種材料的比較下發現濾紙的偵測極限最好。且對於唾液真實樣品，也可清楚辨認對-氯安非他命的質譜。. 79.

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