本論文將PRSV-SMN、PRSV-SM 與 PRSV-DF 三系統之全長 cDNA 感染性選 殖株構築完成，病毒基因體之5’端上游有 bacteriophage T3 RNA polymerase promoter 與一個 guanine，3’端接續一段 poly(A)，使胞外轉錄產物更接近 potyvirus 自然組成，RNA 分子之 5’端具有 cap 構造、3'端帶有 poly(A) tail，並在接種寄主
木瓜後成功感染且出現病徵。先前雖已有多個PRSV 感染性選殖株之研究(陳，
2001；劉，2008；Chiang and Yeh, 1997)，但本研究特別以不同病理特性的 PRSV 系統為基礎，分別建構不同PRSV 系統的感染性選殖株，將有助於瞭解 PRSV 基
因體與致病特性之間的關係。另一項研究重點為分析臺灣PRSV 系統之序列變異，
經由三種系統全長選殖株再次定序，探討病毒序列是否與數年前所解序者有所變 異，藉以探討病毒在田間生態、病徵表現的演化情況(翁，1981；吉井，1986；廖，
2004)。將來可進一步藉由病毒基因體重組試驗，觀察序列置換後的感染情況與病 徵表現，篩選導致重組病毒病徵更動的關鍵片段，有助於鑑別出病徵決定的關鍵 基因或序列。
進行病毒核酸片段增幅原先選用 Advantage 2 polymerase，但定序比對後發現 序列準確度不足，SM 系統基因選殖的過程中 NIb 基因後端更出現片段漏失情形，
SMN 系統部分核酸也發生點突變影響選殖株之感染力。改用高校正能力的 Phusion DNA polymerase 重新建立選殖株，構築之三種 PRSV 系統全長選殖株定序結果與 原病毒株序列比對下，可見到三種系統的選殖株仍有部分核苷酸呈現單點變異，
但非集中於特定區域，對於選殖株之接種感染也未見明顯影響；唯獨SMN 系統的
兩組選殖株與病毒原始序列比對下，在P1、6K2、NIa 及 CP 基因之胺基酸序列同 時出現異變，使序列相似度分析些微有別於過往比對結果(廖，2004；李，2006)。
曾有研究指出構築選殖株時，載體嵌入的病毒序列可能對於 E. coli 具有細胞 毒性，造成質體在細菌宿主中發生非特異片段重組、突變或剔除等不穩定現象
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(Boyer and Haenni, 1994)。本次在構築 DF 系統選殖株時，於核酸位置 7359- 8353 亦發生類似情形，經PCR 增幅的片段 Na-CP-DP 在選殖過程中，無法篩選到與載 體 lacZ 基因反向之選殖株，且此段區域造成菌株生長數量下降，包括帶有質體 pfNa-CP-DP、pfNa-AX-DP pfT3-AX-DP 和 pT3-NP 之菌株在相同培養條件及時間，
抽取質體所獲產量約只有其他選殖株的五分之一；SM 系統調換嵌入序列方向成為
pfT3-AX-MP 後產量也提升一倍，SMN 系統則不因特定方向出現差別。另外在 SMN
及SM 系統涵蓋此區域的質體似乎會使菌落加快生長速率，對照病毒基因體圖譜
該片段落在NIa-Pro 及 NIb，但引起這種現象的機制尚不明確。
接種試驗發現在感病品種TN2 的木瓜植株上，若以自然的 PRSV 病毒株進行
感染，接種後第9 天可在系統葉觀察到初期病徵，但若以三種系統選殖株之胞外
轉錄RNA transcripts 進行感染，直到第 16 天才出現輕微葉脈透化。此現象與先前 的研究結果近似(劉，2008)；另一研究也顯示 PRSV 分離株 P-YK 的選殖株接種木 瓜後病徵顯現也延遲2 到 3 天(Chen et al., 2008)，但 P-HA 的感染性選殖株在接種 後9-12 天出現病徵，發病速率與接種病毒或 native RNA 無區別(Chiang and Yeh, 1997)。除發病時間延遲外，接種胞外轉錄 RNA transcripts 的木瓜株病徵發展進程 也有別於對照組，在接種胞外轉錄RNA transcripts 的實驗組，SMN 與 DF 系統之 RNA transcripts 感染木瓜後，在中期新葉葉緣嚴重捲曲，接著頂端新生葉才呈畸形 或絲狀；對照組木瓜(PRSV 自然感染者)在 DF、SMN 系統則直接長出新生畸形葉 或絲狀葉，SM 系統之葉面斑駁也是第三週開始快速加劇，不似 RNA transcripts 感
染者需等待數週後葉片才出現明顯嵌紋斑駁。而到罹病中後期，三種PRSV 系統
選殖株與病毒皆造成系統特異的典型病徵。當進行繼代接種時，由於病毒RNA
transcripts 應已在木瓜寄主內形成正常病毒顆粒，再予接種後病徵之展現與出現時 間即回復如自然感染者。由此可見選殖株合成之RNA transcripts 在寄主細胞內的 感染情況應有別於完整的病毒，RNA transcripts 可能因缺乏病毒基因體 5’端所連結 VPg 以及 CP 蛋白包覆，導致 RNA transcripts 侵染細胞初期需要更長時間克服寄主
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抵抗及進行系統性移動，使病徵發展具差異性。這類人工構築選殖株發病延遲的 現象無論 in vitro/ in vivo transcription 接種都有發現(Chen et al., 2008; Domier et al., 1989; Gal-On et al., 1991; Maiss et al., 1992)，但 PRSV 病毒株之間發病延遲的程度 不一，在P-HA 選殖株接種試驗無分別，P-YK 遲了 2 至 3 日，本次研究的選殖株 則延後7 天才出現病徵。
在接種試驗中，選殖株prT3-AX-NP、prT3-AX-MP、pfT3-AX-DP 的 RNA transcripts 平均皆有 70%以上感染發病率，在低溫環境甚至可達 100%，與其他 potyvirus 之人工構築選殖株如 Zucchini yellow mosaic virus(11%) (Gal-On et al., 1991)、Tobacco vein mottling virus(5.5%) (Domier et al., 1989)、Plum pox virus(48%) (Maiss et al., 1992)相比成功率提昇許多，也比 P- HA(56%)來得高。但環境溫度升
高時發病率即會降低至50%，可能因植株生長勢良好時對接種病毒的抵抗能力增
強，且先前研究發現環境溫度對PRSV 在木瓜之病徵發展及發病速度具顯著影響
(Mangrauthia et al., 2009)，將來可藉改善試驗條件提升接種成功機率(Maiss et al., 1992)。SMN 系統選殖株 prT3-AX-NA 其發病率偏低，接種十餘棵木瓜僅在兩棵發
病，然而成功感染之木瓜株病徵並無異樣，未來或許可就SMN 系統兩組選殖株在
特定位置的序列變異情況再做探討。
另外在PRSV 系統間專一性分子鑑定上，由於過去所用的 DF 系統專用引子對 DF-598 在 SM 及 DF 的系統鑑別上不夠穩定，故從其 CI至6K2 基因片段重新設計
一組引子對DF-626，可做極佳的專一性增幅，清楚做出系統鑑別，建議今後以
DF-626 取代 DF-598 進行 RT-PCR。
此次所得的感染性選殖株在植物寄主上引發病徵與前人記錄略有區別，在木 瓜上發病初期莖頂未出現水浸狀斑點、SMN 系統的嵌紋病斑上也無壞疽斑點產 生；繼代接種在較大株齡TN2 木瓜，即可觀察到 SMN 系統造成之壞疽。推測可
能原因為試驗選擇的木瓜株齡較小所致，以往接種一般使用株高30 cm、且莖部較
粗的木瓜上較易觀察到莖頂水浸狀斑點。在指示植物白藜葉上接種RNA
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transcripts，並未如其他 PRSV 病毒株出現大量局部壞疽病斑(陳，2001；Chen et al., 2008; Chiang and Yeh, 1997)：SMN 與 SM 系統僅在一次接種試驗中各引起一個褪 色黃化斑點，DF 系統則未於藜葉上產生病斑，三系統進行繼代接種才在藜葉造成 少量局部病斑，顯示本研究所得之選殖株在白藜形成局部病斑的病原性較低，與 早先提出關於三病毒系統在白藜接種試驗之推論雷同(廖，2004)。
將本次研究構築之全長選殖株進行定序，與原病毒株序列相互比對，全長及 個別基因區域之長度、組成大多無異，間或有少數序列異變散佈。其中一處明顯 差異現於DF 系統在核酸位置 8182- 8189 有一連續片段位移，與另外兩系統序列做
比較，推測應是先前定序時發生的錯誤，比對當前所發表之PRSV 其他序列，推
斷目前所定之序列應為正確。DF 系統兩組選殖株 pfT3-AX-DP、pT3-NP 在基因體 幾處各有單點序列異動，但在接種感染力及病徵表現未見分別。SMN 系統先後構 築之兩組全長選殖株在若干處同時出現序列變動，多數集中於6K2、VPg 和 3’-UTR 基因區，並影響轉譯致使ORF 胺基酸序列改變，特別是在 P1、6K2、NIa 與 CP
等病毒蛋白。近年實驗發現SMN 系統之病徵與過往記載有部分不符，早期 SMN
系統感染木瓜會使葉片變小、產生嚴重嵌紋及壞疽病斑；新近觀察到SMN 系統接
種後除造成上述病徵，葉肉組織也略為縮減成細長葉形，但不至於達嚴重畸形，
在發病後期還會造成絲狀葉。這些病徵差異或許肇因於SMN 系統發生序列改變。
同時SMN 系統的 6K2 蛋白，在原先胺基酸序列中三系統皆為 100%相似度，卻在 新定序列顯現變異，且其中一處胺基酸異變在位置2084，鄰近先前研究 PRSV-YK 單點致變的目標位置2091，病毒胺基酸由 Tys2091人工突變改為His2091後在木瓜上 產生萎凋病徵(陳，2008)；SMN 系統之 Lys2084則是相對於另外兩系統之Gln2084， 又造成萎凋病徵的病毒株在此區特定胺基酸側基皆屬鹼性。SMN 系統在 TN2 木瓜 接種後短時間即嚴重危害根系生長發育甚至壞疽死亡，並使地上部生長遲滯(蔡，
2006)，雖然彼人工突變造成植株萎凋模式並非完全與 SMN 系統之特性一致，未 來仍可參考此推論設計試驗加以證明。
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三種系統之選殖株序列相互比對，以SM 與 DF 系統相似度最高，且在病毒接 種試驗中，兩者的發病時序彼此接近。SMN 系統則與 DF 系統較相似，更在 CI 基
因區域與DF 系統出現最高的序列相似度，特出於整體趨勢。核酸序列比對之
similarity plot 顯示 SM 與 DF 系統僅在 P1、P3 區域變異度較大，SMN 系統在 P1、
HC-Pro、P3、VPg、NIa-Pro、CP 與兩系統都有明顯序列差異。倘若進行系統間重 組試驗以觀察是否有特定基因決定病徵之表現發展，不妨從5’-UTR、P1 等高變異 性基因區著手；HC-Pro 是 potyvirus 感染寄主的重要致病因子，在抑制寄主 PTGS 機制之餘也干擾miRNA 調控、影響植株型態發展(Dunoyer et al., 2004; Mallory et
al., 2002; Shiboleth et al., 2007)，可能與 SMN、DF 系統造成葉部型態改變以及嚴重
生長障礙的病徵特性有所聯繫；P3 在一些研究中報導會與寄主蛋白分子交互作 用，影響病徵發展或病徵嚴重程度(Lin et al., 2011; Sáenz et al., 2000)，VPg 也曾報 導會妨礙寄主轉譯合成而引起病徵(Michon et al., 2006; Miyoshi et al., 2008)；此外 CI 被指出會與寄主因子行專一性結合，擾亂生理代謝平衡而造成病徵發展(Chenget al., 2008)，且是 SMN 與 DF 系統間相似度較高之處。再論及 SMN 系統獨有的
壞疽病斑及萎凋病徵，與PRSV 同屬之 PVY 有一系統群「PVYN」可在菸草(Nicotianatabacum cv. Xanthi)引起葉脈壞疽(vein necrosis)，而其病徵決定因子經證實為
HC-Pro(Rolland et al., 2009)，先前也證實 6K2 上特定胺基酸置換使 PRSV-YK 突變 株轉為萎凋型，這兩種病毒蛋白皆可能與SMN 系統的病徵決定因子有關。HC-Pro、P3、VPg、NIa-Pro、CP 與兩系統都有明顯序列差異。倘若進行系統間重 組試驗以觀察是否有特定基因決定病徵之表現發展，不妨從5’-UTR、P1 等高變異 性基因區著手；HC-Pro 是 potyvirus 感染寄主的重要致病因子，在抑制寄主 PTGS 機制之餘也干擾miRNA 調控、影響植株型態發展(Dunoyer et al., 2004; Mallory et