一、R1441H、R1628P、G2385R 對 LRRK2 蛋白在細胞內的位置及 合成的影響
外生性LRRK2 蛋白廣泛表現在細胞質，也會表現於粒線體(West et al., 2005) ，甚至在內質網和高基氏體都有發現和 LRRK2 的部份共 位現象(Partial co-localization ) (Gloeckner et al., 2006)。本研究中針對 LRRK2 的 R1441H 突變點及 R1628P 和 G2385R 兩個危險因子進行探
討，不論在野生型LRRK2 或是帶有 R1441H、R1628P 和 G2385R 的 LRRK2 的部份，EGFP 綠螢光與 DAPI 核染劑的藍螢光皆沒有重疊(圖 九A)，顯示 R1441H、R1628P 和 G2385R 這些變異點的 LRRK2 蛋白，
主要仍分佈在細胞質。進一步胞器染色的顯微影像觀察，帶有R1628P 與野生型的 LRRK2 與粒線體及溶小體有較多的重疊，而帶 R1441H 和G2385R 的 LRRK2 與粒線體、溶小體重疊較少(圖九B、C)。內質 網是蛋白質轉譯後修飾的場面，在內質網染色的顯微影像中，帶有 R1441H、R1628P 和 G2385R 的 LRRK2 都有與內質網重疊(圖九 D)，
顯示R1441H、R1628P 和 G2385R 這些變異點不會影響 LRRK2 蛋白 進入內質網作修飾。
二、R767H、S885N、R1441H、G2019S 突變的 LRRK2 形成聚集的 情形
數個研究指出，從PD 病人的腦組織切片的路易氏體有免疫染色
觀察到有LRRK2 蛋白的存在(Greggio et al., 2006; Giasson et al., 2006;
Zhu et al., 2006; Perry et al., 2008; Alegre-Abarrategui et al., 2008)，而路 易氏體主要為α-synuclein 所構成，進一步推測 LRRK2 對 α-synuclein 之間有交互作用，所以有研究團隊以免疫共沉澱的技術證實路易氏體 中的LRRK2 和 α-synuclein 有蛋白質間交互作用，並在共轉染 LRRK2 和 α-synuclein 且受氧化壓力下的 HEK293 細胞，得到與前者組織中 路易氏體相同的結果(Qing et al., 2009)。然而有研究發現，在共轉染 LRRK2 和 α-synuclein 的細胞中，在大量表現 LRRK2 蛋白下出現的 LRRK2 蛋白包含體卻沒有發現 α-synuclein 的存在(Waxman et al., 2009)。本研究選殖 α-synuclein 的 cDNA 構築成標記 Myc-His 的 α-synuclein 載體，並使用 SK-N-SH 細胞共轉染標記 EGFP 的 LRRK2 與標記 Myc-His 的 α-synuclein 質體，兩天表現後進行細胞免疫螢光 染色，結果顯示帶有 R1441H 與 G2019S 的 LRRK2 似乎較容易形成 聚集，然而這些聚集確沒有發現α-synuclein 的存在(圖十二)，這個結 果與Waxman et al. (2009)是相似的，推測 LRRK2 與 α-synuclein 間的
交互作用可能有其他成員的參與，有待日後進一步的研究驗證。
針對帶有R1441H 與 G2019S 的 LRRK2 似乎較容易形成 LRRK2 蛋白聚集，本研究使用 HEK293T 細胞轉染標記 EGFP 的 LRRK2 質 體，以活細胞螢光顯微鏡在轉染2 天、4 天及 6 天後進行細胞觀察和 影像拍攝，計算細胞LRRK2 蛋白聚集與細胞數量後，進行統計分析，
結果顯示於圖十三。與野生型的 LRRK2 相比較，帶有 R1441H 與 G2019S 的 LRRK2 顯著地會形成較多 LRRK2 蛋白聚集。這些 LRRK2 蛋白聚集雖然沒有 α-synuclein 的存在，但這種因蛋白質氨基酸改變
導致容易形成聚集，可能和PD 的致病機轉有一定程度上的關聯，其
關聯還有待進一步的研究驗證與探討。
三、R767H、S885N、R1441H、G2019S 突變的 LRRK2 形成二元體 的情形
LRRK2 蛋白在細胞中會部份形成二元體，不論在活體中或活體 外皆被證實(Deng et al., 2008; Greggio et al., 2008; Sen et al., 2009)，二
元體的形成代表LRRK2 蛋白在細胞中與其單體可能有不同的生理功
能，因此研究 LRRK2 蛋白二元體的形成機轉有助於釐清 LRRK2 蛋 白在細胞中扮演的角色。在過去研究指出，LRRK2 蛋白的第 935 個
胺基酸(S935)是一個重要的磷酸位點，免疫共沉澱試驗證實該磷酸位 點突變後不會影響LRRK2 蛋白二元體的形成(Li et al., 2011)。因此本 研究以His 標記蛋白沉降試驗，試圖探討在 R767H、S885N、R1441H、
G2019S 等突變的 LRRK2 蛋白在二元體形成能力上是否有所差異。
從圖十六B定量統計結果顯示，上述變異點 LRRK2 的二元體結合能 力相較野生型均無顯著差異，故推測R767H、S885N、R1441H、G2019S 等變異的 LRRK2 蛋白的致病機轉與 LRRK2 蛋白二元體形成能力無
關，因此日後研究可以著重在LRRK2 蛋白二元體和單體在生理功能
上所扮演的角色。
四、R767H、S885N、R1441H、G2019S 等突變的 LRRK2 蛋白與 ARHGEF7 蛋白的交互作用
LRRK2 蛋白包含多個功能區，目前研究 LRRK2 蛋白功能主要是 針對其兩個具有酵素活性的功能區－ROC 和 MAPKKK 功能區。
MAPKKK 功能區具有激酶活性能夠使其受質磷酸化或是自我磷酸 化，而 LRRK2 蛋白明確的受質尚不清楚；ROC 功能區具有 GTP 水 解酶活性能夠使GTP 水解成 GDP。雖然 LRRK2 變異導致 PD 的致病
機轉尚不清楚，但推測與其激酶活性或 GTP 水解酶活性的變異相關
借此瞭解 LRRK2 蛋白變異的致病機轉。本研究亦擬探討 R767H、
S885N、R1441H 變異是否影響 LRRK2 蛋白的 GTP 水解酶活性。由
於 ARHGEF7 蛋白會幫助 LRRK2 蛋白上結合的 GDP 轉換成 GTP (Haebig et al., 2010)，因此建構 ARHGEF7-V5-His 質體，期望藉分析 ARHGEF7 與變異的 LRRK2 蛋白之間的交互作用，來探究上述變異
點對LRRK2 GTP 水解酶活性的影響。結果發現 S885N、R1441H 或 G2019S 的 LRRK2 與 ARHGEF7 蛋白的交互作用顯著減弱(圖十八)。
先前 Haebig團隊研究 R1441C 變異，發現 R1441C 變異導致 LRRK2 與 ARHGEF7 結合減弱，此結果與本研究的 R1441H 相似。由於與 ARHGEF7 結合的減弱會進一步導致 LRRK2 的 GTP 結合及水解酶活 性降低(Haebig et al., 2010)，且帶有 R1441C 的全長 LRRK2 蛋白水解 GTP 的活性較野生型弱(Xiong et al., 2010)，故推測 R1441H 突變導致 的LRRK2 GTP 結合及水解酶活性降低，與 PD 致病機轉相關。值得 一提的是，本研究探究的新穎突變S885N LRRK2 與 ARHGEF7 交互 作用亦顯著低於野生型 LRRK2，故推測 S885N 雖不在 ROC 功能區 上，可能還是會影響LRRK2 水解 GTP 的活性，此有待日後進一步的 LRRK2-GTP 結合及水解酶活性測試研究來證實。另外，本研究的 G2019S 的結果與Haebig 團隊的報導相異，亦有待進一步探討。