一、R1441H、R1628P、G2385R 對 LRRK2 蛋白在細胞內的位置及 合成的影響
(一) EGFP標記的LRRK2 cDNA
包含S1647T、M2397T多型性的LRRK2-EGFP質體(圖二)為實驗 室江佩茹學姐所建構。R1441H、R1628P、G2385R的LRRK2-EGFP 重組質體的建構如圖三。建構好的R1441H突變及R1628P、G2385R 多型性質體以限制酶ClaI、XhoI切割確認結構的正確，並分別以限制 酶BstUI、FspBI、AccI切割，確認R1441H (限制酶BstUI切位消失)、
R1628P (新增限制酶FspBI切位)、G2385R (新增限制酶AccI切位)的變 異(圖七)。
(二)西方轉漬分析 R1441H、R1628P、G2385R 對 LRRK2 合成的影響 將野生型及R1441H、R1628P、G2385R變異的LRRK2-EGFP重組 質體轉染入HEK-293T細胞表現。二天後蒐集細胞液，進行西方轉漬 分析，結果顯示於圖八。LRRK2、GFP抗體可偵測到約 305 及 180 kDa 的野生型及突變型LRRK2-EGFP融合蛋白。
(三) LRRK2-EGFP 融合蛋白的共軛焦螢光顯微鏡觀察
將上述野生型及R1441H、R1628P、G2385R 變異的 LRRK2-EGFP 重組質體轉染入HEK-293T 細胞表現。二天後將細胞染色後使用共軛 焦顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現情形與表現位置等。
野生型及突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白主要分佈在細胞質(圖九
A)，且與粒線體、溶小體及內質網(圖九B~D)等胞器位置重疊，顯示
LRRK2-EGFP 融合蛋白會出現在上述胞器中。突變型與野生型的蛋 白在細胞中表現情況相似，無明顯差異。
二、R767H、S885N、R1441H、G2019S 突變的 LRRK2 形成聚集的 情形
(一) α-synuclein cDNA 選殖
結果如圖十：經限制酵素 BstBI 切割後，會由 5956 bp 的片段被 切割成3903 bp、2053 bp 等 2 片段；經限制酵素 PvuI 及 NotI 切割後，
會由5956 bp 的片段被切割成 4443 bp、1518 bp 等 2 片段；經限制酵 素 FspI 切割後，會由 5956 bp 的片段被切割成 3597 bp、2324 bp 等 2 片段。
(二) EGFP標記的LRRK2/G2019S cDNA質體
LRRK2野生型、G2019S質體以限制酶ClaI、XhoI切割確認結構的正 確，G2019S質體並以限制酶SfcI切割(新增限制酶SfcI切位)，確認 G2019S的變異(圖十一)。
(三) α-synuclein 免疫螢光染色及共軛焦顯微鏡觀察
將野生型及突變型LRRK2-EGFP 及 α-synuclein-Myc-His 重組質 體共轉染入SK-N-SH 細胞表現。二天後將細胞作免疫螢光染色，並 以共軛焦顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現情形與聚集 等。結果顯示R1441H、G2019S 突變的 LRRK2-EGFP 融合蛋白在凝 集糾結(aggregation)的位置，未發現有 α-synuclein 的組成(圖十二)。
(四)活細胞影像儀觀察突變的 LRRK2 形成聚集的情形
將野生型及突變型 LRRK2-EGFP 重組質體共轉染入 HEK293T 細胞表現。在二天、四天和六天後三個時間點，以活細胞螢光顯微鏡 觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現情形與聚集等。數據統計結果 顯示 R1441H、G2019S 突變的 LRRK2-EGFP 融合蛋白在凝集糾結 (aggregation)的數量相較野生型較多(圖十三)。
三、R767H、S885N、R1441H、G2019S 突變的 LRRK2 形成二元體 的情形
(一) Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA
以 定 點 突 變 法(表 一) 建 構 出 不 包 含 S1647T 、 M2397T 多 型 性 的 LRRK2-Myc-His質體，經DNA定序確認無誤後，再以定點突變法(表 一)建構出R767H、S885N、R1441H、G2019S等突變的LRRK2-Myc-His cDNA質體，經DNA定序確認無誤後，並利用限制酵素進行圖譜分 析。結果如圖十四A：經限制酵素EcoRV及XhoI切割後，會由 13210 bp 的片段被切割成5425 bp、3262 bp、2646 bp、1877 bp等 4 片段；經 限制酵素NotI及BamHI切割後，會由 13210 bp的片段被切割成 7677 bp、5475 bp、58 bp等 3 片段；經限制酵素BamHI及XhoI切割後，會 由13210 bp的片段被切割成 7735 bp、5382 bp、93 bp等 3 片段；經限 制酵素XhoI及NotI切割後，會由 13210 bp的片段被切割成 7770 bp、
5440 bp等 2 片段。同時進行定序，確認Myc-His tag序列的正確性(圖 十四B)。
(二) Myc-His標記的LRRK2 cDNA表現
將 野 生 型 及 突 變 型 的 LRRK2-Myc-His 重 組 質 體 轉 染 入 HEK-293T 細胞表現。二天後蒐集細胞液，進行西方轉漬分析，結果 顯示於圖十五。LRRK2、Myc 抗體則偵測到約 282 kDa 的野生型及
(三) LRRK2-Myc-His、LRRK2-EGFP蛋白的二元化情形
Myc-His 標 記 與 EGFP 標 記 的 同 型 LRRK2 重 組 質 體 共 轉 染 HEK-293T細胞，另外共轉染pcDNA3 載體及野生型(Wild type)的 EGFP標記LRRK2 重組質體作為負控制組。表現二天後，收總蛋白經
His標記蛋白沉降試驗，進行西方轉漬分析，結果顯示於圖十六A。在
輸入控制組以GFP、Myc、actin等抗體分別偵測到約 305、282 kDa的 LRRK2 重組蛋白及 43 kDa的actin蛋白；在His標記蛋白沉降試驗以 GFP、Myc等抗體分別偵測到約 305 及 282 kDa的LRRK2 重組蛋白。
定量統計結果顯示於圖十六B，不同變異點的LRRK2 二元體結合比例 以三次His標記蛋白沉降試驗的西方轉漬分析定量，並把野生型組的
二元體結合比例定標準化為 100%，可得R767H、S885N、R1441H、
G2019S分別為 108%、101%、98%、114%，各變異點LRRK2的二元 體結合能力相較野生型均無顯著差異(P > 0.05)。
四、R767H、S885N、R1441H、G2019S 等突變的 LRRK2 蛋白的與 ARHGEF7 蛋白的結合情形
(一) ARHGEF7 cDNA 選殖
如圖十七所示，7780 bp的ARHGEF7-V5-His重組質體，經BamHI
及XhoI酵素雙切割後生成 6580、1200 bp兩片段，經BamHI及SfuI酵素 雙切割後生成 5427、2353 bp兩片段，經AflIII酵素單切割後生成 2647、2079、2044、1010 bp四片段，顯示ARHGEF7-V5-His重組質體 結構的正確。
(二) LRRK2 與 ARHGEF7 蛋白的交互作用
Myc-His標記的LRRK2 重組質體與V5-His標記的ARHGEF7 重組 質體共轉染入HEK-293T細胞，細胞蛋白液經V5 抗體免疫沉澱後，進 行西方轉漬分析，結果顯示於圖十八。輸入控制組以Myc、V5、actin 等抗體分別偵測到約282 kDa的LRRK2 和 90 kDa的ARHGEF7 重組蛋 白及43 kDa的actin蛋白；免疫共沉澱物以Myc、V5 等抗體分別偵測 到約282 kDa的LRRK2 和 90 kDa的ARHGEF7 重組蛋白。三次免疫共 沉澱結果的定量統計結果顯示於圖十八右下，以野生型LRRK2 與 ARHGEF7 的蛋白質間結合能力標準化為 100%，可得R767H、
S885N、R1441H、G2019S分別為 67%、33%、20%、55%，與野生型 相較，S885N、R1441H、G2019S變異點LRRK2與ARHGEF7 的蛋白 質間結合能力顯著降低(P = 0.004~0.000)。R767H與ARHGEF7 蛋白的 交互作用雖較弱，但差異未達顯著(P = 0.148)。