伍、細胞凋亡 (Cell apoptosis) 一、程序化細胞死亡與細胞壞死 44-53

細胞凋亡是生物體的一個保護機轉，其可讓不想要的細胞或有缺損的細胞進行自殺，而不會引起發炎反應。在多細胞生物中，細胞的死亡有兩種不同的形式。一種是壞死性或意外性死亡(necrosis 或 accidental cell death)，它是由於某些外界的因素，比如局部貧血、高熱以及物理、化學損傷和生物的侵襲等，造成細胞急速死亡而結束其生命;

另一種稱為細胞凋亡(apoptosis)，細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，最後細胞脫落離體或裂解為著干凋亡小體(apoptosis bodies)而被其他細胞吞噬。

細胞凋亡的形態特徵與壞死性細胞死亡的形態特點不同(圖 1.6)。壞死性細胞死亡的形態特徵首先是膜通透性增加，細胞外形發生不規則變化，內質網擴張，核染色質不規則地位移，進而線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細胞膜破裂，胞質外溢。這種細胞死亡過程常常引起炎症反應。而細胞凋亡，是細胞內在約有規律的機制引起的，它可由某些因素誘導但不是壤死性的改變。這種細胞死亡的特徵是細胞首先變圓，隨即與鄰周細胞脫離，失去微絨毛，胞質濃縮，內質網擴張呈泡狀並與細胞膜融合，粒線體無大變化，

核染色質密度增高呈半月形，並凝聚在核膜周邊，核仁裂解，核固縮，進而細胞膜內陷將細胞自行分割為多個外有膜包裹、內含物不外泄的細胞凋亡小體。由於這種死亡過程不導致溶酶體及細胞膜破裂，沒有細胞內含物外泄，故不引起炎症反應和次級損傷，它的結局是被吞噬細胞或鄰周細胞所識別、吞噬或自然脫落而離開生物體。

細胞發生凋亡初期，細胞膜內膜的phosphatidylserine (PS)會外翻至細胞膜外表層，

為細胞凋亡初期特徵。當進入凋亡末期，細胞核內的 DNA 被核酸內切酶(endonuclease) 裂解，在核小體單位之間分解，產生若干大小不一的寡核苷酸片段，在 DNA 凝膠電泳上呈現階梯狀DNA 圖譜(DNA ladder pattern)，這些區帶由不同倍數的 180~200 bp 的寡核苷酸片段組成，這個長度即是核小體間重複單位的大小。

圖 1. 7 細胞凋亡與細胞壞死之細胞變化圖⁵³

2. phosphatidyl serine 外翻

1.平滑

2.早期分解：內容物外流至細胞外

粒線體

1.膜通透性增加

2 內容物(Cytochrome c、

Apaf-l)外流至細胞質中

壹、活化階段：細胞對"死亡訊息"(death signal)產生反應，可以由內部刺激(如 DNA 不正常)或由外部刺激(如由培養基中移除生長因子)所引發。細胞凋亡的調控是藉由細胞內基因的表現來控制整個過程，這些基因所表現的蛋白依功能可大約分為三大類:第一類是主導細胞走向細胞凋亡的促凋亡(pro-apoptosis)蛋白，第二類是扮演抑制細胞凋亡產生角色的抗凋亡(anti-apoptosis)蛋白，第三類則是屬於執行階段的蛋白質：造成細胞凋亡特徵的調控性蛋白。在正常生理狀況下，藉由第一類與第二類蛋白的互相調節，使細胞維持平衡狀態，當細胞老化或是受到外來傷害時，

便啟動促凋亡 (pro- apoptosis)蛋白路徑，並抑制抗凋亡(anti-apoptosis)蛋白路徑的發生，使細胞走向凋亡。凋亡訊息傳導路徑在目前的研究進展，包含以下的路徑：

(1) 受體凋亡路徑(Death receptor pathway)：啟因為外因性如果死亡因子如 TNF-α，Fas Ligand (Fas L)、TRALL 等分子與細胞膜上的死亡受體(Death Receptor) 如 TNF-R1、TNF-R2、TNF-R3、Fas、TRAIL-R1 等受體結合，會將死亡訊息發送到細胞內，誘發一連串凋亡事件產生。此條路徑的傳導以 Fas-FasL 來說明過程：當 FasL 與 Fas 結合，活化 adaptor protein 繼而與下游的 procaspase-8 結合，活化的 caspase-8，繼續活化其下游的 procaspase-3 使其形成Caspase-3，caspase-3 會誘導促細胞走向凋亡。而 caspase-8 亦會裂解 Bid (Bcl-2 family member proapotitic)變成 t-Bid (truncated Bid)，而從細胞質轉移至粒線體膜上啟動粒線體凋亡路徑。(圖 1.7)

AIF, apoptosis-inducing factor;

Apaf-1, apoptotic protease activation factor-1; Cyto c, cytochrome c;

FADD, Fas-associated death domain;

TNF, tumor necrosis factor; TNFR, TNF receptor; TRADD,

TNFR-associated death domain

圖 1. 8 受體凋亡路徑--依賴Caspase-8/-10活化路徑 (Caspase-8/-10-dependent

RIP, receptor-interacting protein;

TNF, tumour necrosis factor;

TNFR, TNF receptor; TRADD, TNFR-associated death domain.

圖 1. 9 受體凋亡路徑--依賴Caspase-2 活化路徑 (Caspase-2-dependent

procaspase-activation pathway)

⁶¹

(2)粒線體依賴之凋亡路徑(Mitochrondria dependent pathway )^61~68

內部刺激，例如無法修複的遺傳性傷害、細胞內 Ca²⁺離子濃度遽增或嚴重的氧化壓力、X-ray 傷害或等，所示。導致死亡的刺激會活化凋亡前身成員 (proapoptotic members):Bcl-2 家族，例如 Bad。Bad 可以由細胞質轉移到粒腺體包器膜的內側表面並嵌入其內。當Bad 或其他"前"凋亡蛋白質結合於粒腺體包器膜外表時，會改變該膜的通透性，促使cytochrome c 由粒腺體包器膜內部的空間與其他一些必要的膜內蛋白質之釋放如：Cytochrome c、SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases)/DIABLO (direct inhibitor of apoptosis (IAP)-binding protein with low pI), AIF (apoptosis-inducing factor), EndoG (endonuclease G)和 OMI/HTRA2 (high-temperature- requirement protein A2)等粒線體蛋白質的釋出。其中最重要的是 Cytochrome c，其與 Apaf-l (apoptotic protease- activating factor-l)鍵結並活化之，Apaf-l 構型改變，然後與 ATP/dATP 結合行成 apoptosome，進而與 pro-caspase-9 形成四聚體的 complex，此時，

procaspase-9 會裂解成具有活性的 caspase-9，繼而活化其下游的 Caspase-3，

促使凋亡繼續進行。對細胞而言，cytochrome c 由粒腺體釋出是引發細胞凋亡的決定性事件。

Apaf-1, apoptotic protease activation factor-1;

Cyto c, cytochrome c;

FADD, Fas-associated death domain;

TRADD, tumour necrosis factor receptor-associated death domain.

圖 1. 10 典型粒線體調節之凋亡路徑圖之1 (Mitochrondria dependent pathway)⁶¹

圖 1. 11 粒線體依賴之凋亡路徑圖之2 (Mitochrondria dependent pathway)⁵³

Mitochondria-mediated caspase activation at the apoptosome. A. Apoptotic stimuli trigger therelease of apoptogenic factors from the mitochondrial intermembrane space to the cytosol, suchas cytochrome c which induces the formation of the apoptosome and the activation of procaspase-9. B. By the action of cytochrome c (Cyto C) and dATP the Apaf-1 protein adopts a conformationthat allows the formation of a heptameric, wheel-like structure, the apoptosome.

Procaspase-9molecules can bind to the inner “hub” region of the apoptosome and are activated by dimerformation. Active caspase-9 dimers further mediate activation of effector caspases.

(3)透過內質網傳導之凋亡路徑(Endoplasmic reticulum stress pathway)^69~71

當細胞受傷太嚴重，內質網會透過促使Ca²⁺釋放，活化caspase-12，然後進

proteases)的活化，造成下游 caspase 活化。

Apaf-1, apoptotic protease activation factor-1;

ER, endoplasmic reticulum;

FADD,Fas-associated death domain;

TRADD, tumour necrosis factor receptor-associated death domain.

圖 1.12 由粒腺體引發與Caspase-12有關的細胞凋亡(Caspase-12 involved in

apoptosis triggered by ER stress)

⁶¹

貳、執行階段：也就是執行凋亡。由活化階段所活化的caspase 會再往下作用在一群高度篩選過的蛋白質，其目標蛋白質如下：⁶⁴

※ 超過12 個以上的蛋白激酶，包括 FAK、PKB、PKC 及 Rafl 等。例如，FAK 不活化後被認為會中斷細胞的附著，導致凋亡的細胞脫離鄰近的細胞。

※ 組成細胞核膜內襯的核縴層蛋白(Lamin)，當 Lamin 被切斷時會導致細胞核層支解，並使細胞核縮小。

※ 組成細胞結構需要的蛋白質，例如，中間絲(intermediate filament)、actin 與gelsome。切斷這些物質、造成這些蛋白質不活化後會導致細胞變形。

※ 核酸內切酶 (endonuclease) 稱為 caspase activated DNase (CAD)，在 caspase 切斷某一個抑制蛋白質後而被活化。CAD 一旦被活化，就會由細胞質內轉移到細胞核內，攻擊細胞核內的DNA，將之切成片段。

※ 與DNA 修復相關的酵素，這些酵素會因為 caspase 切斷它們後而不活化。

三、細胞凋亡之調節者 (Apoptosis regulator)^65,72

※ Caspase 與細胞凋亡：與哺乳類動物有關的 Caspase，至少有 14 種，與細胞凋亡有關的Caspase 約 7 種：可分成兩類：

1. Initiator caspase (Apoptosis activator) (包括 caspase-2, -8, -9, -10) 2. Effector caspase (Apoptosis executioner) (包括 caspase-3, -6, -7)

表 1. 4 caspase 家族之次家族成員 (Subfamily members of caspase family)

※ Bcl-2 家族蛋白質與細胞凋亡：調節細胞凋亡的分子主要以 Bcl-2 家族蛋白 (Bcl-2protein family)為主，Bcl-2 家族成員表現的多寡會深大影響整體細胞能否進行細胞凋亡。此類蛋白質位於粒線體外膜、內質網膜和核膜上，其成員可分為二大類，分別調控不同的功能^61,64~66,：

1、抗凋亡蛋白(anti-apototic)：此類有 Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-l、Al、

Bfl-l、Brag-l、ElBlgK、LMW5-HL 和 EBV BHRF-1‥等，此類蛋白質受到活化大量表現，可阻斷因細胞存活因子短缺或輻射、抗癌藥物等不同刺激誘發的細胞凋亡。抑制凋亡的機制是與促凋亡蛋白(Proapototic)直接鍵結，改變其構型，阻止促凋亡蛋白(Proapototic)穿越粒線體，間接阻止 Cytochrome c 從 mitochondria 釋出，從而阻斷 Apaf-1 對 caspase-9 的活化，

抑制細胞凋亡。

2.促凋亡蛋白(Proapototic):此類有 Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、Bid、Bik、Hrk、

Bim、Bok 和 Bmf…等，這類蛋白質主要功能為促進細胞凋亡的發生。如促進凋亡的Bik，可持 Apaf-1 從 Bcl-XL 中解脫出來，ApaH 與 pocaspase-9 和Cytochrome c 形成一複合體，促使 pro-caspase-9 進一步活化，caspase-9

Caspase-3 進一步活化，導致細胞凋亡。

外流至細胞質中。MPT 同時也會造成粒線體膜電位 (mitochondrial transmembrane potential; MMP)下降及 mitochondrial uncoupling 之現象，

最終導致大量反應氧化物(reactive oxygen species：ROS)之聚積，進而造成細胞之傷害導致細胞凋亡。

※ ²⁺離子與細胞凋亡：細胞內液Ca²⁺過量時，會誘發細胞膜孔道的打開，產生粒腺體膜電位改變。當細胞由粒腺體路徑誘發細胞凋亡，由粒腺體會釋出 Cytochrome c ，活化 Apaf-l ，進而活化 caspase-9 ，導致細胞核的裂解 (fragmentation)以及促進 apoptosis。故偵測鈣離子(Ca²⁺)可以作為細胞凋亡的監測指標之一⁷³。

圖 1. 13 由 Ca²⁺

訊號誘導細胞凋亡之可能機轉

⁷³

Proposed mechanisms of apoptosis induced by Ca²⁺ signals. Abbreviations: ER, endoplasmic reticulum;NF-AT, nuclear factor of activated T cells. Two pathways are recognized, one that is indirect and requires the activation of death receptors such as CD95 (Fas, APO-1) and a second pathway where Ca²⁺ is the direct effector of apoptosis.

In the latter case, the two major targets are the mitochondria and the ER. Further details are given in the text.

四、粒腺體膜電位與細胞凋亡^74~81

細胞凋亡時，粒腺體內膜發生動態改變及由多個蛋白質組成的通透性轉變為孔道 (PT 孔道)，粒腺體內膜兩側氫離子梯度消失、粒腺體膜電位下降、使粒腺體的外膜漲破，而Capase-inducing factors(Cytochrome c 和 AIF)釋放到細胞質液中，造成細胞死亡。粒腺體膜電位的改變為細胞凋亡啟動的指標，細胞凋亡啟動的機制之一為粒腺體膜的通透性的增加。

粒腺體膜電位(-150 mV)的存在，使一些親脂性陽離子螢光染料如碘化 3,3-二己基氧碳氰(3,3-dihexyloxacbocyanine iodide，DiOC6)，可進入粒腺體基質，其螢光的強弱可反映粒腺體膜電位的高低，可以利用此原理以流式細胞儀加以偵測

細胞凋亡。如用 DiOC6 欲測量細胞在受刺激後之膜電位的變化時，先將細

胞放入含 DiOC6 之溶液中，達到濃度平衡時，細胞內會含較高濃度之染劑

而發螢光，然後以 PMA 或 fMLP 刺激細胞，並在適當時間內上機分析，

如細胞失去原有之負電荷，則細胞內之染劑濃度會降低，螢光強度會降低，

表示該受體之信號傳遞功能正常。

五、活性氧化物( Reactive oxygen soecies; ROS)與細胞凋亡^82~85

5.1 傳統的觀念認為：細胞代謝會產生一種活性大的副產物，稱為活性氧化物 (reactive oxygen species：ROS)，它會傷害細胞造成 DNA 傷害。ROS 會調節多種細胞的死亡，高濃度的活性氧化物會導致脂質過氧化、細胞膜損傷、或直接損傷細胞並促使細胞壞死。而低濃度的活性氧化物會活化蛋白質激酶和磷酸酶、鈣離子儲存、活化或未活化轉錄因子和導致細胞凋亡的現象。在粒

在文檔中 2-[氮-多樣取代苄基]取代苯胺基-4-酮基-4,5-二氫呋喃-3-羧酸乙酯類衍生物之合成及其生理活性; Synthesis and Biological Activity of Certain Ethyl 2-[N-various Substituted benzyl]Substituted anilino-4-oxo-4,5-dihydrofuran-3-carboxylate (頁 27-39)