一、試驗植物準備
使用木瓜來自健康種子繁殖的實生苗，木瓜品種為台農二號品系(Tainung No.2, TN2)，種子浸於清水並每日更換，數日後移至潮溼環境催芽，依植株生長情況進 行換盆，最後移入七吋盆，並定期噴藥防治病蟲害與施加氮肥。
白藜種子經1%次氯酸鈉(NaOCl)溶液與 1% Tween 20 表面消毒 30 分鐘，於培 養皿內鋪上濾紙並以無菌水潤濕，再將消毒過的種子放入，待萌芽後移至穴盤中 生長，依植株生長與根系發育情況進行換盆，並定期噴藥防治病蟲害與施肥。
二、木瓜輪點病毒系統來源與保存
本實驗室保存在臺灣田間收集之 PRSV 三系統，包括嚴重嵌紋(SM)系統、畸 形(DF)系統與嚴重壞疽嵌紋(SMN)系統，系統接種原(innocula)來自本實驗室經三代
單斑分離之純系病毒系統的罹病木瓜葉或冷凍乾燥保存的粉末。接種時秤取2 g 的
罹病木瓜葉，以1:3-1:5 (w/v)之比例加入 0.05 M 磷酸緩衝液(K-P buffer: 0.1 M K2HPO4, 0.1 M KH2PO4, pH7.2; 0.1% DIECA)，利用接種棒(spatula)及磨砂玻璃板予 以磨碎，作為接種液；或取病葉之冷凍乾燥粉末加入去離子水稀釋，均勻懸浮後 做為接種液。準備健康植株並選擇第三到第五完全展開葉，於接種葉上灑上少許 矽藻土(celite)或金剛砂(carborudum)，以消毒過的接種棒沾取病毒接種液，順同方 向塗抹於葉片及葉柄，5 min 後以去離子水清洗葉面，最後以紙巾吸乾多餘水分，
即可置入隔離溫室生長，其間注意肥料管理與病蟲害防治，定期採樣偵測之。為 保有純系病毒可供試驗使用，每兩個月繼代接種病毒到新的木瓜植株。
如欲長期保存病毒樣本，可將罹病木瓜組織分裝並放置於-80˚C 冰箱，或是以 冷凍乾燥法處理：取新鮮病葉組織，加入5 倍重量 0.05 M 磷酸緩衝液，磨碎後在 4˚C 下 4,000g 離心 10 min，取上清液置入保存瓶中，在-80˚C 冰箱放至完全結冰，
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再以真空冷凍乾燥器抽乾水分後用石蠟膜封口，於-20˚C 冰箱中保存。
三、木瓜輪點病毒之偵測方法 1. 病毒核酸萃取
此法為少量植物總核酸抽取法(total nucleic acid extract method)，乃參考先前方 法 (Hung et al., 1999)並作些許修改。取 0.3 g 植物組織以液態氮於研缽中研磨成粉 末，加入1.8 mL 核酸萃取緩衝液(100 mM Tris-HCl, 100mM EDTA-2Na, 250 mM NaCl, pH8.0)混合均勻，再加入 0.3 mL 10% Sarkosyl(N-Lauroyl-sarcosine)，倒入 1.5 mL 微量離心管中，於 55˚C 乾浴槽(BL3002; BasicLife Bioscience Inc., Taiwan)作用 1 hr。以微量高速離心機(Centrifuge 5415 R; Eppendorf AG, Hamburg, Germany)室溫 下6,000 g 離心 5 min，取上清液 0.8 mL 置於新離心管，並加入 100 µL 5 M NaCl 及100 µL 10% CTAB (hexadecyl-trimethyl-ammonium-bromide in 0.7 M NaCl)，混合 均勻後65˚C 乾浴 10 min，再加入 600 µL CI (Chloroform: Isoamyl alcohol = 24: 1)，
充分混合至乳狀。室溫下12,000 g 離心 5 min，取上清液 880 µL 置於新離心管中，
並加入600 µL PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol = 25: 24: 1)，充分混合至乳 狀。室溫下12,000 g 離心 10 min，取上清液 700 µL 加入 420 µL isopropanol 輕輕混 勻。置於-20˚C 待 30 min，於 4˚C 下 12,000 g 離心 10 分鐘，倒掉上清液，管底沉 澱以500 µL 70%酒精(ethyl alcohol)潤洗，再用抽氣乾燥 10 min。最後以 150 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)充分溶解之，於-20˚C 保存。
2. Two-Step RT-PCR
反應過程分二步驟，先將病毒 RNA 反轉錄(reverse transcription)成互補股 DNA (complementary DNA, cDNA)再進行 PCR(polymerase chain reaction)。反轉錄過程如 下：取7 µL RNA template，加入 2 pmole Reverse primer 及 4 µL 2.5 mM dNTP mix (dATP, dTTP, dCTP and dGTP)，65˚C 作用 5 min，立即置於冰上。加入 4 µL 5X 1st
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strand buffer、2 µL 0.1 M DTT (1,4-dithiothreitol)及 1 µL reverse transcriptase (SuperScriptTM II Reverse Transcriptase, 200 U/µL; InvitrogenTM)，在 42˚C 作用 1 hr 即可得到總體積20 µL cDNA 產物。
接續進行PCR 增幅，PCR 反應溶液含 2.5 µL 10X PCR buffer (with 15 mM MgCl2)、2.75 mM MgCl2、0.2 mM each dNTP、0.4 mM each primer (附錄三)、0.25 µL
Taq DNA polymerase (Super-Therm DNA polymerase, 1 U/µL; BERTEC)及 1 µL
cDNA template，加 ddH2O 調整反應總體積至 25 µL。將混合好之反應溶液放置 PCR 熱循環反應器內(GeneAmp 2720; Applied Biosystem Corp., Norwalk, CT, USA)，PCR 溫度循環條件為：94˚C/3 min，[94˚C/1 min、annealing temp./1 min、72˚C/2 min]共 30 個循環，72˚C/10 min。PCR 增幅產物以 1.4% agarose gel 進行電泳膠體分析(Hunget al., 2000)。
3. One-Step RT-PCR
此偵測方法係將前述二個步驟合併進行。RT-PCR 反應溶液含 2.5 µL 10X PCR buffer (with 15 mM MgCl2)、2.5µL 5X 1st strand buffer (with 15 mM MgCl2)、5 mM DTT、2.5 mM MgCl2、0.2 mM each dNTP、0.4 mM each primer(附錄三)、0.25 µL Taq DNA polymerase、0.25 µL reverse transcriptase 及 2.5 µL template，以 ddH2O 調整反 應總體積至25 µL。RT-PCR 溫度循環條件為：42˚C/50 min 或 50˚C/35 min，94˚C/2 min，[94˚C/30 sec、annealing temp./30 sec、68˚C/45 sec]共 10 個循環，[94˚C/30 sec、
annealing temp./30 sec、68˚C/45 sec*，*：每循環增加 5 sec]共 25 個循環，68˚C/10 min。增幅產物以 1.4% agarose gel 進行電泳膠體分析(Hung et al., 2000)。
4. PCR 產物電泳膠體分析
PCR 反應結束後，取 10 µL PCR 產物和 2 µL 6X loading dye 混合均勻，在 1.4%
agarose gel 中進行電泳分析。依據 DNA marker (BIOLADDER® 100 bp DNA Ladder;
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BasicLife Bioscience Inc.)判別產物分子量。電泳緩衝液為 0.5X TAE buffer(20 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)，以 100V 進行電泳。完成後膠體以 0.5 µg/mL EtBr (ethidium bromide)染色，使用數位化影像處理與分析系統(AlphaImager® AlphaEaseFC Software; Alpha Innotech Co., USA)觀察膠體內分離之 DNA 條帶。
四、 木瓜輪點病毒 PRSV-SMN、PRSV-SM 之感染性選殖株構築 1. PRSV 核酸序列通用性引子對設計
參照實驗室前人所發表 PRSV-SM 及 PRSV-SMN 的全長核酸序列(李，2006；
廖，2004)，以引子設計軟體 PrimerSelectTM (DNASTAR, Inc., USA)與 Oligo 7 (Molecular Biology Insights, Inc., USA)分析兩系統序列，選取具特異性之序列合成 引子，並在部分引子5’端更動序列以導入限制酶切位(表一)。正向引子 T3F 在前端 外加T3 promoter 及一個 guanine，3’ UTR 所用 reverse primer 為 25 nt 之 oligo(dT) 接續限制酶 XbaI 切位序列，使 PCR 產物帶有 poly(A) tail(劉，2008)。
2. Conventional RT-PCR
先將萃取完成之病毒核酸做反轉錄以合成cDNA，目標片段之增幅選用具校正
(proofreading)功能之聚合酶。使用 Advantage® 2 PCR kit (Clontech Laboratories, Inc.) 進行PCR，反應溶液含 5 µL 10X Advantage 2 PCR Buffer、0.25 mM each dNTP、0.4 mM each primer、1 µL 50X Advantage® 2 Polymerase Mix 以及 5 µL cDNA
template，添加 ddH2O 調整總體積至 50 µL。PCR 溫度循環條件為：94˚C/1 min，
[95˚C/30 sec、63˚C/1 min、72˚C/1 min per kb]共 25 個循環，加入 0.5 U Taq DNA polymerase 再以 72˚C 作用 10 min。PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy)之反應溶液配置為 10 µL 5X Phusion HF Buffer (with 7.5 mM
MgCl2)、2.5 mM MgCl2、0.25 mM each dNTP、0.5 mM each primer、0.5 µL Phusion DNA polymerase(2 U/µL)與 3µL cDNA template，以 ddH2O 調整總體積至 50 µL。
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PCR 溫度循環條件為：98˚C/30 sec，[98˚C/5 sec、63˚C/12 sec、72˚C/40 sec per kb]
共25 個循環，72˚C/10 min。反應完成之 PCR 產物使用 PCR Clean-up Kit (GeneMark) 純化，最後以45 µL elution solution 溶離核酸而收集之。純化完成的 PCR 產物加入 5 µL 10X PCR buffer、0.2 mM dATP 及 1 U Taq DNA polymerase，在 72˚C 作用 20 min。膠體純化 PCR 產物時使用 0.8-1% agarose gel 進行電泳，以 DNA marker (AccuRuler 1 kb DNA RTU Ladder; Maestrogen, Inc.)判別產物之分子量，再用乾淨刀 片切下目標片段，利用QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN Group)予以純化。
3. PCR 產物之選殖
PCR 產物利用 pGEM®-T Vector System I (Promega)進行選殖，步驟為將 3 µL 純化產物、5 µL 2X Rapid Ligation Buffer、1 µL pGEM®-T Vector (50 ng/µL)與 1 µL T4 DNA Ligase (3 U/µL)混合，在 16˚C 進行接合反應(ligation)過夜。隨後進行轉型 作用(transformation)，將接合產物送入 Escherichia coli strain JM109。反應產物加入 大腸桿菌勝任細胞(ECOSTM 9-5 E. coli competent cell; Yeastern Biotech Co., Ltd.)中 混合，冰浴10 min 後在水浴槽(WB201; Kansin Instruments Co., Ltd., Taiwan)以 42˚
C 熱休克(heat shock) 45 sec，再將菌液置於冰上 5 min。經藍白篩(blue-white screen) 挑選成功轉入載體之菌株，先在1.5% LB 固態培養基(LB plate,含 50µg/mL
ampicillin)上加入 40 µL X-gal (40 mg/mL in DMF)及 40 µL 100mM IPTG 均勻塗佈 後，經heat-shock 處理之菌液塗佈於 LB plate/Amp 中，在培養箱(TU-400; YIH DER Instruments Co., Ltd., Taiwan)以 37˚C 培養 13-16 hr。隨機挑選白色菌落分別接種於 LB plate/Amp 及 1 mL 液態培養基(LB broth,含 50 µg/mL ampicillin)，37˚C 培養 12-16 hr (LB broth/Amp，200 rpm 震盪)，保存於 4˚C。
培養好的1 mL LB culture 利用 Gene-SpinTM Plasmid MiniPrep Kit (Protech)純化 微量質體(plasmid)，按流程操作並以 50µL elution solution 溶離質體。獲得之微量 質體以限制酶酵解確認目標片段之存在，即可大量培養進行後續實驗，可使用
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Gene-SpinTM Plasmid MiniPrep Kit 抽取 4 mL LB culture，溶離於 100 µL elution solution；或培養 30-50mL LB culture，以 AxyPrep Plasmid Midiprep Kit (AXYGEN) 抽取質體，最後以300 µL elution solution 溶離。
4. PRSV 全長序列選殖株之合成
以MapDraw TM (DNASTAR, Inc., USA)程式分析 pGEM®-T Vector 及病毒序 列，選取適當限制酶切位。利用限制酶(Restriction Endonucaleases; New England Biolabs®, Inc.)進行酵解，反應溶液含純化質體、1X NEBuffer、1X BSA (Bovine Serum Albumin)，以 ddH2O 調整體積，加入限制酶並設定適當反應溫度作用 1 hr；
進行部分酵解時1 µg 質體加入 0.1 U 限制酶，在反應溫度作用 75-90 min。經膠體 純化之目標片段用T4 DNA Ligase (6 U/µL; New England Biolabs®, Inc.)行接合反 應，將欲接合之片段、1 µL 10X Ligation Buffer 與 1 µL T4 DNA Ligase 配置成 10 µL 反應液，16˚C 過夜後送入 E. coli 勝任細胞。
五、胞外轉錄(in vitro transcription)
將帶有全長序列之選殖株質體以 XbaI 酵解 2-3 hr，得到之線狀質體以 PCI 處 理去除蛋白質，加入0.1 倍體積 3M NaOAc (sodium acetate)、3 倍體積 99.5%酒精 與1 µL glycogen (20µg/µL; Roche)混合均勻，置於-20˚C 過夜。隔日 4˚C 下 12,000 g 離心 15 min，移去上清液再加入 500 µL 70%酒精，4˚C 下 12,000 g 離心 15 min，
倒掉上清液並抽氣乾燥10 min，核酸沈澱物溶於 6 µL DEPC-H2O。使用 T3 mMESSAGE mMACHINE® Kit (Ambion®)進行 in vitro transcription 以合成 capped RNA transcripts，步驟為取 6 µL 產物加入 2 µL 10X Reaction Buffer、10 µL 2X NTP/CAP mix、2 µL enzyme mix，置於 37˚C 反應 30 min。加入 1 µL 30mM GTP solution 於 37˚C 反應 30 min，再加 1 µL 30mM GTP solution 置於 37˚C 反應 2 hr。
取1 µL 產物做電泳分析確認後進行接種。若欲定量需去除 template DNA，將 RNA
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產物加入1 µL TURBO DNase，在 37˚C 反應 15 min 後以 PCI 處理，再以 0.6 倍體 積isopropanol 或 2 倍體積 99.5%酒精沉澱，以 TE buffer 或 DEPC-H2O 溶解產物。
六、接種試驗
胞外轉錄所得之 RNA transcripts 進行機械接種到寄主植物木瓜及白藜，每片 葉片接種至2-3 µg RNA：選取約 3-4 片展開葉之木瓜幼苗，接種第一、第二片展 開葉(Chiang and Yeh, 1997)；白藜在生長至約 7-8 片展開葉時接種。使用經漂白水 清洗及高壓滅菌消毒之玻璃棒與金剛砂進行機械接種，接種後置於溫室及植物恆 溫生長箱(26˚C)(GC-101; FIRSTEK, Taiwan)隔離觀察，4 週後取接種葉之上位葉進 行核酸純化，並以RT-PCR 檢測，所使用引子對有通用型引子對 PRSV 476，與不 同系統之專一型引子對SMN-466、SM-517、DF-598，分別進行增幅及電泳分析。
七、選殖株之基因序列分析
選殖株的病毒全長序列皆委外定序(Tri-I Biotech, Taiwan)，並經 NCBI 的 BLAST®(Basic Local Alignment Search Tool)程式做比對分析，參考前人發表序列得 到選殖株所嵌入之病毒全長基因體cDNA 序列，並使用 Clustal X (Larkin, et al., 2007)進行多重序列比對(multiple sequence alignment)分析，所得結果輸入
PAUP*(Sinauer Associates, Inc.,USA)作親緣關係演算，套用 neighbor-joining 法及 Hasegawa-Kishino-Yano (HKY) model、並以 Potato virus Y (GenBank accession No.
AB270705)為外群，產生 PRSV 分離株之親源樹狀關係圖。病毒各基因區域之序列 相關比較分析使用分析軟體MegAlignTM (DNASTAR, Inc., USA)以 J. Hein method 進行比對，SimPlot 則以 Kimura’s two parameter model 演算(Lole, et al., 1999)。
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