第一章 導論
人類對於肉眼無法看見的細微結構，總是充滿著強烈好奇心，因此顯 微鏡不論在醫學、物理、材料、生物等各領域都扮演相當重要的角色，從 歷史最悠久的光學顯微鏡到近代根據 Louis de Broglie 物質波理論，以高能 電子束成像的電子顯微鏡(Electron microscope)；或是使用量子力學中的穿 隧效應，以穿隧電流大小來判斷探針與樣品距離的掃描式穿隧探針顯微鏡
(STM, Scanning tunneling microscope)，都證明了顯微技術因應科學研究而不 斷地被創新且蓬勃發展。
雖然光學顯微鏡解析度不如電子顯微鏡的奈米等級，更無法達到 STM 原子級的解析度，但是電子顯微鏡幾乎都需要將樣品至於真空中，而 STM 只能觀察樣品的表面結構，使得光學顯微鏡因非破壞量測、穿透深度可達 數釐米等優點，目前還是被廣泛使用在各領域中，並朝著得到更佳空間解 析度、時間解析度、影像對比度、樣品穿透深度邁進，我們的研究則著重 於空間解析度部份做改進。
光學顯微鏡解析度的極限在 1884 年由德國科學家 Ernest Abbe 提出，
根據 Rayleigh criterion，橫向解析度在圓形光瞳、單色光等條件，且不考慮 像差的情況下[1] ，為 0.61 乘光源波長再除以數值孔徑(NA, Numerical aperture)。所以提高解析度直接的做法，就是改用短波長光源，或是增加透 鏡的數值孔徑。但目前這兩個方法都已經達到了極限，當光源波長達到紫
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外線波段時，就會對生物樣品染色體造成破壞；而數值孔徑中鏡口角與介 質折射率兩個參數，也都已經因為製程技術等原因達到極限，因此過去科 學家一直努力找尋其他方法增加空間解析度。
有一種增加空間解析度的方法，是使用 J. W. Goodman 在 1968 年提出 的光學顯微鏡成像原理[1] ，其原理為樣品訊號與點擴散函數(PSF, Point spread function)做摺積(Convolution)運算即為光學顯微鏡成像，進而發展出 反摺積演算法(Deconvolution Algorithms)，可在不需要改變光學顯微鏡系統 的情況下演算出比較好的影像[2] ，最早的反摺積演算法為 D. A. Agard [3]
在 1984 年提出最小相鄰反摺積(Nearest-Neighbor Deconvolution)，此演算法 假設光學顯微鏡焦平面影像的訊號，一部分其實來自焦平面上方或下方結 構，也就是縱向空間解析度不足造成影像模糊，因此將影像扣除上方或下 方結構與 PSF 摺積結果，可以得到更清晰且縱軸解析度更高的結果。
在 D.A. Agard 團隊獲得成功之後，A. Erhardt [4] 等人改進了最小相鄰 反摺積，將顯微鏡三維的 PSF 以傅立葉光學理論推導出，再使用其 PSF 反 解出顯微鏡三維清晰且高解析度影像，此方法稱為 Inverse filtering。
此時在數學領域中，A. P. Dempster[5] 等人將最大期望演算法(EM, Expectation maximization algorithm)與最大似然估計(MLE, Maximum
likelihood estimation)的方法結合起來，在只知道部分實驗數據的情況下，
EM-MLE 可以估計出更合理的未知實驗數據。之後 L. A. Shepp 與 Y. Vardi[6]
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在假設系統雜訊為帕松雜訊的情況下成功將 EM-MLE 用於斷層掃描影像解 析上，開啟 EM-MLE 還原影像的序幕。
目前最常被使用在光學顯微鏡的反摺積演算法為盲蔽反摺積演算法 (Blind deconvolution)，最早由 T. J. Holmes[7] 等人成功實現，其步驟為：
1.給定一個初始的 PSF。
2.用 PSF 與顯微鏡影像，以 EM-MLE 演算樣品原始樣貌。
3.用第 2 步驟求得的樣品原始樣貌與顯微鏡影像，以 EM-MLE 演算比步 驟 1 更合理的 PSF。
4.以步驟 3 求得 PSF 取代初始 PSF，回到步驟 2。
盲蔽反摺積演算法可大幅度提升光學顯微鏡影像清晰度，如圖 1-1。
圖 1-1 Blind deconvolution 反解前(a)及反解後(b)比較圖[7]
幾乎所有的反摺積演算法，第一步皆由透過實驗或是理論求得 PSF，
實驗求得方法為觀察一個尺度小於繞射極限的微小樣品，將取得影像直接 當成 PSF[8] ，但微小樣品難製備，且尺寸太小會造成影像訊號的訊雜比太
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小，如果樣品尺寸太大又會造成影像與 PSF 差異過大，另外理論求得 PSF 方法是將孔徑值(NA)、光源波長等光學參數代入傅立葉光學計算[4] ，但可 惜無法考慮透鏡之球面像差等參數，將造成後續影像處理上困難。
本篇論文希望研究出一個新的方法，可以在不需要製作微小樣品的情 況下，以實驗複合理論的方法求得更合理的 PSF，進而使用此 PSF，用於 EM-MLE 回解樣品結構，除重現文獻中突破繞射極限的結果，更期望求出 更合理的樣品實際形貌。
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