第二章 光學顯微鏡系統與成像原理
本章將依序詳述論文中使用的光學顯微鏡原理、系統與顯微鏡影像。
2-1 光學顯微鏡成像原理
光學顯微鏡為一相當廣泛的統稱，只要以光訊號放大樣品的影像，幾 乎都可稱為光學顯微鏡[9] ，我們在這裡介紹 Confocal 與 Conventional scanning microscopy。
Confocal scanning microscopy[10] 示意圖如圖 2-1，其特點在光偵測器 前加一個針孔(pinhole)，此針孔可以將樣品焦平面下方與上方反射光濾掉，
只讓焦平面的光進入偵測器，大幅提升樣品的 Z 軸向解析度。
Sample
Light Source Detector
z x
圖 2-1 共焦顯微鏡原理示意圖
如將偵測器前的針孔移除，即為 Conventional scanning microscopy，其與共 焦顯微鏡最大不同在於縱軸解析度[11] 。兩種顯微鏡在同一時間點，都只 能測量樣品上小範圍的光強度訊號，因此需要移動樣品掃描，做出樣品座 標對光強度關係圖才可以得到顯微鏡影像。且一般都設計成使用同一個物
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鏡來激發樣品與接受樣品訊號光，以降低光學系統的複雜度。
2-2 光學顯微鏡系統
本實驗所使用的顯微鏡，為實驗室自行開發的多功能顯微鏡系統(圖 2-2)，其四個功能分別為廣場顯微鏡(Wide field microscope)、掃描顯微鏡 (Conventional scanning microscope)、共焦顯微鏡(Confocal microscope)、共 焦螢光顯微鏡(Confocal fluorescence microscope)。另外多功能顯微鏡依其工 作原理可分成四個部份(圖 2-3)，分別為光源模組、樣品載台模組、顯微鏡
Side view
Laser: CW diode Laser ND: ND filter
OBJ: Objective lens 1: 10x NA0.25 2: 100x NA0.80 3: 10x NA0.25 PH: Pinhole L1: Lens f=50mm M: Mirror I: Iris
BSC:Beamsplitter cube B:Beamsplitter DIM:Dichroic Mirror PIstage: PI xyz stage Tstage: Tanlian x-y stage PH
Top view
圖 2-2 多功能顯微鏡光路圖
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Side view
PH
Top view
Computer Counter card
光源系統
RS-232USB RS-232
BNC PCI
圖 2-3 多功能顯微鏡功能圖
2-2-1 光源模組
光源模組功能為照明與激發樣品，基於雷射光(Laser)具有單色光、發散 角小、光斑分佈與理論符合等特性，選用 Cobolt 公司發展的光強度高穩定 雷射 Cobolt BluesTM，其波長 473nm，並在雷射出光後架設一組空間濾波器 (Spatial filter)，以修正雷射光斑(Laser spot)的形狀與調整平行光，最後通過 由 OLYMPUS 研發長工作距離 100 倍物鏡 LMPlanFLN，孔徑值 0.8，局部 照明或激發樣品。
2-2-2 樣品載台模組
樣品載台模組由一個粗調二維平台，與一個細調二維平台堆疊而成，
細調平台為德國的 Physik Instrumente 公司所研發三軸壓電位移平台(PI
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stage) P-563.3CD，其內建光學尺回饋平台目前位置，可達位置平方平均數 (Root mean square)正負 2 奈米的解析度。而粗調平台為台灣坦聯公司所發展 的兩軸位移平台(Tanlian stage)MR-IX71，使用步進馬達，可進行行程 20mm 長距離移動。
2-2-3 顯微鏡訊號偵測模組
訊號偵測模組根據顯微鏡功能的不同，偵測器也會有所不同。廣場顯 微鏡使用的是 Edmund 公司研發的感光偶合元件(CCD)，型號 NT63-848，
掃描顯微鏡使用 HINDS Instruments 發展的光導(Photoconductive)光電轉換 器 DET-200-002，再使用 Keithley-2000 數位電表(Multimeter)，將類比電壓 訊號轉成數位電壓訊號。而共焦顯微鏡與共焦螢光顯微鏡使用的偵測器較 為特別，為 MPD 公司發展的 PDF Series 單光子計數器(Single photon avalanche diodes)，其原理是利用 PN 二極體加以逆向偏壓[12] ，當逆向壓 大小到達崩潰電壓會使二極體導通，但如果施加逆向偏壓的時間在奈秒的 等級，二極體不會馬上有崩潰電流，而是進入一種稱之蓋格模式(Geiger mode)的暫態，如圖 2-4 開路，此模式極為不穩定，如有數光子進入二極體，
光電效應即可打破暫態平衡造成崩潰電流的產生，如圖 2-4 閉路，光強度越 強，產生崩潰電流的機率越高，再配合被動抑制電路(Passive quenching circuit)，將以導通的二極體再次回到開路。簡而言之，此偵測器會在奈秒區 間偵測有無光訊號，偵測到光訊號機率與光訊號本身強度成正比。
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I
V 開路 閉路
VBD
Linear amplifier
mode Geiger mode
APD SPAD
圖 2-4 SPAD 工作示意圖
另外 PDF Series 搭載孔徑 62.5 μm 漸變式折射多模光纖(Multimode graded index)，其光纖頭可以當成共焦顯微鏡中的針孔[13] ，因此將物鏡收 集到的樣品反射光以 10 倍物鏡，孔徑值 0.25，耦合至光纖中即可完成共焦 顯微鏡，如在光纖耦合前加裝一個帶通濾光片(Band pass filter)，除去非樣 品螢光波長的光，即為共焦螢光顯微鏡。
2-2-4 儀器控制與訊號處理模組
儀器控制模組為自動測量模組，程式以 LabviewTM程式碼撰寫而成，根 據顯微鏡取得圖像的方法，可分成兩種模式，第一種稱為步進模式，步驟 為擷取來自樣品的反射光強度，移動樣品到下一目標，再擷取新訊號，重 複上述步驟即可以掃描出二維矩陣，其優點為擷取訊號時間較長，可以得 到較高的訊雜比。
第二種為掃描模式，此模式會控制樣品，向掃描軸以等速度運動移動，
再以固定週期，瞬間擷取從樣品反射光訊號(圖 2-5)，即可得到一維光學
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Time Position
samplesamplesamplesample
Gate in signal
圖 2-5 掃描模式示意圖
影像，更換掃描起始點後進行重複掃描，即可得到二維圖。但因儀器控制 時間尺度小於電腦可直接控制的 10-3秒等級，因此需利用 PI stage 控制器產 生觸發訊號(Trigger output signal)，如圖 2-6，輸入由美商國家儀器公司
(National Instruments)發展的 PCI-6602 計數卡(Counter card)，產生的 TTL 觸 發訊號(Gate in signal)，其訊號高準位時間長短可調整。將此訊號輸入 MPD，可使 MPD 在 Gate in signal 高準位時啟動。如在 MPD 啟動期間有光 訊號，MPD 就會不停輸出脈衝訊號(SPAD signal)，只要以計數卡計算在 Gate in signal 高準位期間內 SPAD signal 的脈衝個數就可以知道光強度。
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Gate in signal Trigger output
signal SPAD signal Light
ON OFF
Time
圖 2-6 觸發訊號圖
掃描模式好處是可以大幅提升掃描的速度，掃描模式取6000 點所花時 間約比步進模式快約一百倍，但訊雜比相較於步進模式不佳，因此需根據 實驗需求的不同，選擇不同的模式。
2-3 顯微鏡影像
本節將上述顯微鏡的影像依序列出，以了解不同顯微鏡定性上有何異 同。廣場顯微鏡結果如圖 2-7 右，與左邊掃描式電子顯微鏡(SEM)圖比較可 知解析度小於 500 nm(感謝交通大學材料所廖晨宏學長提供樣品)。
圖 2-7 SEM 與廣場顯微鏡比較圖
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掃描顯微鏡在步進模式結果如圖 2-8 右，右下角黑線為 4 μｍ比例尺，
左為 SEM 結果(感謝交通大學電物系許世英老師提供樣品)。
圖 2-8 SEM 與掃描顯微鏡比較圖
共焦顯微鏡與螢光共焦顯微鏡系統架構相當相似，在此只列出後者的 結果。螢光共焦顯微鏡結果如圖 2-9，使用掃描模式，左下角白線為 500 nm，
樣品為 Sigma Aldrich 公司所生產的乳膠粒，大小約為 100 nm。
圖 2-9 螢光共焦顯微鏡影像圖
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