圖一、LRRK2 蛋白結構及基因突變。LRRK2 蛋白具有 6 個重要的功
能區塊(domains)，包括ANK (Ankyrin repeat)、LRR (Leucine-rich repeat)、ROC (Ras of complex protein)、COR (C terminal of ROC)、
MAPKKK (mitogen activated protein kinase kinase kinase)以及WD40
等。基因上方紅色標記者(I1122V、R1441G、R1441C、Y1699C、
G2019S、I2020T)為已確定會造成疾病的突變，橘色標記者(R793M、
I1371V、R1441H、A1442P、G2385R)為無法完全確定但是可能造成 疾病的突變，其餘藍色標記者為發現於PD病人的變異，但是否會造 成疾病仍沒有證據。圖上並標示出本論文所研究的R767H、S885N、
R1441H、R1628P、G2019S、G2385R等變異。(圖形修改自Giasson and Van Deerlin, 2008)
圖二、EGFP 及 Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA 質體(包含 S1647T、
M2397T 多型性)。LRRK2-EGFP、LRRK2-Myc-His 分別置入 pcDNA3 載體的 NotI、NotI/XhoI 限制酶切位，圖形上方並標示出 BamHI、XhoI 限制酶切位間的Myc epitope 及 Polyhistidine tag。
圖三、R1441H、R1628P、G2385R 變異的 LRRK2-EGFP 重組質體的
構築。將帶有 EGFP 的野生型 LRRK2 質體(包含 S1647T、M2397T 多型性)，利用 XbaI 限制酶切下包含 R1441H、R1628P、G2385R 變 異的片段，選殖到 pGEM-T 質體 SpeI 限制酶切位間，進行定點突變，
得到 R1441H、R1628P、G2385R 變異片段的質體。再將突變好的片 段以 EcoNI、XhoI 限制酶切下，置換野生型 LRRK2-EGFP 質體上相 對 應 的 片 段 ， 即 完 成 pLRRK2/R1441H-EGFP 、 pLRRK2/R1628P-EGFP、pLRRK2/G2385R-EGFP 重組質體的建構。
圖四、Myc-His 標記的 α-synuclein cDNA 質體。α-synuclein-Myc-His 置入 pcDNA3 載體的 NotI、XhoI 限制酶切位，圖形上方並標示出 BamHI、XhoI 限制酶切位間的 Myc epitope 及 Polyhistidine tag。
圖五、G2019S 變異的 LRRK2-EGFP 重組質體的構築。將帶有 EGFP 的野生型LRRK2 質體(包含 S1647T、M2397T 多型性)，利用 XbaI 限 制酶切下包含R1441H、R1628P、G2385R 變異的片段，選殖到 pGEM-T 質體 SpeI 限制酶切位間，進行定點突變，得到 G2019S 變異片段的質 體。再將突變好的片段以 EcoNI、XhoI 限制酶切下，置換野生型 LRRK2-EGFP 質體上相對應的片段，即完成 pLRRK2/G2019S-EGFP 重組質體的建構。
圖六、V5-His 標記的 ARHGEF7 cDNA 質體。ARHGEF7 cDNA 置入 pcDNA3.1/V5-His 載體的 BamHI、SfuI 限制酶切位，pcDNA3.1/V5-His 載體上並標示出V5 epitope 及 6×His tag。
圖七、R1441H、R1628P、G2385R 變異的 LRRK2-EGFP 重組質體的
限 制 酶 圖 譜 分 析 。 野 生 型(WT) 及 突 變 (R1441H) 或 多 型 性 變 異 (R1628P、G2385R)重組質體經限制酶 ClaI + XhoI 切割後的 0.8%洋菜 膠體電泳照片，以確認結構的正確，並分別以限制酶 BstUI、FspBI、
AccI 切割，確認 R1441H (限制酶 BstUI 切位消失)、R1628P (新增限
制酶 FspBI 切位)、G2385R (新增限制酶 AccI 切位)的變異。Lanes M1、
M2 分別為 1 kb ladder 及 pGEM-4 質體的 HinfI 限制酶切割結果，作 為片段大小標記。
圖八、LRRK2-EGFP 融合蛋白的西方轉漬分析。突變(R1441H)、多 型性變異(R1628P、G2385R)、野生型(WT)重組質體及 pcDNA3 載體、
pEGFP-N1 質體，經 lipofactamine 送入 HEK-293T 細胞中表現二天後，
以LRRK2、GFP、actin 等抗體進行西方轉漬分析的結果。
圖九、共軛焦顯微鏡觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 HEK-293T 細胞 內表現(A)，及其與粒線體(B)、溶小體(C)、內質網(D)重疊情形。
pcDNA3 載體、pEGFP-N1 質體及野生型、變異型(R1441H、R1628P、
G2385R)的 LRRK2-EGFP 重組質體，經轉染(A、B、C)或與 pDsRed-ER
共 轉 染(D)入 HEK-293T 細胞中表現 2 天後，直接(A、D)或以 MitoTracker Red (B)、Lysotracker Red (C)染色後，進行共軛焦顯微鏡 觀察綠螢光融合蛋白表現，及與粒線體、溶小體、內質網重疊情形。
圖 十 、 α-synuclein-Myc-His 重 組 質 體 的 限 制 酶 圖 譜 分 析 。 α-synuclein-Myc-His 重組質體經限制酶 BstBI 和 FspI 單切割與 PvuI、
NotI 雙切割後的 0.8%洋菜膠體電泳照片，以確認結構的正確，。Lanes M 為 1 kb ladder，作為片段大小標記。
圖十一、G2019S 突變的 LRRK2-EGFP 重組質體的限制酶圖譜分析。
野生型(WT)及 G2019S 突變重組質體經限制酶 ClaI、XhoI 雙切割後 的 0.8%洋菜膠體電泳照片，以確認結構的正確，並以限制酶 SfcI 切 割，確認G2019S (新增限制酶切位)的變異。Lanes M1、M2 分別為 1 kb ladder 及 pGEM-4 質體的 HinfI 限制酶切割結果，作為片段大小標 記。
圖十二、共軛焦顯微鏡觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 SK-N-SH 細胞 內與 α-synuclein 免疫螢光染色重疊情形。pcDNA3 載體及野生型 (WT)、突變型(R767H、S885N、R1441H、G2019S)的 LRRK2-EGFP
重組質體，經 lipofactamine 送入 SK-N-SH 細胞中表現二天後，先對 α-synuclein 作免疫螢光染色處理，再用共軛焦顯微鏡觀察 α-synuclein 和 LRRK2 融合蛋白的表現情形與位置。紅色部位為 α-synuclein，綠 色為LRRK2-EGFP 融合蛋白。
圖十三、活細胞影像儀觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 HEK-293T 細 胞內蛋白聚集情形。pEGFP-N1 質體及野生型(WT)、突變型(R767H、
S885N、R1441H、G2019S)的 LRRK2-EGFP 重組質體，經 lipofactamine 送入 HEK-293T 細胞中，隔天加入細胞週期抑制劑 oxaliplatin，表現 2 天、4 天及 6 天後，進行活細胞影像儀觀察蛋白聚集情形。
圖十四、LRRK2-Myc-His 重組質體的限制酵素圖譜分析及 Myc-His tag 定序圖。(A)野生型(WT)及突變型(R767H、S885N、R1441H、G2019S) 重組質體經限制酵素切割(EcoRV/XhoI、NotI/BamHI、BamHI/XhoI、
XhoI/NotI)後的 0.8%洋菜膠體電泳照片。Lane M 為 1 kb ladder 的大小 標記。(B) Myc-His tag 定序圖，並標示出兩端引入的 BamHI、XhoI 限制酵素切位。
圖十五、LRRK2-Myc-His 融合蛋白的西方轉漬分析。pEGFP-N1、
pcDNA3 載體及野生型(WT)、突變型(R767H、S885N、R1441H、G2019S) 的LRRK2 重組質體，經 lipofactamine 送入 HEK-293T 細胞中表現二 天後，以 LRRK2、GFP、Myc、actin 等抗體進行西方轉漬分析的結 果。
圖十六、LRRK2-Myc-His 與 LRRK2-EGFP 形成二元體的分析。(A) Myc-His 標記與 EGFP 標記的同型 LRRK2 重組質體共轉染 HEK-293T
細胞，另外共轉染 pcDNA3 載體及野生型(Wild type)的 EGFP 標記 LRRK2 重組質體作為負控制組，表現二天後，收總蛋白經 His 標記
蛋白沉降試驗，以 GFP、Myc、actin 等抗體進行西方轉漬分析的結果。
(B) 三次 His 標記蛋白沉降試驗的西方轉漬分析，經影像定量後以統 計分析所作不同變異點的LRRK2 二元體結合比例圖。
圖 十 七 、ARHGEF7 cDNA 重 組 質 體 的 限 制 酶 圖 譜 分 析 。 ARHGEF-V5-His 重組質體經限制酶 BamHI、XhoI 和 BamHI、SfuI 雙
切割與 AflIII 單切割後的 0.8%洋菜膠體電泳照片，以確認結構的正 確，。Lanes M 為 1 kb ladder，作為片段大小標記。
圖十八、ARHGEF7 與 LRRK2 蛋白的免疫共沉澱分析。Myc-His 標
記的 LRRK2 重組質體與 V5-His 標記的 ARHGEF7 重組質體共轉染 HEK-293T 細胞，另外共轉染 pcDNA3.1/V5-His/lacZ 載體及野生型 (Wuld type)的 Myc 標記 LRRK2 重組質體作為免疫共沉澱負控制組。
表現二天後，收總蛋白經免疫共沉澱分析，以 Myc、V5、actin 等抗 體進行西方轉漬分析的結果。右下方為三次免疫共沉澱結果的定量統 計分析。
表一、定點突變的PCR 引子對 R767H (CGT>CAT)
F: CTGAATAGTGGATCTCATGAACAAGATGTACGAAAAGCG R:CGCTTTTCGTACATCTTGTTCATGAGATCCACTATTCAG S885N (AGT>AAT)
F: CCTGACTCTTCTATGGACAATGTGTTTGCTCAAAG R:CTTTGAGCAAACACATTGTCCATAGAAGAGTCAGG R1441H (CGC>CAC)
F: AAGGCTCACGCTTCTTCTTCCCCTGTGATTCTCG R:CGAGAATCACAGGGGAAGAAGAAGCGTGAGCCTT R1628P (CGT>CCT)
F: CACCCTAAGGGCATTATTTCGCCTAGAGATGTGG R:CCACATCTCTAGGCGAAATAATGCCCTTAGGGTG S1647T (TCA>ACA)
F: CTACATGTCACAGTATTTTAAGCTCCTAGAAAAATTCCAG
R:GCAATCTGGAATTTTTCTAGGAGCTTAAAATACTGTGACATGTAG G2019S (GGC>AGC)
F: GCAAAGATTGCTGACTACAGCATTGCTCAGTACTGCTG R: CAGCAGTACTGAGCAATGCTGTAGTCAGCAATCTTTGC G2385R (GGA>AGA)
F: CTCTGTAGACTAATAGACTGCGTGCACTTTTTAAGGGAGG R:CCTCCCTTAAAAAGTGCACGCAGTCTATTAGTCTACAGAG M2397T (ATG>ACG)
F: GACTGCGTGCACTTTTTAAGGGAGGTAATGGTAAAAG R:CTTTTACCATTACCTCCCTTAAAAGTGCACGCAGTC