第二章、 文獻探討
II. 使用的質體 (乾燥)
Name Relevant characteristics
pLKO shRNA empty vector control
pLKO-HBP1#76 shRNA against HBP1
VSVG VSV-G pseudotyped lentivirus
PLP1 structural and replication proteins are required to produce the lentivirus PLP2
質體來源：Dr. Yee Lab, MA, USA (購自：Sigma, Invitrogen) III. 實驗步驟
轉型(Transformation)
將 DH5α competent cells(ECOS 101；Yeastern Biotech)自 -80℃取出後回溫，
取 30 μl 至 eppendorf中，加入 3μl質體 DNA 後置於冰上 10 分鐘後，將含有質體
Ampicillin 之 Luria Bertani medium 的培養管中，再度放入 37℃ 培養箱，以 200 rpm 速度震盪培養 24 小時。
質體小量製備
將上述培養 24 小時之菌體離心 15 分鐘 (6000g，4℃) 後，將上清液倒掉，加
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column 之後，再加入前述之上清液，待其全部通過 column 後，以 30 ml Buffer QC 清洗 2 次，接著再以 15 ml Buffer QF 將 DNA 溶至 eppendorf 中，加入 10.5 ml 之 isopropanol 後離心 30 分鐘 (13000 rpm，4℃)。之後，小心地將上清液抽掉，以 5 ml 70% 酒精清洗，離心 10 分鐘 (10000 rpm，4℃)，將上清液抽掉，剩餘的 DNA pellet 使其乾燥 5~10 分鐘後，以 200 μl 二次水將其溶解，保存於 -20℃。50
稱為小干擾 RNA (small interfering RNA)，也就是所謂的 siRNA。 siRNA 會被細胞 質中的核糖核酸誘導沉默複合體 (RNA-induced silencing complex；RISC) 辨識並結 合，使雙股的 siRNA 解開，形成 sense 與 antisense 兩個單股的 RNA，並將其中的 正義股 (sense) 分解，保留反義股 (antisense)。而保留的反義股則會引導 RISC，利 用其序列專一性找到目標 mRNA，進而將其降解。利用反轉錄病毒 knockdown 感染
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培養液倒入欲感染之 HSC-3 細胞中培養 5 小時。之後再以相同的步驟取得培養液
並放置培養箱培養 3小時後，換成一般的培養液培養。
抗生素篩選
待 HSC-3 細胞長滿之後，使用含有 0.5 μg/ml puromycin 之培養液，以 1：10、
1：200、1：2000 與 1：20000 的稀釋倍數進行分盤。分盤後前 3 天須每天更換培
養液，之後則是按照一般細胞培養方式每 2~3 天更換一次培養液。
篩選約 1 個多星期之後，若細胞長出一個個肉眼可見之 colony ，即可進行挑 選。利用沾有 trypsin 的 coloning disc 覆蓋在單一個 colony 上約 1 分鐘，再將 coloning disc 放至含有培養液的 6 孔盤中培養，待細胞長滿後即可移至 10 cm dish 繼代培養，並抽取 RNA 以做鑑定。
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每 1 L 的二次蒸餾水加入 1 mL的 DEPC(diethylpyrocarbonate)，此一步驟需在 抽氣櫃內操作，同時放入攪拌磁石，於室溫攪拌 over-night，此過程 DEPC 可破壞 (1000 rpm)，將上清液抽掉，加入 700μl RLT buffer 與 7μl β-mercaptoethanol 後混勻，
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使其通過 20 G 的針頭至少 5 次，並加入 700μl 70% 酒精後混勻。取 700μl 至 RNeasy spin column(放在2 ml collection tube上) 後離心 15 秒 (10000 rpm)，將下層 的液體倒掉後，再將剩下的 700 μl 至 RNeasy spin column 後離心 15 秒 (10000 rpm)，
將下層的液體倒掉。加入 700 μl RW1，離心 15 秒 (10000 rpm) 後將下層的液體倒 掉。加入 500μl RPE，離心 15 秒 (10000 rpm)，將下層液體倒掉後，再加入一次 RPE，
離心 2 分鐘 (10000 rpm)。將column放到空的2ml collection tube裡，離心1分鐘 (13000 rpm)，接著換到 1.5 ml collection tube，加入 30 μl RNase-free water，離心 1 分 鐘 (10000 rpm)，再加入一次 30 μl RNase-free water，離心 1 分鐘 (10000 rpm)後，
即可將 RNA 放到 -80℃ 冰箱中保存。
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十三、RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) – 使用 SuperScript
TMⅢ One-Step RT-PCR System with Platinum
®Taq DNA Polymerase Kit (invitrogen)
資料來源：(139)
I. 原理
將 RNA的反轉錄(reverse transcription)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(polymerase)
相結合的技術。技術原理簡單的來說是將一段待測的 RNA 序列經反轉錄酶的作用
18S Forward 5-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3
234 bp
p47phox Forward 5-GTACCCAGCCAGCACTATG-3
520 bp Reverse 5-CCTGGCTTTGCTTTCATCTG-3
III. 實驗步驟
將 RNA、primer 與試劑混合後，放入 PCR 專用之小管中，放入 iCycler，設定
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以下之反應條件即可。反應完成後，每管加入 6 倍之 DNA loading dye，再以含有 0.26 % 之 EtBr 之 1% Agarose 跑膠，並以 MultilmageTM Light Cabinet 分析影像並 儲存。
Temperature Time Cycle
cDNA synthesis
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十四、冷光酵素報導基因分析法 – Luciferase Gene Reporter Assay
資料來源：(140) (11800rpm，室溫)，抽取上清液置於新的 eppendorf，即可將待測樣品放到-80℃ 冰 箱中保存。
分析
在 24 孔盤中加入 12.5μl buffer A 後，取 5μl 的待測樣本到待測孔中，放置冰 上 10 分鐘，等待時間配置 buffer B (galacton-plus substrate：bufferB = 1：100)，加入 50μlbufferB後，立即測量 Luciferase 活性。置室溫30分鐘後，加入50μl Accelerator II，立即測量 β-galactosidase 活性。
Other+ elements
Luciferin Luciferase + O2 products + CO2 + light
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十五、統計分析
實驗結果均以帄均值 ± 標準差 (Mean ± SD) 表示，利用 Student’s t test 或 Duncan’s multiple range test 比較組間差異。數據之統計均須確定為常態分布，否則 轉型為對數值 (Log)。數據以單向雙方分析 (One way ANOVA) 檢定組間差異之顯著 性，統計比較以 p <0.05為具有顯著之差異。統計分析係以 SAS 軟體 (SAS 8.2, Cary, NC, USA) 分析。