第二章、 文獻探討
III. 應用
RNAi 技術的應用相當廣泛，在生物醫學方面，因為 RNAi 技術可以非常的快
速且有效地抑制基因的表現，然而，許多疾病與癌症的發生是因為特定基因表現異
常或過度表現，藉由 RNAi 技術來有效抑制這些異常或過度活化的基因。理論上說，
若能關閉致病基因的表達，則達到治療疾病與癌症的效果。在動物實驗中已證明，
可以透過 RNAi 的方法抑制導致血膽固醇升高的基因；病毒性疾病，眼疾，心血管
代謝性疾病等方面的臨床試驗也正在進行中。因此，透過 RNAi 技術的基因「默化」
機制，將病毒的複製或致病機轉關閉，未來將可應用於治療癌症、病毒感染甚至預 防疾病的發生。
27
六、實驗目的與動機
全世界口腔癌的發生率逐年增加，且其預後存活率仍然偏低。然而，大約有 55~100% 的口腔癌患者，其 EGFR 有過度表現的情形，而且也造成口腔癌預後不佳 及存活率低的問題。EGFR 以及其突變型 (EGFR variant III) 已知在許多腫瘤細胞過 度表現，尤其是口腔癌。由此可知，對於治療口腔癌，EGFR 扮演著革命性的角色。
我們先前研究發現，轉錄抑制因子 HBP1(HMG box protein 1) 可藉由對氧化還原帄 衡的調控，而抑制乳癌細胞 EGFR 的訊息傳遞，但 HBP1 在口腔癌調控的角色尚未 被探討。
已有研究顯示，NAC (N-acetylcysteine) 具有調節身體體內氧化還原帄衡的能力，
而且是一個有效的自由基清除劑，有許多研究證實，NAC 具有抗癌抗腫瘤的效果。
因此，也開始有許多研究發現 NAC 能透過許多不同的機制來達到抑制癌症的發生。
同時，NAC 亦有抑制 EGFR 以及下游 Akt 活化，但其機制尚未完全清楚。本研究 主要是探討 NAC 是否藉由活化 HBP1 來抑制 EGFR 的訊息傳遞路徑。希望此研究
將提供轉錄因子 HBP1 為一個治療口腔癌的重要標的，對於口腔癌的防治有進一步
的貢獻。
28
29
二、實驗藥品與儀器
藥品：名稱 廠牌 儲藏溫度
A
Acrylamide Genepure 4℃
Agarose AMRESCO® 室溫
Ampicillin Bio Basic Inc. 4℃
Ammonium Persulfate J. T. Baker 室溫
B
β-mercaptoethanol J. T. Baker 室溫 Bovin Serum Album USBiological 4℃
Bromophenol Blue Bio Basic Inc 室溫
D
Deoxycholate Sigma 室溫
DMSO Sigma 室溫
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 4℃
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
: Nutrient Mixture F-12 Ham(1:1) Gibco 4℃
Dual light Applied Biosystems 4℃
E
ECL PerkinElmer 4℃
EDTA J. T. Baker 室溫
Ethanol 東華化工 室溫
Etidium Bromide Genepure 4℃
F
30
Fetal Bovine Serum Gibco, USA -20℃
FuGENE® 6 Roche 4℃
L-Glutamine Gibco -20℃
LipofectamineTM 2000 invitrogen 4℃
Lucigenin Sigma 4℃
Luria Bertani medium Himedia 室溫
Luria Bertani Agar Himedia 室溫
N
NaCl AMRESCO® 室溫
N-acetylcysteine sigma 4℃
O
OPTI-MEM®I Gibco 4℃
P
10x PBS UniRegion Bio-Tech 室溫 Penicillin/Streptomycin Gibco -20℃
Phosphatase Inhibitors Cocktail Sigma -20℃
Polybrene Sigma -20℃
Protease Inhibitors Cocktail Sigma -20℃
Protein Assay Dye Reagent Contrate BioRad 4℃
Puromycin Sigma -20℃
31
S
SDS Merck 室溫
Sodium Bicarbonate Sigma 室溫
T
50x TAE UniRegion Bio-Tech 室溫
TEMED J. T. Baker 室溫
Tris-base USBiological 室溫
Triton X-100 J. T. Baker 室溫
MultilmageTM Light Cabinet Alpha Innotech Corporation Mulpid®-2 plus electrophoresis ADVANCE
CLC-110 chemiluminescence detector TOHOKU
CLC-10 CL counter TOHOKU
PowerPacTM Basic Power Supply BioRad
Mini-PROTEAN®3 Cell BioRad
Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell BioRad
32
Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12 Ham(1:1)取一包粉末，
內含 15 mM HEPES buffer、L-glutamine、pyridoxine hydrochloride 溶於 800 ml的無 菌水中，加入 1.2 g NaHCO3 (Sigma)。溶解後調整 pH 值至 7.1-7.2 之間，再加入 10%
FBS (Fetal bovine serum) 以及 1% Antibiotic Antimycotic，混合後將體積定量至 1000 ml。最後將配好之溶液移至無菌操作台中，以 0.22 μm 血清瓶專用無菌過濾膜過濾，
保存於 4℃。
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 粉末溶於 800 ml 的無菌水中，加 入 1.5 g NaHCO3 (Sigma)，溶解後調整 pH 值至 7.1-7.2 之間，再加入 10% FBS (Fetal bovine serum) 以及 1% Antibiotic Antimycotic，混合後將體積定量至 1000 ml。最後
33
將配好之溶液移至無菌操作台中，以 0.22 μm 血清瓶專用無菌過濾膜過濾，保存於
4℃。
1× 磷酸緩衝液(phosphate-buffer saline ; PBS)
由 10× PBS(UniRegion Bio-Tech) 中取出 100 ml 溶在 900 ml 的二次水中，再經
34
35
NAC 處理 12、24 及 48 小時，將細胞以 trypsin-EDTA 打下後，取細胞懸浮液中的 50 μl 再加上 100 μl 的 trypan blue，混合均勻後，以血球計數器來計算未被染色的 HSC-3 細胞數目。
細胞存活率分析
在 6 孔盤中種下 5×105 顆的 HSC-3 細胞，等至細胞貼附後，加入不同濃度的 NAC 處理 12、24 及 48 小時，將細胞以 trypsin-EDTA 打下後，取細胞懸浮液中的 50 μl 再加上 100 μl 的 trypan blue，混合均勻後，以血球計數器來計算未被染色的 HSC-3 細胞數目。
細胞計數
將細胞懸浮液與 trypan blue 按比例體積混合，取出 20μl混合液注入血球計數 盤凹槽中，於倒立式顯微鏡下觀察計數。計算計數盤中上下共十大方格中細胞總數 後除以十，乘以稀釋倍數，最後再乘以 104(血球計數盤每一方格的體積為 10-1 mm3)，
及為每毫升中細胞懸浮液之細胞數。
36
介於二倍體和四倍體之間。因此，利用 PI (propidium iodine) 染細胞核中的核酸，再 射入特定波長的雷射光，激發光的強弱即反映出細胞內核酸的多寡，將細胞週期各 時相區分為 G1/ G0 期、S 期和 G2/ M，並可通過特殊軟體計算各時期的百分率。II. 試劑配製
Propidium Iodine (PI)染劑
Component Stock solution Final solution Volume Propidium Iodine 100 μg/ml 4 μg/ml 40 μl
1× 磷酸緩衝液(phosphate-buffer saline ; PBS)
由 10× PBS(UniRegion Bio-Tech) 中取出 100 ml 溶在 900 ml的二次水中，再經 121℃、30 分鐘高壓滅菌後使用並放於室溫備用。
37
III. 實驗步驟 固定細胞
在 6 孔盤中種下 4×105 顆 HSC-3 細胞，等至隔日細胞貼附後，以 10 ml PBS 清 洗，換置 serum starvation 之培養液培養 24 小時後，加入不同濃度的NAC 後 24 小 時，以 PBS 清洗後再經 trypsin-EDTA 反應 5 分鐘刷下，離心 (1000g，5 分鐘) 之 後倒掉上清液，將細胞完全打散後，再以 10 ml 之 PBS 清洗離心。倒掉上清液，將 細胞打散後，以 -20℃ 冰的 70% 酒精進行細胞固定步驟 (以慢速震盪，緩慢將 3 ml 酒精滴入)，隨後將細胞固定步驟完成的樣品置於 -20℃ 冰箱。
流式細胞儀分析
固定結束後隔天，將樣品從 -20℃ 冰箱取出後離心 (1000g，5 分鐘) 去除酒精。
將細胞完全打散，加入 10 ml 的 PBS 清洗 1次後將細胞完全打散。最後在每個試 管中加入 500 μl (視細胞數目增減) 的 PI 染劑，用 1 ml pipette 在 15 ml 離心管中抽
吸數次後，將細胞移於絹布製的篩子過濾到 FACS 專用管，避光並置於冰上反應 30
分鐘。最後以流式細胞儀 (Flow cytometry; FAC) 進行樣品分析，每一秒細胞數不超 過 300 顆細胞，每個數據收集 10000 顆細胞，數據以 Modfit LT® 軟體進行處理分 析，每個實驗組皆重複三次。
38
六、ROS (Reactive Oxygen Species) 測定
資料來源：(134) I. 原理
2,7-dichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA) 是一種脂溶性染劑，本身具有螢光 且可以通透細胞膜，進入細胞可以與細胞內的乙醯脂酶 (esterases) 結合形成非螢光 性的DCFH，之後被 H2O2 氧化成具螢光性的 DCF。藉此使用流式細胞儀來評估細 胞內 H2O2 的濃度變化，以分析細胞內ROS的生成量。
II. 試劑配製
10 mM H2DCF-DA 染劑
分子量為 487.3，取 4.873 mg 之 H2DCF-DA，加入 1 ml 已滅菌的 PBS，實驗 時再用已滅菌的 PBS 稀釋成 10 μM。
III. 實驗步驟
將 4×105細胞種至培養皿中，經過 24 小時細胞貼附，分別給予不同濃度的 NAC 培養 30 分鐘以及 1、6、12、24、48 小時後，將上清液抽掉，以 10 ml 之 PBS 清 洗，加入 trypsin-EDTA 反應 5 分鐘後刷下，離心 (1000g，5 分鐘) ，倒掉上清液，
利用手指用力彈管壁使細胞完全打散，再以 10 ml 之 PBS 清洗離心。倒掉上清液，
再利用手指用力彈管壁使細胞完全打散後，在每個離心管中加入 500 μl 的 10 μM H2DCF-DA，用 1 ml pipette 在 15 ml 離心管混合均勻後，將細胞移於絹布製的篩子 過濾到 FACS 專用管，全程避光並置於 37℃ 水浴 30 分鐘，最後以流式細胞儀 (Flow cytometry; FACS) 進行樣品分析。
39
七、蛋白質萃取
資料來源：(135) I. 原理
利用細胞刮除法使細胞破碎以及利用高滲蛋白裂解液讓細胞溶漲破裂，使蛋白 溶解變性並抑制蛋白酶活性使蛋白穩定，再利用超高速離心，收集上清液提取總蛋 白。
II. 試劑配製 RIPA buffer
Component Concentration
NaCl 150 mM
Tris buffer 10 mM
EDTA 5 mM
SDS 0.1%
Triton X-100 1%
Deoxycholate 1%
III. 實驗步驟
10 公分培養盤中的細胞以 PBS 清洗過後，加入 100 μl RIPA buffer (含protease inhibitors cocktail 與 phosphatase inhibitors cocktail )，以細胞刮勺將細胞刮下，放到 eppendorf，置於冰上 30 分鐘。之後 cell lyste 以 12000 rpm 轉速離心 15 分鐘後，
取上清液，放至 -80℃ 冰箱中保存使用。
40
albumin；BSA) 蛋白標準溶液 800 μl，震盪均勻後，再加入 200 μl protein assay dye (Bio-Red)，均勻混和靜置室溫5分鐘。放入分光光度計讀取波長 595 nm 的吸光值，藉由 595 nm 的吸光值作為標準曲線，分析最佳標準迴歸直線，求出此線的方程式，
41
當此直線的迴歸分析結果之 R ＞0.998 時，此直線方程式的值始可信。得知最佳標
準迴歸直線後，將取1 μl的待測蛋白質溶液加入799 μl二次水，震盪均勻後，再加 入 200 μl protein assay dye，均勻混合後，室溫下反應 5 分鐘後測吸光值，再以樣品 所測的結果扣除背景值後，帶入方程式即可求得蛋白質的濃度。
42
九、西方點墨法 (Western Bloting)
資料來源：(135) I. 原理
Western bolt 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，被檢測物是蛋白質，
探針是一級抗體 (Primary antibody)，顯色用標記的二級抗體 (Secondary antibody)，
介面活性劑，SDS 可將蛋白變性並使其分子表面均勻佈上一層負電荷，接通電源後，
43
Ammonium persulfate (10%) 1 g
ddH2O X ml
total volume 10 ml
Running and stacking gel
Stock solution 5%
44
跑膠
10× running buffer
Component Concentration
10× Transfer buffer
Component Concentration
10× Tris-base buffer saline
Component Concentration
45
TBS/T
Component Concentration
10× TBS 100 ml
Tween 20 (0.1%) 1 ml
ddH2O 900 ml
total volume 1000 ml
抗體
Antibody Source Brand
HBP1 goat Cell signaling
EGFR Rabbit Cell signaling
p-EGFR (Tyr 1045) Rabbit Cell signaling p-EGFR (Tyr 1086) Rabbit Cell signaling
Akt Rabbit Cell signaling
p-Akt (Ser 473) Rabbit Cell signaling
ERK1 Rabbit Santa cruz
p-ERK1/2 Mouse Abcame
p21 Rabbit Cell signaling
p38α Rabbit Santa cruz
cyclinD1 Mouse Santa cruz
α-tubulin Rabbit Abcame
46
III. 實驗步驟
膠體的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 5、8、10 % 的 SDS-PAGE。
待鑄好的 SDS-PAGE 組合放置電泳槽中，倒入適量的 1× running buffer。將製備好 的蛋白樣品 (40-50 μg/μl) 以及標準品小心加入於固定於垂直電泳槽內的 stacking gel 的 well 內，以避免 sample 溢出，先以 90 伏特電壓跑 4 % stacking gel，20 分 鐘後，調整電壓至 100 - 120 伏特，約跑 2 – 3 小時，即完成蛋白分離。
轉印時，先將 PVDF 膜與 3M 濾紙裁剪與膠片大小相同。將轉漬夾打開後，黑 色面朝下，依序放上海棉墊、濾紙、SDS-PAGE gel、PVDF 膜 (先用 100% 甲醇濕 潤 2 分鐘、再放於 transfer buffer 中浸潤)、濾紙，最後放上一片海棉墊，確定其緊 密貼合後，將轉印夾慢慢地合起來，放到轉印槽中，倒入 1× transfer buffer，以 400 mA 電流轉印 1 - 2 小時，使蛋白質轉印到 PVDF 膜上。
轉印完成的 PVDF 膜以 5% 脫脂牛奶 (TBS/T 配製) 進行 blocking 1 小時後，
以 TBS/T 清洗 5 分鐘 3 次後，加入適當稀釋倍數之一級抗體反應 overnight。將一 級抗體以 TBS/T 清洗 5 分鐘 3 次後，依不同的一級抗體，加入特異作用的二級 抗體反應 1 小時，再以 TBS/T 清洗 5 分鐘 3 次，以感光試劑 Western lightening chemiluminescence reagent plus 進行呈色反應，利用LAS-4000 mini FUJIFILM 冷光 影像系統分析。
47
十、質體 (Plasmid) 的製備
資料來源：(136) I. 原理
將外來DNA的質體經轉型作用 (Transformation)，轉入勝任細胞 (Competent cells) 中，利用熱休克法 (Heat Shock) 讓細胞壁成份改變而使 DNA 可順利進入細胞中作 用，使細胞之遺傳性發生改變，藉由寄主細菌的系統來達成複製或進行基因表現的 目的。抽取質體 DNA 的方法有很多種，本實驗室使用市售的 QIAGEN® Plasmid Mini Kit 以及 QIAGEN® Plasmid Maxi Kit來做質體的製備。其作用原理來自於鹼性 溶解法，細菌以 NaOH 及 SDS 分解，並使蛋白質及 DNA 變性，繼之以酸中和。
將外來DNA的質體經轉型作用 (Transformation)，轉入勝任細胞 (Competent cells) 中，利用熱休克法 (Heat Shock) 讓細胞壁成份改變而使 DNA 可順利進入細胞中作 用，使細胞之遺傳性發生改變，藉由寄主細菌的系統來達成複製或進行基因表現的 目的。抽取質體 DNA 的方法有很多種，本實驗室使用市售的 QIAGEN® Plasmid Mini Kit 以及 QIAGEN® Plasmid Maxi Kit來做質體的製備。其作用原理來自於鹼性 溶解法，細菌以 NaOH 及 SDS 分解，並使蛋白質及 DNA 變性，繼之以酸中和。