H&E 染色

9 5 % A l c o h o l 1 0 秒 鐘 9 5 % A l c o h o l 1 0 秒 鐘 二 次 水 1 分 鐘 May’s Hematoxylin 4 分30秒 二 次 水 1 分 鐘 0 . 5 % Ac i d Al c oho l 1 分鐘 二 次 水 1 分 鐘 E o s i n Y 4 0 秒 9 5 % A l c o h o l 2 分 3 0 秒 9 5 % A l c o h o l 2 分 3 0 秒 1 0 0 % A l c o h o l 2 分 3 0 秒 1 0 0 % A l c o h o l 2 分 3 0 秒 X y l e n e 5 分 鐘 X y l e n e 5 分 鐘 H i s t o k i t t 封 片

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2. 免疫螢光法步驟

1. 組 織 於 玻 片 上 充 分 固 定 後 ， 接 著 使 用 抗 原 修 復 液 將 paraformaldehyde 固定時，形成的抗原表面醛鍵、羧甲鍵進行解鏈。

做法是將玻片浸入抗原修復液 (Novocastra^TM Retrieval Solution, Leica, U.K)中，加熱超過 95°C，持續 1 小時後，取出再浸入等溫度的去離 子水，洗去玻片表面的抗原修復液。

2.抗原修復完成後將玻片置於培養皿內，倒入足以蓋過玻片的 PBST，

振盪器設定為每分鐘 50 RPM，清洗 3 次，每次 5 分鐘。

3.倒掉PBST，並稍微吸乾玻片上多餘的液體，加入對應於二抗來源 的阻斷液(Blocking Buffer)浸泡ㄧ個小時以去除雜訊，玻片表面可以 蓋上石臘封口膜(Parafilm)防止乾燥。

4.去除阻斷液，分別加入一級抗體，覆蓋標本，並蓋上Parafilm在 4°C下反應18小時。

一抗體名稱 公司 宿主 濃度

Anti-Cleaved Caspase-3

Cell Signaling Rabbit 1:400

Anti-Cleaved Caspase-9

Cell Signaling Rabbit 1:100

Anti-Bcl-2 Cell Signaling Rabbit 1:100 Anti-Bax Cell Signaling Rabbit 1:100

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Anti-Cleaved PARP

Cell Signaling Rabbit 1:100

Anti-TNF-α Cell Signaling Rabbit 1:200 Anti- ChAT Chemicon Goat 1:100

5.取出後，以PBST沖洗3次，振盪器設定為每分鐘50 RPM，每次5分 鐘。之後加上相對應二級抗體覆蓋標本在室溫下反應2個小時。

二抗體名稱 公司 螢光種類 濃度

Anti-Goat IgG Jacksonimmuno FITC 1:200 Anti-Rabbit IgG Jacksonimmuno Cy3 1:200

6.完成後再以 PBST 沖洗 3 次，振盪器設定為每分鐘 50 RPM，每次 5 分 鐘 ， 再 滴 上 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole ； 1:1000, Invitrogen OR, U.S.A.)覆蓋五分鐘，之後以 PBST 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

7.最後滴上水性封片膠(DAKO GLYCERGEL MOUNTING MEDIUM, CA, U.S.A.)，並在玻片周圍塗上透明指甲油，存於 4°C 下，兩週內 使共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope Imaging Syste)拍攝完畢。

(五) 藥物配製

100mL 散瞳劑配製:

將 0.05g Atropine (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.95mL 的生 理食鹽水，裝入避光瓶中，保存於-4°C 冰箱。

100mL Atropine 配製:

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將 0.05g Atropine (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.95mL 的生 理食鹽水，裝入避光瓶中，保存於-4°C 冰箱。

100mL Urethane 配製:

將 0.03g Urethane (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.97mL 的生理 食鹽水中，裝入避光瓶中，保存於室溫下。

1000mLl 10x Phosphate buffered saline (PBS) 配置:

2g KCl + 80g NaCl + 2.4g KH2 PO4 + 14.4g Na2 PO4，加入去離水，

補至1000mL，調整 PH 值至 7.4 後，保存於室溫下。

500mL 4% Paraformaldehyde 配製:

取 0.4g NaOH，加入 10mL 的去離水中，配成 1N 的 NaOH。接著 取 20g 福馬林(Paraformaldehyde)，加入 400mL 的去離子水及 50mL 的 10x PBS，並加入 0.25mL 的 1N NaOH，加熱至 76°C，待澄清冷 卻後，補水至 500mL，最後用孔徑 0.2μm 的濾網(Filiter)過濾後保存 於室溫下。

100mL 改良 Modified Davidson’s Fluid 配置:

30mL 24% Paraformaldehyde + 7.23mL 95% Alcohol + 2.4117 mL Acetic acid + 10mL 去離水，震盪混和後，存於避光瓶中，放置室溫 存放。

1000 mL PBST 配置:

取 100mL 10X PBS，加入 1mL Tween-20，加入去離水，補至 1000mL，放置室溫存放。

15mL 阻斷液(Blocking Buffer)配置:

取 1.5mL 10X PBS，加入 0.75mL 血清蛋白，依據二抗來源加入，

例如羊血清蛋白(Normal Goat Serum)，兔血清蛋白(Normal Rabbit Serum)，接著加入 12.9mL 去離子水，震盪 3 秒後，加入 0.045mL

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Trition^TM X-100，分裝存於-4°C 冰箱。

10mL 稀釋液(Antibody Dilution Buffer)配置:

取 1mL 10X PBS，加入 0.03 mL Trition^TM X-100，再加入 0.1g 牛血 清蛋白（Bovine serum albumin, BSA），最後加入 10mL 去離水，充分 震盪溶解後，分裝分裝存於-4°C 冰箱。

(六) 資料分析與統計

本次實驗 ERG 分析，主要在於 a-wave 的隱含期(implicit time)、b-wave 的隱含期、a-time)、b-wave 的振幅(amplitude)、b-time)、b-wave 的振幅(參考圖 2.3)。

a-wave、b-wave 的 計 算 標 準 ， 是 依 據 國 際 視 覺 電 生 理 學 會 (Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO)訂定的標 準來來核計。a-wave 是受光細胞(receptor)對光刺激所引起的反應，

是一種負向波(請見本論文前言) ，其隱含期為從開始刺激到第一個 波谷(time-to-peak)的時間，稱為 La，b-wave 是正向波，其隱含期為 開始刺激到第一個波峰的時間，為Lb。

a-wave 的振幅為開始刺激後，出現第一個向下負波的起始點前 10 毫秒平均，作為基線(base line)。從基線到 a-wave 波谷的高度，稱為 a-wave amplitude。b-wave 的振幅計算為 a-wave 波谷到 b-wave 波峰 的高度，稱為b-wave amplitude。

每組實驗各組有六至十二隻動物不等，實驗數據以平均值±標準 誤差(mean ± S.E.)表示。以 SigmaPlot 軟體內的 Compare two way analysis of variance (ANOVA)，Suggested test 選用 Fisher LSD Method 進行分析實驗各組(among different groups)之濃度與天數、濃度與強 度之間差異是否有統計意義。所有結果都是由以 mean± SE 表示，

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p<0.05 為統計顯著差異。

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三、實驗結果

在本實驗是以分析視網膜電位（ERG）中 a-wave amplitude、a-wave implicit time 以及 b-amplitude、a-wave amplitude、b-amplitude、a-wave implicit time 對不同 濃度的 MnCl2、在第一天、第三天以及第七天，短期內的反應變化，

來評估視覺是否受 MnCl2的影響，同時，也觀察這些反應對不同光 源強度刺激有何差異？之後，再以同樣的處理方式，利用免疫組織 染色的方式來分析，眼球周邊注射不同濃度的 MnCl2，是否會引起 視網膜結構的改變，並引起細胞的凋亡路徑的發生。由於 ERG 是因 為視網膜細胞的反應所引起，組織切片結果可用於說明 ERG 的反應。

(一) MnCl

2對於ICR小鼠ERG之影響

就整體分析來看，圖3.1為注射不同濃度的MnCl2後於第一天、第 三天、第七天，在低強度(low luminous intensity : L)及高強度(high lu-minous intensity : H)光源刺激下，所記錄到的視網膜電位(ERG)的反 應。結果顯示在注射saline的情況（對照）下，無論視注射後第一天

（圖3.1A）或第三天(圖3.1D)及第七天(圖3.1G)，低強度與高強度光 源刺激都會引起視網膜電位反應，先出現向下的負向波，也就是a-wave，緊接著是向上的正向波，也就是b-wave，不過，低強度光源 刺激所引起的a-wave沒有高強度所引起的那麼明顯。然而在有注射 MnCl2的情況下，同樣是在第一天、第三天、第七天，低強度或高強 度光源刺激所引起的視網模電位反應卻不一樣，不論濃度為40 mM MnCl2 (圖3.1B、圖3.1E、圖3.1H)或是80 mM MnCl2 (圖3.1C、圖3.1F、

圖3.1I)， ERG的振幅高度反應都比對照組低，暗示MnCl2可能會抑 制ERG對光刺激的反應。由於a-wave與b-wave是由視網膜不同神經

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細胞所引發的反應，為方便計，以下將就不同劑量MnCl2在處理後的 不同天數以及不同光源強度刺激的影響，分別就其對a-wave與b-wave的影響作更進一步的分析。

1. 比較不同濃度 MnCl

2於注射後第一天、第三天、第七天對

a-wave

的影響

圖 3.2A 為注射不同濃度的 MnCl2後於第一天、第三天、第七天，

給予低強度光源刺激下，對ERG 中 a-wave amplitude 平均值的影響，

為方便計算，a-wave 雖是負向波，本實驗在定量計算時，必須將之 放大，且以正向值表示之，所以圖3.2 A 才會呈現正向柱狀，以後所 有圖的a-wave 都以正向表示。結果顯示，不管是在 Control 組或是注 射 40 mM MnCl2及 80 mM MnCl2，都在第一天的a-wave amplitude 反 應增強，然後隨時間經過第三天與第七天，反應逐漸降低，即使第 一天的amplitude 反應增強，在統計上也沒有顯著差異。

分析在低強度光源下a-wave 的 implicit time 對 MnCl2的反應(圖 3.2B) 就不一樣了，注射高濃度（80 mM）MnCl2 後的第一天，implicit time 不但從對照的對照的 34.00±0.63 毫秒 （ms）延後到 42.0±2.7 毫 秒（圖 3.2B，p<0.001），而且歷經第三天與第七天，這種延後現象 明顯減弱（圖 3.2B 80 mM 的 MnCl2不同天數的柱狀高度，p 值分別 是 0.001 與 0.05），進一步比較注射後同天不同濃度的 MnCl2 對 implicit time 的影響，在第一天的時候，80 mM MnCl2使 a-wave im-plicit time 不但如上述比對照延後，也比低劑量氯化錳（40 mM MnCl2）的31.50±0.76 毫秒顯著延後(p<0.001)，而低劑量 MnCl2對 a-wave 的 implicit time 並無明顯影響（p>0.05）。

圖 3.2C 表示在高強度光源刺激下，注射不同濃度的 MnCl2後於

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第一天、第三天、第七天，對 ERG 中 a-wave amplitude 的影響，結 果顯示，只有在第三天的時候，低劑量40 mM MnCl2 (8.16±2.37 V)

（microvoltage;

V）)和高劑量 80 mM MnCl

2 (3.49±0.46

V) 都會引

起 a-wave 振幅降低，與對照組的 14.95±3.101

V 相比較，都達到顯

著水準(分別是 p=0.04 ;p<0.001)，其他第一天及第七天，雖也有降低 的趨勢，可是都未達顯著差異。

分析在高強度光源下，不同濃度MnCl2於第一天、第三天、第七 天，對a-wave implicit time 的影響(圖 3.2D)，結果顯示，不管在 con-trol 組、注射 40 mM MnCl2或80 mM MnCl2，各天數的a-wave implicit time 相比則無顯著差異，進一步比較注射後同天不同濃度的 MnCl2

的組別，各組間比較結果也並無顯著差異（圖3.2D，p>0.05）。

2. 比較不同濃度 MnCl

2在低強度與高強度光源刺激下，ERG 中

a-wave 的反應

我們將進行比較的各組平均值重新規劃在一個圖，以便比較同 一天的低光源與高光源刺激對 a-wave 的影響，圖 3.3 的 A 與 B 是處 理後第一天的結果，C 與 D 是處理後第三天的結果，E 與 F 是處理後 第七天的結果。圖 3.3A 為注射不同濃度的 MnCl2後於第一天，給予 低強度與高強度光源刺激下，對 ERG 中 a-wave amplitude 的影響。

結果顯示，在control 組、注射 40 mM MnCl2及80 mM MnCl2，低強 度的光源刺激所引起的 a-wave 振幅均顯著低於高強度光源刺激所引 起的反應，兩者所引起的 a-wave 振幅，分別是低強度 1.19±0.06

V

比高強度的 11.04±3.44

V（p<0.001）; 低強度的 0.83±0.22 V 比高

強 度 的 9.84±1.21

V（p<0.001） 以 及 的 1.92±0.84 比 高 強 度 的

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9.00±2.77 V（p=0.017) 。

同樣也分析第一天a-wave 的 implicit time 反應 (圖 3.3B)，結果 顯示，在注射 80 mM MnCl2這一組，因 MnCl2引起 a-wave implicit time 延後程度，會因為高強度光源的刺激而顯著縮短，從 42.00±2.74 毫秒縮短到 36.67±2.19 毫秒（p=0.017)，這樣的明顯縮短並沒有發生 於對照組與低濃度的（40 mM）MnCl2注射 MnCl2後第三天，無論對 照組或是低濃度 MnCl2組，高強度的光源刺激均顯著增強 a-wave 的 amplitude，增強程度都明顯高於低強度光源所引起的反應 (0.84±0.09 毫秒比 14.94±3.101 毫秒, p<0.001 ; 0.71±0.26 毫秒比 8.16±2.37 毫秒, p=0.005)，在 80 mM MnCl2組，高強度雖也引起 a-wave 振幅增強，

唯增強程度與低強度光源刺激所得結果相比，並沒有達到顯著差異，

如前所述，光刺激引起a-wave amplitude 增強會隨著 MnCl2處理而降 低，且成劑量反應，充分說明MnCl2會抑制ERG 對光的反應。

分析不同濃度的 MnCl2後於第三天，ERG 中 a-wave implicit time 的反應(圖 3.3D)，顯示不論是對照組或注射 40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2，高強度或低強度光源的刺激對 a-wave implicit 的影響都沒有 明顯的差異。

圖 3.3E 是注射不同濃度的 MnCl2後第七天，在對照組、注射 40 mM MnCl2及 80 mM MnCl2組，低強度的光源刺激所引起 a-wave am-plitude 增強程度都遠低於高強度光源所引起的反應，這兩種刺激所 引起的a-wave amplitude 反應比，分別是 0.47±0.21

V vs. 8.63±0.23

V （p<0.001）; 0.60±0.20 V vs.5.37±0.78 V (p<0.001) 以 及

0.70±0.19 V vs.7 10±1.24 V（p<0.001)。

至於第七天的a-wave implicit time 反應，無論是對照組或注射 40

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mM MnCl2及80 mM MnCl2組，高強度或低強度光源的刺激雖然都使 a-wave implicit time 延後，但是這兩種刺激在統計上並沒有差異。

3. 比較不同濃度 MnCl

2於注射後第一天、第三天、第七天，對

b-wave 的影響

圖 3.4A 為注射不同濃度的 MnCl2後於第一天、第三天、第七天，

給予低強度光源刺激下，對ERG 中 b-wave amplitude 平均值的影響。

結果顯示，對照組，低強度光源刺激會引起 b-wave 振幅從第一天的 151.99±8.80 V 增加到第三天的 210.52±24.41 V（圖 3.4A，p<0.01），

在第七天時，低強度光源刺激會促使振幅提升到的 207.53±9.30

V

（圖3.4A，p<0.01）。光源刺激對 b-wave 的增強效應，會因為 MnCl₂

（圖3.4A，p<0.01）。光源刺激對 b-wave 的增強效應，會因為 MnCl₂

在文檔中 錳離子在ICR小鼠視網膜毒性之研究 (頁 19-34)