錳離子在ICR小鼠視網膜毒性之研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 錳離子在ICR小鼠視網膜毒性之研究 Toxicity of Manganese ions to ICR mice retina. 研究生：林天宇 Tian-Yu Lin 指導教授：吳忠信博士 Chung-Hsin Wu, Ph. D. 中華民國 103 年 2 月.

(2) 目錄中文摘要. ····································································· 5. 英文摘要. ····································································· 6. 一、前言. ····································································· 8. （一）錳的來源和分布. ··········································· 8. （二）錳在體內的的生理作用（三）高濃度錳汙染的致病路徑（四）高濃度錳汙染致病機轉（五）細胞凋亡(apoptosis). ······································ 8 ··································· 9 ····································· 10. ········································· 11. （六）高濃度錳對眼睛的損害. ····································· 12. （七）視網膜電位圖 (Electroretinogram，ERG) ·················· 13 （八）研究的問題 ···················································· 14 二、研究的材料與方法. ·················································· 16. （一）實驗動物 ······················································· 16 （二）氯化錳 (MnCl2) 注射 ········································· 16 （三）視網膜電圖記錄 (ERG recording) （四）病理切片. ························ 17. ····················································· 18. 1. H&E 染色法步驟. ······································· 19. 2. 免疫螢光法步驟 ············································· 20 （五）藥物的配製. ················································· 21. （六）資料的分析與統計. ··········································· 23. 三、結果 ····································································· 25 （一） MnCl2 對於 ICR 小鼠 ERG 之影響 ························ 25 1. 比較不同濃度 MnCl2 於注射後第一天、第三天、第七天對 a-wave 的影響. ··········································· 26 2.

(3) 2. 比較不同濃度 MnCl 2 在低強度與高強度光源刺激下， ERG 中 a-wave 的反應. ···································· 27. 3. 比較不同濃度 MnCl2 於注射後第一天、第三天、第七天，對 b-wave 的影響 ············································ 29 4. 比較不同濃度 MnCl 2 在低強度與高強度光源刺激下， ERG 中 b-wave 的反應. ··································· 31. （二） H&E 染色及 ChAT 與 TNF-α 免疫螢光染色結果········· 33 1. H&E 染色. ··················································· 33. 2. ChAT 免疫螢光染. ····································. 3. TNF-α 免疫螢光染. ········································ 35. 34. （三） Apoptosis 細胞凋亡因子免疫螢光染色結果··············· 36 1. Cleaved Caspase-9 免疫螢光染色. ······················ 36. 2. Cleaved Caspase-3 免疫螢光染色 ······················ 37 3. Cleaved PARP 免疫螢光染色 4. Bax 免疫螢光染色 5. Bcl-2 免疫螢光染色. ························ 38. ········································· 39 ······································· 40. 四、討論 ····································································· 41 （一）將 MnCl2 以 subconjunctival injection 方式，造成視網膜的 ERG 與組織構造發生改變是一項實驗技術 ·············· 41 （二） MnCl2 可能藉由損傷感光細胞而引起視網膜 a-wave 高度降低. ····························································· 42. （三） MnCl2 可能藉由損傷視網膜 ONL 層上的細胞而引起視網膜 b-wave 高度降低 ·········································· 46 （四） MnCl2 可能僅在注射初期才會引起視網膜電位的 implicit time 延後. ······················································ 47 3.

(4) 五、結論. ···································································· 49. 六、參考文獻. ······························································ 50. 七、圖表與圖說 ···························································· 58. 4.

(5) 摘要本研究主要在於探討過量錳離子對 ICR 小鼠視網膜功能之影響。錳離子在動物體內需求極微量但卻不可或缺，過量的錳進入體內會造成中毒。過去對錳中毒的研究大多著重在呼吸系統、中樞神經系統損傷及發炎等臨床現象，對於視覺系統的研究非常少，對於錳的急性影響研究更少。本研究是利用眼瞼下注射 (subconjunctival injection)的方式，將生理食鹽水（control)、40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2 注入眼球，觀察注射後在第一天、第三天及第七天，以不同強度光源的刺激，觀察小鼠視網膜電位 (ERG) a-wave 與 b-wave 的振幅與隱含期的反應，以評估檢測視網膜功能是否受到影響。進一步再利用 H&E 染色，評估視網膜各層構造，探討視網膜的哪一層細胞可能受到影響，也利用免疫組織染色技術，以 cleaved caspase-9、 cleaved caspase-3、cleaved PARP、TNF-α、Bax、Bcl-2 等抗體，來評估視網膜細胞受傷害的程度，結果顯示，眼瞼下注射不論在 40 mM 或 80 mM MnCl2 的濃度，確實都會造成視網膜功能受損，結果顯示 ERG 的 a-wave 和 b-wave 振幅 (amplitude)降低、隱含期 (implicit tim) 延長，視網膜組織受損，從 ChAT 表現推測眼壓應沒有升高，免疫染色呈現視網膜可能發炎，也不能排除細胞發生凋亡的可能性。這些結果顯示 MnCl2 處理眼球，短時間的急性毒害可能是引起視網膜發炎、甚至細胞凋亡，因而引起 ERG 的 a-wave 與 b-wave 發生改變。. 關鍵字 : 錳、視網膜、眼瞼下注射、氯化錳、ICR小鼠、視網膜電位 (ERG)、細胞凋亡(apoptosis). 5.

(6) Abstract The purpose of the present study was to assess the toxic effect of manganese (Mn) to the retina of ICR mice. Manganese is essential for human and animal bodies although its requirement is very minor. Excess accumulation of Mn in the animal body may induce toxic to a variety of tissues. The study of Mn toxic effect are most concentrated in the respiratory system and central nervous system in the clinic as well as the inflammatory effect. The toxic effect of Mn on the visual system is still to be uncertain. To examine the toxic effect of Mn on the retina, MnCl2 was microinjected into the subconjunctiva of both sides in the ICR mice. The animal was received two different concentrations of MnCl2 solution, 40 mM and 80 mM, and saline as the control. On the first, third and seventh days after injection, the electroretinogram (ERG) of all experimental mice was examined in response to the low and high illumination to evaluate the function of the retina. After ERG examination, the retina of both eyes of each mouse were dissected and fixed, were then stained with hematoxylin and eosin (H&E) and immunofluorescence with the antibodies of Cleaved Caspase9,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP,TNF-α, Bax, Bcl-2 and ChAT. We found that MnCl2 treatment produced a decrease in the amplitude and a simultaneous delay of the implicit time of both the a-wave and b-wave caused by the low and high intensity of luminous. Histological data demonstrated that the retinal cells, specially in the inner nuclear layer and ganglionic layer, probably loss. Data from the immunochemical studies had shown that the TNF- and apoptotic proteins were expressed in the retina. These data strongly suggest that malfunction of the retina caused by MnCl 2. 6.

(7) treatment may be due to the pathological changes of the neurons in the retina because of their inflammation and apoptosis. Keywords : manganese, retina, subconjunctiva injected, MnCl2, ICR mice, electroretinogram (ERG), apoptosis. 7.

(8) 一、前言（一）錳的來源和分布錳為一灰白色金屬，質地堅而脆，處於潮濕環境下會氧化，1774 年，由瑞典科學家 J. Gahn 從礦物中分離出來(Gahn and Trofast 1991)，是地球上排名第十二多的元素。錳廣泛的存在於自然界中，包括土壤、岩石、空氣、湖泊、溪流、海洋，甚至於動、植物等生物體 (Alessio et al., 2007)，常與其他物質結合成固態化合物，並以微顆粒的狀態懸浮於空氣中，且易溶於水(Hofmann 1924)。日常飲用水中約含有 0.004 ppm，空氣中約含 0.02 mg/m3，而土壤中約有 40-900 ppm (National Research Council. Committee on Biologic Effects of Atmospheric Pollutants. 1973)。錳也常見於錳礦工廠、錳鐵合金工廠或是電池工廠，這些工廠的作業環境中含有高密度的錳塵，而這些工廠的所排放出的廢氣與廢水中，也都受到高濃度的錳所汙染(Preisler 1980; Saric and Piasek 2000)。另外，現今的無鉛汽油中，常會添加甲基環戊二烯基三羰基錳（methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl；MMT），用於替換其中的鉛化合物，是一提高汽油的辛烷值降低爆震的添加劑，但在燃燒後會產生大量含錳的廢氣。. （二）錳在體內的的生理作用許多食物中也含有錳，正常人每天從食物中攝取 3-9 mg 的錳，就能滿足身體所需(United Nations Environment Programme. et al. 1981)。錳相較於其他金屬離子在動物體內，所需極微量，但卻不可或缺，除了調節生理反應中氨基酸、蛋白質、脂類和碳水化合物的代謝與合成之外，也可作為某些酵素的輔因子，例如存在線粒體內的錳超氧 8.

(9) 化物歧化酶（MnSOD 或稱 SOD2)，可以幫助線粒體內具毒性的超氧陰離子( O2- )轉變成過氧化氫( H2O2 )，透過此方式清除超氧化物，保護細胞免受氧化損傷(Holley et al. 2011)。因為在食物和自然界中，錳的取得並不困難，所以在人體，少有錳缺乏的臨床疾病報告。人體有其應對的調節機制，當食物中有較高量的錳時，錳的吸收率會變小；相反的，當食物中含較低量的錳，則其吸收率會增加，故經由食物或水被消化道吸收的錳，大部份會透過糞便排出體外，僅約 3-5 %會吸收進入體內(Bouchard et al. 2011)，不過在動物實驗結果卻發現，缺乏錳會造成發育遲緩、骨骼和生殖機能產生障礙，感覺系統(sensory system)異常。不過，人體這種調節機制有一定限度，當過量的錳進入體內，還是會因為吸收過量造成中毒(Agricultural and Food Research Council (Great Britain) 1984; Elsner and Spangler 2005; Young et al. 1996)。. （三）高濃度錳汙染的致病路徑研究指出，長期暴露於高濃度錳塵或錳燻煙之下，經由空氣吸入或喝取到受到錳塵汙染的水，都可能會引起錳中毒，危害到人體健康(Baselt 2008; Chen and Copes 2011; Normandin and Hazell 2002)。臨床報告指出，長期暴露於高濃度錳環境中的工作者，會出現嗅覺喪失、聽力下降等症狀與疾病(Erway et al. 1986; Moberly et al. 2012)；在過去研究也指出，錳可以經由呼吸道吸收，經吸入的高濃度且直徑小於 5 μm 以下細小錳塵，可經過支氣管後被肺泡吸收，直接進入肺靜脈血流，再經由心臟的推動而傳送全身 (Camner et al. 1985; Couper 1837)。在錳工廠作業的員工及錳鐵工廠附近居民，大都有咳嗽、支氣管炎、肺炎以及肺功能障礙的現象產生，且當含錳 9.

(10) 塵減量時，這些呼吸症狀有可能獲得部份改善(Davies 1946; Huang et al. 2003; Shinotoh et al. 1997)。錳也可以透過消化道吸收而進入心臟血管系統後。有研究觀察到，錳鐵工廠員工的收縮壓較低(Roels et al. 1987)，紅血球的 SOD 上升以及血漿的脂類過氧化物（Malondialdehyde）均有增加的現象(Mena et al. 1967)。然而在動物實驗卻證實錳會降低體內脂類過氧化物的生成，顯示收縮壓較低與過氧化物產生的變化並沒有直接的相關(Ulrich et al. 1979)。且一般認為，一旦出現錳中毒的症狀就很難恢復正常，但有臨床報告也指出，在短期性的錳暴露終止之後，症狀有可能得到部份改善 (Ghanizadeh 2009)。. （四）高濃度錳汙染致病機轉前述在高濃度錳離子環境下，會造成體內各系統不同程度的損害，但損害的機制到目前為止並不明確，依前人的研究為例，利用含錳離子的化合物進行毒害試驗，無論皮下注射、吸入或餵食等給藥方式，都發現錳堆積在多種組織中，如大鼠、小鼠、猴子及人的大腦基底核(Lucchini et al. 2000; Newland et al. 1989; Wan et al. 1991) ，以及肝、腎、心等內臟(Kang and Gore 1984; Wolf and Baum 1983)。錳離子不正常的堆積，會使中樞神經產生發炎現象，造成細胞死亡，進而損傷了中樞神經系統的組織(Moreno et al. 2008; Norenberg and Martinez-Hernandez 1979; Wedler and Denman 1984)，以基底核為例，這是中樞神經系統中涉及運動協調的重要組織，若遭受到錳離子的毒害時，會產生類似帕金森氏症(Parkinson’s like disease)的症狀，如抽搐、平衡失調、步態異常及四肢震顫(Cersosimo and Koller 2006) ，有時還伴有精神障礙，稱為錳症(manganese disease)(Rodier 1955)。 10.

(11) 究其原因，可能是因過量錳離子運送到基底核的神經細胞內，大量堆積在粒線體，除了抑制鈣離子從粒線體流出，也同時抑制粒線體中調控電子傳遞鏈(electron transport chain)的三磷酸腺苷酶(ATP synthase) (Singh et al. 1979)與呼吸鏈(respiratory chain)的 complex II 輔酶的活性，進而導致自由基(reactive oxygen species；ROS)上升(Liu et al. 2013; Zhang et al. 2003)。另外也有研究指出，使用人類 Gli36 細胞，暴露於氯化錳(MnCl2) 24 小時後，結果發現粒線體中 Bax/Bcl-2 比值顯著上升，進而引發細胞凋亡路徑因子 Cleaved Caspase-3/9 及 Cleaved PARP-1 在細胞中的表現量上升(Alaimo et al. 2013)。動物實驗所得結果顯示，急性吸入高濃度的錳化合物後，會合併有肺水腫和肺炎的結果下，體外實驗，利用人的支氣管上皮細胞 (16HBE)進行培養，在給予高0.1875 mM濃度的MnCl2處理，12及24 小時後，發現caspase-9以及caspase-3的表現量都上升，暗示過量的錳離子，會造成細胞趨向細胞凋亡。綜合以上的論述，不論是經由攝食、吸入甚至注射過量的錳至體內或處理細胞，都會造成器官上不同程度的病變或是細胞凋亡。. （五）細胞凋亡(apoptosis) 何謂 Bax/Bcl-2、 Caspase-3/9 及 PARP-1? 當細胞遭受外來刺激誘發產生細胞凋亡時，胞內會產生一群屬於 cysteine protease 的蛋白酵素，稱之為 caspases (Alnemri et al. 1996)，Caspase 會受到來自細胞表面之死亡受體(death receptor)的途徑及粒線體起始的途徑所活化。在粒線體起始的活化途徑方面，由粒線體中釋放而出的 cytochrome c 會與 Apaf-1 形成多體複合物(multimetric complex)而進一步與 procaspase-9 結合，並且將其活化。活化的 caspase-9 會進一步活化下游 11.

(12) 的 caspase-3。caspase-3 則會降解 PARP，抑制 DNA 的修復能力。此外，粒線體外膜上的 Bcl-2 蛋白家族的表達亦能參與調控，其中 Bcl2 亞家族，主要功能是抑制細胞凋亡的發生，而 Bax 亞家族，主要功能是促進細胞凋亡的發生，Bcl-2 會抑制 Bax 透過破壞粒線體膜並去阻斷 cytochrome c 從粒線體內釋放出來(Bredesen 2007; Kroemer et al. 2007)，故透過觀察 caspase-3 和 caspase-9 細胞凋亡因子和降解 PARP 的產生程度及 Bcl-2 和 Bax 表現，可以評估錳離子是否會促使細胞凋亡。. （六）高濃度錳對眼睛的損害由前述得知，不論是動物體或人，暴露在錳缺乏或高濃度的環境下，都會造成部分器官系統的損傷，惟對於眼睛方面的損傷如何？臨床案例並不多。在動物試驗方面，Gong 和 Amemiya (Gong and Amemiya 1996)的研究提出，實驗大鼠餵飼缺乏錳的飼料後，感光細胞及神經節細胞數量減少且受損。Endo 等人(Endo et al. 2008)的研究報中也指出，長期給予缺乏錳的飼料，視網膜的功能會受損、功能變差，視網膜電位圖(electroretinogram；ERG)a-wave 和 b-wave 振幅皆變小，波型出現的時間也延後。 Zhang 等人(Zhang et al. 2010)使用 30 號針頭(內徑 0.15 mm，外徑 0.3 mm)由角膜緣後 2 mm 處穿刺，將高劑量 (> 20 mM) MnCl2 注入眼球的玻璃樣液，注入體積是 0.025 m L 注射後第 7 天以及第 28 天進行實驗，量測 ERG 與視網膜病理解剖，發現視網膜上的細胞，出現細胞核萎縮，甚至產生缺少導致結構層損壞的現象，以及視網膜電訊號 b-wave 振幅變低與 b-wave 隱含期延後等結構和功能的改變； Luo 等人(Luo et al. 2012)，使用 10-mL 漢密爾頓微量管附上 26-s 針頭 12.

(13) (外徑 0.47 mm，內徑 0.13 mm，Hamilton, catalog #80300) 將濃度高於 25 mM 的 MnCl2 注射至 SD 大鼠眼球玻璃樣液，14 天後進行切片染色，發現感光細胞和視網膜色素上皮細胞，型態上出現不正常減少及損壞的現象。 Sun 等人使用雌性 C57BL / 6 小鼠，分別將 1 M 的 MnCl2 溶於 0.01 M PBS 和去離子水中，以 0.005 mL 點眼的方式，讓眼藥滯留於左眼球表面一小時，在兩周內進行三次後，視網膜神經節細胞數量顯著的下降 20%，但是在三個月後卻有恢復的情況發生，另外在此實驗中也發現到，以這樣的給藥方式，含有 MnCl2 的組別，角膜厚度有明顯增厚的情形(Sun et al. 2012)。. （七）視網膜電位圖 (Electroretinogram，ERG) 眼睛是我們的靈魂之窗，視網膜更是在生物視覺系統中，扮演重要的關鍵，倘若視網膜受損傷，極有可能影響視力，嚴重甚至可能造成失明，但現在醫學的進步，可以利用 ERG 的診斷來判定其損傷的程度。視網膜電位圖已成為一般眼科常用之功能檢查項目之一，其電位圖形成的路徑，一般認為是視網膜受光刺激後，經過玻璃體傳到角膜，在角膜和視網膜之間，存在電位差，如果以電極線連接，可以記錄到靜止電位，電位可以隨著不同的波長、不同強度的光源刺激而改變，所記錄到的電訊號圖形，即為 ERG。在明亮的環境下所做的 ERG 稱為亮適應 ERG (light adaptation)，通常用來檢測錐狀細胞(cones)的功能；而在暗室下所做的 ERG，稱為暗適應 ERG (dark adaptation)，可經由此檢測桿狀細胞(rods)的功能(Armington 1974; Heckenlively and Arden 2006)。 ERG 所出現的波型依順序命名為 a –wave、b –wave、c –wave。a – 13.

(14) wave 是一負波，它主要由感光細胞所產生； b –wave 是繼 a –wave 之後的一個正波，它主要由視網膜雙極細胞層(bipolar cell)和 Müller 細胞(Müller cell)所產生；c –wave 是繼 b –wave 之後緩慢升起的另一個角膜正向波，起源於視網膜色素的上皮層(retinal pigment epithelium cells)(Gotch 1903; Oakley et al. 1977)(參考圖 1. 視網膜各層細胞對視網膜電圖的貢獻)。儘管陸續又先後發現了一些其他新的波型與來源，但這種命名方法還是一直沿用至今。此外，Granit 在 1933 年使用 ERG 檢測動物在給予乙醚、缺氧和氯化鉀等等處理後，波形會受到影響而改變，進而提出，ERG 所產生的波型，是視網膜對刺激的所做出的綜合反應，可用來記錄在不同藥物、光強度處理下對視網膜所產生的影響，依各種波型出現的時間、振幅的大小，來推測視網膜上各層細胞功能是否正常或發生何種變化(Granit 1933)。. （八）研究的問題綜合上述前人的研究，可發現不論以微量注射 MnCl2 於眼球內或滴至眼球表面的給予方式，在不同種類的動物，都可發視網膜功能或結構上的改變，同時也可能會造成角膜厚度改變，但是在病理解剖上發現，各層細胞損壞的程度及時間點並不一致，回復的時間點也不同，另外，直接將錳注射或給予至動物眼球上，是否會產生細胞凋亡的直接證據仍不明。Büchi 等人將生理食鹽水至眼球，使眼壓升高至約 110 mmHg，引起視網膜缺血 (Buchi et al. 1991)，更有研究指出，眼睛在持續維持高眼壓的情況下，也會造成視網膜神經節細胞損害，並伴有細胞凋亡的現象發生，嚴重會造成青光眼(Joachim et al. 2013)。 14.

(15) Wu 等人在 2012 的實驗中發現，將濃度高於 10 mg / mL 的 Bletilla striata polysaccharide (BSP)，由瞼結膜(subconjunctival)注射，結果有輕微的發炎反應，3 天內可完全恢復；若由眼房前(intracameral)注射，發炎程度雖比瞼結膜注射輕微，但恢復期卻長達 7-14 天，若注入的 BSP 濃度高達 80 mg / mL，則會出現角膜內皮細胞和晶狀體損壞(Wu et al. 2012)，這意味著瞼結膜注射比穿刺眼球注射，更為安全，且前人文獻探究大多是非急性過量錳離子處理下的 ERG 反應，至於短期急性處理錳所引起的眼視網膜變化，究竟是沒有變化或是變化輕微，並無論及，所以我的實驗目的是想探究: 1. 利用瞼結膜下注射 (subconjunctival injection)的方式，探討注射不同濃度的 MnCl2 後第一天、第三天以及第七天，藉由 ERG 的反應，觀察短期內對視網膜功能的影響。 2. 利用組織切片，進行免疫染色的方式來探討，眼球周邊注射不同濃度的 MnCl2，是否會引起視網膜結構的改變及造成細胞的死亡。. 15.

(16) 二、研究材料與實驗方法 (一) 實驗動物本實驗使用六週齡大，45-60 克重之 ICR 公鼠，飲水與飼料充足任飼供應，飼養於 12 小時光照以及 12 小時暗室的週期環境之中。環境溫度控制在 25 ± 1 °C，濕度控制在 40-60 %。材料：氯化錳 (MnCl2·4H2O)：所使用的 MnCl2 是一種粉紅色的結晶固體，含有四個結晶水，購自 Sigma 公司，產品編號：M3634-100G。實驗時，將 MnCl2 溶於生理鹽水。方法：注射 MnCl2 前將 MnCl2·4H2O 溶於的 0.9 % 生理食鹽水(信東生技股份有限公司)之中。依注射濃度及飼養天數將小鼠分為九組，第一、四、七組於左右眼各注射生理食鹽水 0.05 mL (控制組)，第二、五、八組左右眼各注射的 40 mM MnCl2 0.05 mL (中劑量組)，第三、六、九組左右眼各注射 80mM MnCl2 0.05 mL (高劑量組)，注射後，分別飼養一天(一、四、七組)，三天(二、五、八組)，七天(三、六、九組) 後，進行視網膜電圖記錄及病理解剖。. (二) 氯化錳 (MnCl2)注射本次實驗藥物給予的方式為瞼結膜注射(subconjunctival injection) (參考附圖 2.1)，將小鼠輕握於左手，使其四肢朝向掌心，頭部固定於左手弧口處，此時由注射者目視拳握左手，可觀察到小鼠雙眼連視軸線，平行左手弧口，即為保定完成。接著使用 BD 胰島素專用塑膠注射筒附 30 號針(內徑 0.15mm，外徑 0.3mm)，用針頭稍微挑開下 16.

(17) 眼瞼，以與視軸夾約 45 度之角度朝瞼結膜中央進行穿刺，穿刺後緩慢將針筒內的 MnCl2 溶液推出，注射足量後，停滯約 3 秒後再緩慢把針頭拔出。. (三) 視網膜電圖記錄 (ERG recording) 實驗前一天，先將小鼠置於暗房(房間溫度維持 36-37°C，所有會產生光亮之儀器，皆由紅色玻璃紙包覆)進行暗適應 (dark adaptation) 至少十二小時，其後之流程皆於暗房中完成。試驗前一小時，動物在兩眼各滴一滴散瞳劑 (Atropine 0.05%, Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)，接著小鼠肌肉注射 (Atropine 0.5 mg/kg, Sigma)以預防呼吸道黏液分泌過多，視網膜電圖記錄前 20 分鐘再以 Urethane (1.2 g/kg, Sigma)腹腔注射進行麻醉。麻醉後的小鼠俯臥於手術台上，使用無菌針灸針 (宇光針灸針，宇光實業有限公司)穿刺四肢固定，將參考電極接於靠近兩眼之間，例如前額，接地極接於尾巴根部，並將白金電極輕觸左眼球角膜作為紀錄電極，紀錄電極固定在三向 micromanipulator 上，以方便微調電極位置方便記錄。接著將發光二極體(LED, Ligemitted diode)放置於眼球前 10 公分處，透過自行設計的主機板及時間控制器來啟動閃光和調整閃光之強度。由電源刺激器 (GRASS S8800 Stimulator, Quincy, MA, U.S.A.)提供電源給予 LED 產生兩種光線刺激強度(低強度為 0.28 燭光/平方公尺，高強度為 1.75 燭光/平方公尺)，由光線強度最小的開始給予刺激，每種強度刺激間隔為 150 秒，單次強度閃光刺激頻率為 2000 毫秒內有 170 毫秒的光線刺激，連續給予 29 次，刺激所引起的視網膜電訊號微弱，必須經由放大器 (Grass AC Preamplifier P511, Quincy, MA, U.S.A.)進行 1000 倍放大後，低通 (low cut)及高通 (high cut)設為 0.3 - 1000 Hz 之間，視網膜產生的電訊 17.

(18) 號放大後再透過 Powerlab (Powerlab 4SP, ADIntruments, Pty, Ltd, Castle Hill, NEW, Australia)轉為數位訊號，再經由 LabChart 7 軟體開啟後紀錄到電腦硬碟中並將連續給予 29 次刺激後記錄到的視網膜電訊號進行平均，即為當次強度所測得的結果(參考附圖 2.2 之儀器設置)。. (四) 病理切片每隻實驗動物在完成視網膜電圖記錄之後，再追加麻醉劑達深度麻醉狀態，進行灌流、犧牲。方法是剪開動物胸腔找到心臟位置，剪斷上腔靜脈後，以 26 號針刺入左心室，使用 100 mL 0.9% 生理食鹽水灌流，直到所有生食鹽水全部由左心室灌入後 (約 10 分鐘)，接著再以 50 mL 4% paraformaldehyde 灌流，待 paraformaldehyde 灌流完成 (約 5 分鐘) ，取出眼球，用 30 號針在角膜邊緣穿刺後，投入改良過的 Modified Davidson’s Fluid，在 4°C 下浸泡一天後，換以 15% sucrose 浸泡一天脫水，再以 30% sucrose 浸泡一天加強脫水。之後取出眼球，以眼科剪沿角膜緣剪開後將玻璃體取出，接著將剩餘的眼杯投入預先灌入微量離心管的冷凍包埋劑 (SAKURA TissueTek® O.C.T. Compound) ，浸潤約 30 分鐘，調整切片方向為順視軸方向，放入液態氮包埋固定後存入-20°C 冰箱保存。接著以冷凍切片機機 (Microtome Freezing, Leica CM3035 S, U.S.A.)，標本頭溫度(OT)設定為-21 °C，冷凍操作室溫度(CT)設定為-23°C，切片厚度為 10 μm，進行切片。使用載玻片(Micro Slides, silane Coating #5116, MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD)利用溫差的方式將冷凍切片直接黏附上去。再將玻片整個置入冷丙酮固定約 5 分鐘，乾燥 10 分鐘後，以 46 °C 烤片至少一小時加以固定。最後以蘇木精— 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，簡稱 H&E 染色法和免疫螢光法 18.

(19) (Immunofluorescence)分別進行染色。. 1. H&E 染色法步驟. 9 5 % Al c o h o l. 10 秒鐘. 9 5 % Al c o h o l. 10秒鐘. 二次水. 1分鐘. May’s Hematoxylin. 4 分30秒. 二次水. 1分鐘. 0.5% Acid Alcohol. 1分鐘. 二次水. 1分鐘 40 秒. Eosin Y 9 5 % Al c o h o l. 2 分 30秒. 9 5 % Al c o h o l. 2 分 30秒. 1 00 % Al co ho l. 2 分 30秒. 1 00 % Al co ho l. 2 分 30秒. Xylene. 5 分鐘. Xylene. 5 分鐘封片. Histokitt. 19.

(20) 2. 免疫螢光法步驟. 1. 組織於玻片上充分固定後，接著使用抗原修復液將 paraformaldehyde 固定時，形成的抗原表面醛鍵、羧甲鍵進行解鏈。做法是將玻片浸入抗原修復液 (NovocastraTM Retrieval Solution, Leica, U.K)中，加熱超過 95°C，持續 1 小時後，取出再浸入等溫度的去離子水，洗去玻片表面的抗原修復液。. 2.抗原修復完成後將玻片置於培養皿內，倒入足以蓋過玻片的 PBST，振盪器設定為每分鐘 50 RPM，清洗 3 次，每次 5 分鐘。. 3.倒掉PBST，並稍微吸乾玻片上多餘的液體，加入對應於二抗來源的阻斷液(Blocking Buffer)浸泡ㄧ個小時以去除雜訊，玻片表面可以蓋上石臘封口膜(Parafilm)防止乾燥。. 4.去除阻斷液，分別加入一級抗體，覆蓋標本，並蓋上Parafilm在 4°C下反應18小時。. 一抗體名稱. 公司. 宿主. 濃度. Anti-Cleaved. Cell Signaling. Rabbit. 1:400. Cell Signaling. Rabbit. 1:100. Anti-Bcl-2. Cell Signaling. Rabbit. 1:100. Anti-Bax. Cell Signaling. Rabbit. 1:100. Caspase-3 Anti-Cleaved Caspase-9. 20.

(21) Anti-Cleaved. Cell Signaling. Rabbit. 1:100. Anti-TNF-α. Cell Signaling. Rabbit. 1:200. Anti- ChAT. Chemicon. Goat. 1:100. PARP. 5.取出後，以PBST沖洗3次，振盪器設定為每分鐘50 RPM，每次5分鐘。之後加上相對應二級抗體覆蓋標本在室溫下反應2個小時。二抗體名稱. 公司. 螢光種類. 濃度. Anti-Goat IgG. Jacksonimmuno. FITC. 1:200. Anti-Rabbit IgG Jacksonimmuno. Cy3. 1:200. 6.完成後再以 PBST 沖洗 3 次，振盪器設定為每分鐘 50 RPM，每次 5 分鐘，再滴上 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole ； 1:1000, Invitrogen OR, U.S.A.)覆蓋五分鐘，之後以 PBST 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。. 7.最後滴上水性封片膠(DAKO GLYCERGEL MOUNTING MEDIUM, CA, U.S.A.)，並在玻片周圍塗上透明指甲油，存於 4°C 下，兩週內使共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope Imaging Syste)拍攝完畢。. (五) 藥物配製 100mL 散瞳劑配製: 將 0.05g Atropine (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.95mL 的生理食鹽水，裝入避光瓶中，保存於-4°C 冰箱。 100mL Atropine 配製: 21.

(22) 將 0.05g Atropine (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.95mL 的生理食鹽水，裝入避光瓶中，保存於-4°C 冰箱。 100mL Urethane 配製: 將 0.03g Urethane (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)溶於 99.97mL 的生理食鹽水中，裝入避光瓶中，保存於室溫下。 1000mLl 10x Phosphate buffered saline (PBS) 配置: 2g KCl + 80g NaCl + 2.4g KH2 PO4 + 14.4g Na2 PO4，加入去離水，補至 1000mL，調整 PH 值至 7.4 後，保存於室溫下。 500mL 4% Paraformaldehyde 配製: 取 0.4g NaOH，加入 10mL 的去離水中，配成 1N 的 NaOH。接著取 20g 福馬林(Paraformaldehyde)，加入 400mL 的去離子水及 50mL 的 10x PBS，並加入 0.25mL 的 1N NaOH，加熱至 76°C，待澄清冷卻後，補水至 500mL，最後用孔徑 0.2μm 的濾網(Filiter)過濾後保存於室溫下。 100mL 改良 Modified Davidson’s Fluid 配置: 30mL 24% Paraformaldehyde + 7.23mL 95% Alcohol + 2.4117 mL Acetic acid + 10mL 去離水，震盪混和後，存於避光瓶中，放置室溫存放。 1000 mL PBST 配置: 取 100mL 10X PBS，加入 1mL Tween-20，加入去離水，補至 1000mL，放置室溫存放。 15mL 阻斷液(Blocking Buffer)配置: 取 1.5mL 10X PBS，加入 0.75mL 血清蛋白，依據二抗來源加入，例如羊血清蛋白(Normal Goat Serum)，兔血清蛋白(Normal Rabbit Serum)，接著加入 12.9mL 去離子水，震盪 3 秒後，加入 0.045mL 22.

(23) TritionTM X-100，分裝存於-4°C 冰箱。 10mL 稀釋液(Antibody Dilution Buffer)配置: 取 1mL 10X PBS，加入 0.03 mL TritionTM X-100，再加入 0.1g 牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA），最後加入 10mL 去離水，充分震盪溶解後，分裝分裝存於-4°C 冰箱。. (六) 資料分析與統計本次實驗 ERG 分析，主要在於 a-wave 的隱含期(implicit time)、bwave 的隱含期、a-wave 的振幅(amplitude)、b-wave 的振幅(參考圖 2.3)。 a-wave、b-wave 的計算標準，是依據國際視覺電生理學會 (Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO)訂定的標準來來核計。a-wave 是受光細胞(receptor)對光刺激所引起的反應，是一種負向波(請見本論文前言) ，其隱含期為從開始刺激到第一個波谷(time-to-peak)的時間，稱為 La，b-wave 是正向波，其隱含期為開始刺激到第一個波峰的時間，為 Lb。 a-wave 的振幅為開始刺激後，出現第一個向下負波的起始點前 10 毫秒平均，作為基線(base line)。從基線到 a-wave 波谷的高度，稱為 a-wave amplitude。b-wave 的振幅計算為 a-wave 波谷到 b-wave 波峰的高度，稱為 b-wave amplitude。每組實驗各組有六至十二隻動物不等，實驗數據以平均值±標準誤差(mean ± S.E.)表示。以 SigmaPlot 軟體內的 Compare two way analysis of variance (ANOVA)，Suggested test 選用 Fisher LSD Method 進行分析實驗各組(among different groups)之濃度與天數、濃度與強度之間差異是否有統計意義。所有結果都是由以 mean±SE 表示， 23.

(24) p<0.05 為統計顯著差異。. 24.

(25) 三、實驗結果在本實驗是以分析視網膜電位（ERG）中 a-wave amplitude、awave implicit time 以及 b-wave amplitude、b-wave implicit time 對不同濃度的 MnCl2、在第一天、第三天以及第七天，短期內的反應變化，來評估視覺是否受 MnCl2 的影響，同時，也觀察這些反應對不同光源強度刺激有何差異？之後，再以同樣的處理方式，利用免疫組織染色的方式來分析，眼球周邊注射不同濃度的 MnCl2，是否會引起視網膜結構的改變，並引起細胞的凋亡路徑的發生。由於 ERG 是因為視網膜細胞的反應所引起，組織切片結果可用於說明 ERG 的反應。. (一) MnCl2對於ICR小鼠ERG之影響就整體分析來看，圖3.1為注射不同濃度的MnCl2後於第一天、第三天、第七天，在低強度(low luminous intensity : L)及高強度(high luminous intensity : H)光源刺激下，所記錄到的視網膜電位(ERG)的反應。結果顯示在注射saline的情況（對照）下，無論視注射後第一天（圖3.1A）或第三天(圖3.1D)及第七天(圖3.1G)，低強度與高強度光源刺激都會引起視網膜電位反應，先出現向下的負向波，也就是awave，緊接著是向上的正向波，也就是b-wave，不過，低強度光源刺激所引起的a-wave沒有高強度所引起的那麼明顯。然而在有注射 MnCl2的情況下，同樣是在第一天、第三天、第七天，低強度或高強度光源刺激所引起的視網模電位反應卻不一樣，不論濃度為40 mM MnCl2 (圖3.1B、圖3.1E、圖3.1H)或是80 mM MnCl2 (圖3.1C、圖3.1F、圖3.1I)， ERG的振幅高度反應都比對照組低，暗示MnCl2可能會抑制ERG對光刺激的反應。由於a-wave與b-wave是由視網膜不同神經 25.

(26) 細胞所引發的反應，為方便計，以下將就不同劑量MnCl2在處理後的不同天數以及不同光源強度刺激的影響，分別就其對a-wave與bwave的影響作更進一步的分析。. 1. 比較不同濃度 MnCl2 於注射後第一天、第三天、第七天對 a-wave 的影響圖 3.2A 為注射不同濃度的 MnCl2 後於第一天、第三天、第七天，給予低強度光源刺激下，對 ERG 中 a-wave amplitude 平均值的影響，為方便計算，a-wave 雖是負向波，本實驗在定量計算時，必須將之放大，且以正向值表示之，所以圖 3.2 A 才會呈現正向柱狀，以後所有圖的 a-wave 都以正向表示。結果顯示，不管是在 Control 組或是注射 40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2，都在第一天的 a-wave amplitude 反應增強，然後隨時間經過第三天與第七天，反應逐漸降低，即使第一天的 amplitude 反應增強，在統計上也沒有顯著差異。分析在低強度光源下 a-wave 的 implicit time 對 MnCl2 的反應(圖 3.2B) 就不一樣了，注射高濃度（80 mM）MnCl2 後的第一天，implicit time 不但從對照的對照的 34.00±0.63 毫秒（ms）延後到 42.0±2.7 毫秒（圖 3.2B，p<0.001），而且歷經第三天與第七天，這種延後現象明顯減弱（圖 3.2B 80 mM 的 MnCl2 不同天數的柱狀高度，p 值分別是 0.001 與 0.05），進一步比較注射後同天不同濃度的 MnCl2 對 implicit time 的影響，在第一天的時候，80 mM MnCl2 使 a-wave implicit time 不但如上述比對照延後，也比低劑量氯化錳（40 mM MnCl2）的 31.50±0.76 毫秒顯著延後(p<0.001)，而低劑量 MnCl2 對 awave 的 implicit time 並無明顯影響（p>0.05）。圖 3.2C 表示在高強度光源刺激下，注射不同濃度的 MnCl2 後於 26.

(27) 第一天、第三天、第七天，對 ERG 中 a-wave amplitude 的影響，結果顯示，只有在第三天的時候，低劑量 40 mM MnCl2 (8.16±2.37 V) （microvoltage; V）)和高劑量 80 mM MnCl2 (3.49±0.46 V) 都會引起 a-wave 振幅降低，與對照組的 14.95±3.101 V 相比較，都達到顯著水準(分別是 p=0.04 ;p<0.001)，其他第一天及第七天，雖也有降低的趨勢，可是都未達顯著差異。分析在高強度光源下，不同濃度 MnCl2 於第一天、第三天、第七天，對 a-wave implicit time 的影響(圖 3.2D)，結果顯示，不管在 control 組、注射 40 mM MnCl2 或 80 mM MnCl2，各天數的 a-wave implicit time 相比則無顯著差異，進一步比較注射後同天不同濃度的 MnCl2 的組別，各組間比較結果也並無顯著差異（圖 3.2D，p>0.05）。. 2. 比較不同濃度 MnCl2 在低強度與高強度光源刺激下，ERG 中 awave 的反應我們將進行比較的各組平均值重新規劃在一個圖，以便比較同一天的低光源與高光源刺激對 a-wave 的影響，圖 3.3 的 A 與 B 是處理後第一天的結果，C 與 D 是處理後第三天的結果，E 與 F 是處理後第七天的結果。圖 3.3A 為注射不同濃度的 MnCl2 後於第一天，給予低強度與高強度光源刺激下，對 ERG 中 a-wave amplitude 的影響。結果顯示，在 control 組、注射 40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2，低強度的光源刺激所引起的 a-wave 振幅均顯著低於高強度光源刺激所引起的反應，兩者所引起的 a-wave 振幅，分別是低強度 1.19±0.06 V 比高強度的 11.04±3.44 V（p<0.001）; 低強度的 0.83±0.22 V 比高強度的 9.84±1.21 V（p<0.001）以及的 1.92±0.84 比高強度的 27.

(28) 9.00±2.77 V（p=0.017) 。同樣也分析第一天 a-wave 的 implicit time 反應 (圖 3.3B)，結果顯示，在注射 80 mM MnCl2 這一組，因 MnCl2 引起 a-wave implicit time 延後程度，會因為高強度光源的刺激而顯著縮短，從 42.00±2.74 毫秒縮短到 36.67±2.19 毫秒（p=0.017)，這樣的明顯縮短並沒有發生於對照組與低濃度的（40 mM）MnCl2 注射 MnCl2 後第三天，無論對照組或是低濃度 MnCl2 組，高強度的光源刺激均顯著增強 a-wave 的 amplitude，增強程度都明顯高於低強度光源所引起的反應 (0.84±0.09 毫秒比 14.94±3.101 毫秒, p<0.001 ; 0.71±0.26 毫秒比 8.16±2.37 毫秒, p=0.005)，在 80 mM MnCl2 組，高強度雖也引起 a-wave 振幅增強，唯增強程度與低強度光源刺激所得結果相比，並沒有達到顯著差異，如前所述，光刺激引起 a-wave amplitude 增強會隨著 MnCl2 處理而降低，且成劑量反應，充分說明 MnCl2 會抑制 ERG 對光的反應。分析不同濃度的 MnCl2 後於第三天，ERG 中 a-wave implicit time 的反應(圖 3.3D)，顯示不論是對照組或注射 40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2，高強度或低強度光源的刺激對 a-wave implicit 的影響都沒有明顯的差異。圖 3.3E 是注射不同濃度的 MnCl2 後第七天，在對照組、注射 40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2 組，低強度的光源刺激所引起 a-wave amplitude 增強程度都遠低於高強度光源所引起的反應，這兩種刺激所引起的 a-wave amplitude 反應比，分別是 0.47±0.21 V vs. 8.63±0.23 V （p<0.001）; 0.60±0.20 V vs.5.37±0.78 V. (p<0.001) 以及. 0.70±0.19 V vs.7 10±1.24 V（p<0.001)。至於第七天的 a-wave implicit time 反應，無論是對照組或注射 40 28.

(29) mM MnCl2 及 80 mM MnCl2 組，高強度或低強度光源的刺激雖然都使 a-wave implicit time 延後，但是這兩種刺激在統計上並沒有差異。. 3. 比較不同濃度 MnCl2 於注射後第一天、第三天、第七天，對 bwave 的影響圖 3.4A 為注射不同濃度的 MnCl2 後於第一天、第三天、第七天，給予低強度光源刺激下，對 ERG 中 b-wave amplitude 平均值的影響。結果顯示，對照組，低強度光源刺激會引起 b-wave 振幅從第一天的 151.99±8.80 V 增加到第三天的 210.52±24.41 V（圖 3.4A，p<0.01），在第七天時，低強度光源刺激會促使振幅提升到的 207.53±9.30 V （圖 3.4A，p<0.01）。光源刺激對 b-wave 的增強效應，會因為 MnCl2 的作用而降低，在第一天時，低濃度(40 mM) MnCl2 會使得 b-wave 振幅從對照組的 151.99±8.80 V 明顯降到 106.01±2.02 V （p<0.05），高濃度（80 mM）MnCl2 的作用更使之降到 61.30±6.25 V (p<0.001)。比較 MnCl2 在第三天的影響，低濃度（40 mM）會促使 b-wave 的振幅從對照的 210.52±24.41 V 降到 99.05±9.44 V（p<0.001），高濃度（80 Mm）則 MnCl2 更進一步降低到 90.96±7.27 V (p<0.001)，而高與低 MnCl2 所引起的降低（抑制）效應並無顯著差異（p>0.05）。最後比較第七天的影響，低濃度與高濃度 MnCl2 抑制 b-wave 振幅，從對照的 207.53±9.30 V 分別降到 112.04±11.95 V 與 73.09±7.80 V(p<0.001; p<0.001)，有趣的是，低濃度 MnCl2 的降幅 (112.04±11.95 V) 與濃度 MnCl2 的降幅 (73.09±7.80) 之間有明顯差異 (p<0.045)。總而言之，MnCl2 確實會明顯抑制 ERG 的 b-wave 振幅。接著來分析 ERG 中 b-wave implicit time 的反應 (圖 3.4B)，而注 29.

(30) 射高濃度氯化錳之後第一天，會促使 implicit time 明顯延長（或延後），從對照組的 86.6±4.06 毫秒延長到 119.00±12.50 毫秒（p<0.001），這種延長效應卻隨著時間而衰減，所以，在注射後的第三天與第七天，明顯降回到與第一天幾乎相同。注射低濃度 MnCl2 對 b-wave 的 implicit time 的影響，沒有呈現這種先延長後又衰弱的反應現象，圖 3.4C 是注射不同濃度的氯化錳 MnCl2 後於第一天、第三天、第七天，給予高強度光源刺激下，對 ERG 中 b-wave amplitude 的影響。高強度光源刺激會促使 b-wave 振幅增強，從對照的 117.82±12.30 V（第一天）增強到第三天的 155.26±16.81 V （p=0.002）以及第七天的 147.79±9.53 V (p=0.004)，這種增強效應會因為 MnCl2 的作用而明顯降低，低濃度（40 mM） MnCl2 使 b-wave 振幅從對照的 117.82±12.30 V 降到 63.94±5.06 V（p＝0.012），高濃度（80 mM） MnCl2 促使降到 56.04±11.64 V，p=0.041)，比較第三天的抑制（降低）效應，低濃度 MnCl2 使振幅從對照的 155.26±16.81 ) V 降到 59.90±7.28 V（p<0.001），而高濃度（80 Mm）的 MnCl2 則是降到 59.29±4.21 V (p<0.001)，比較第七天，無論低或高濃度的氯化錳也都會促使 b-wave 的振幅降低，分別從對照的 147.79±9.53. V. 降到. 76.39±8.24. V. 與. 49.54±3.109. V. (p<0.001 ;p<0.001)。所以，在高強度光源之下，MnCl2 仍然會明顯地抑制 b-wave 的振幅。在這樣的實驗條件下，ERG 中 b-wave implicit time 的反應(圖 3.4D) 又如何？高濃度（80 mM） MnCl2 在第一天的 b-wave implicit time (76.67±3.103 毫秒)雖比對照稍有延後，但是並不顯著（p>0.05），然而，卻在第七天明顯降低（圖 3.4D 的 80 mM 組），這樣的反應變化 30.

(31) 與前述低強度光源相似。除此之外，整體 implicit time 的反應並沒有太大的明顯變化。. 4. 比較不同濃度 MnCl2 在低強度與高強度光源刺激下，ERG 中 bwave 的反應結果顯示，在 control 組，低強度的光源刺激所引起的 b-wave amplitude 是 151.99±8.80 V，顯著高於高強度光源刺激所引起的 117.82±12.30 V（p=0.005）; 在注射 40 mM MnCl2 這一組，低光源刺激引起 b-wave 振幅是 106.01±2.02 V，也顯著高於高光源刺激所引起的 63.94±5.0570 V（p<0.001)；不過，在高濃度 MnCl2 這一組，低光源與高光源刺激就沒有這樣的差異。在同樣的實驗條件下，第一天 b-wave implicit time 的反應平均值是圖 3.5B，除前述高濃度 MnCl2 引起 b-wave 明顯延後之外，有趣的是，在 control、注射 40 mM MnCl2 或 80 mM MnCl2 三組中，低強度光源刺激所引起的 b-wave implicit time 延後程度，都比高強度光源所得明顯高，分別是 86.60±4.06 毫秒 vs. 73.20±1.32 毫秒（p=0.021）、 77.00±2.07 毫秒 vs. 65.67±1.45 毫秒（p=0.031）以及 119.00±12.50 毫秒 vs. 76.67±3.103 毫秒（p<0.001) 。圖 3.5C 是注射不同濃度的 MnCl2 後於第三天，比較低強度與高強度光源刺激對 ERG 中 b-wave amplitude 的影響。結果顯示，在 control 組、注射 40 mM MnCl2 組中，低強度與高強度的光源刺激，都會引起的 b-wave amplitude 增強，但僅 control 組的低強度光源刺激所引起的振幅顯著高於高強度光源刺激所得，210.52±24.41 V vs.. 31.

(32) 155.26±16.81 V（p=0.011)，其餘兩組的低強度光源所引起的 amplitude 雖然較高，但未達顯著水準（p>0.05）。比較同強度光源刺激下，不同濃度上 b-wave amplitude 的差異，則如前述 amplitude 隨 MnCl2 濃度而降低。比較第三天 ERG 中的 b-wave implicit time (圖 3.5-D)的反應，在 control、注射 40 mM MnCl2 和 80 mM MnCl2 三組，與第一天相同，低強度的光源刺激引起的 b-wave implicit time 延長程度都明顯大於高強度光源所得之結果，分別是： 101.60±7.26 毫秒 vs. 73.00±4.04 毫秒（p<0.001）、91.25±5.50 毫秒 vs. 70.00±0.82 毫秒（p=0.005 ）以及 91.20±3.94 毫秒 vs. 70.40±1.0 毫秒（p=0.003) 。圖 3.5E 是注射不同濃度的 MnCl2 後於第七天，給予低強度與高強度光源刺激下，對 ERG 中 b-wave amplitude 的影響。與第一天一樣，在 control 組與注射 40 mM MnCl2 組中的 b-wave amplitude，低強度的光源刺激所引起的振幅都顯著較高於高強度光源刺激所引起的結果，分別是：207.53±9.30 V vs. 147.79±9.53 V（p<0.001）以及; 112.04±11.95 V vs. 76.39±8.24 V（p=0.001)，在高強度 MnCl2 這一組，低光強度原刺激所也引起較高的 b-wave 振幅，唯與高強度光源刺激所得相比，並不顯著(p>0.05)。同樣地分析 ERG 中的 b-wave implicit time (圖 3.5F)的反應，在 control、注射 40 mM MnCl2 和 80 mM MnCl2 三組，低強度的光源刺激引起 b-wave implicit time 延後程度都明顯大於高強度光源之所得，分別是 101.6000±7.26 毫秒 vs. 73.00±4.04 毫秒 (p<0.001 )、91.25±5.50 毫秒 vs. 70.00±0.82 毫秒 (p<0.001) 以及 91.20±3.94 毫秒 vs. 70.40±1.03 毫秒(p<0.001) 。 32.

(33) (二) H&E染色及ChAT與TNF-α免疫螢光染色結果在 ERG 實驗完成後，立即將眼球取下，進行 H&E 染色及免疫螢光染色，觀察查視網膜在經過氯化錳處理過後的變化。. 1. H&E 染色 H&E染色（hematoxylin and eosin stain、HE stain）主要用來觀察組織結構。染色後，在顯微鏡（200倍）下觀察，可觀察到視網膜由外向內可區分為感光層(photoreceptor layer, IS)、外核層（outer nuclear layer; ONL）、內核層(inner nuclear layer ,INL) 以及神經節細胞層(ganglion cell layer ,GCL)(圖3.6)。先觀察注射後第一天實驗小鼠的眼球視網膜切片，經注射40 mM MnCl2後(圖3.6-D-1)，視網膜切片的 IS層出現萎縮與混融的型態改變(箭頭標示處)，神經節細胞層(ganglion cell layer ,GCL)出現細胞核萎縮(箭頭標示處)，經注射80 mM MnCl2的視網膜(圖3.6-F-1)，感光層(photoreceptor layer ,IS)除型態萎縮跟混雜外，分層的型態完全消失(箭頭標示處)，在內核層(inner nuclear layer ,INL)，細胞減少造成空洞的跡象(箭頭標示處)，GCL層除了有細胞核萎縮的現象外，細胞減少 (箭頭標示處)。第三天小鼠的眼球，同樣在200倍的觀察下，control組組織型態上並沒有發生改變，注射40 mM MnCl2(圖3.6-D-3)的視網膜，IS層出現與第一天相同的萎縮與混融等型態改變(箭頭標示處)，GCL層則出現細胞核萎縮的現象 (箭頭標示處)；注射80 mM MnCl2 (圖3.6-F-3)的視網膜，IS層除型態有萎縮跟不規則外，分層的型態也完全消失(箭頭標示處)，ONL層出現了細胞不規則的跡象(箭頭標示處)，GCL層除了有細胞核萎縮的現象，部分區域細胞減少，導致出現空泡的現象(箭頭標示處)。第七 33.

(34) 天小鼠的眼球，control組在第七天，組織型態上並沒有發生改變，注射40 mM MnCl2組的視網膜(圖3.6-D-7)，IS層出現與第一天及第三相同的萎縮跟混融等型態改變(箭頭標示處)，GCL層出現細胞核萎縮的現象，還有空泡產生(箭頭標示處)，注射80 mM MnCl2的視網膜 (圖3.6-F-7)，IS層在型態上更加嚴重萎縮，而在ONL層上，沒有出現細胞不規則增生的跡象，GCL層有細胞核萎縮現象，部分區域出現細胞減少致出現空泡 (箭頭標示處)。. 2. ChAT 免疫螢光染色 ChAT-免疫螢光染色，是要染視網膜上的膽鹼乙醯轉化酵素 (choline acetyltransferase ,ChAT；綠)，而 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole；藍)是染所有神經細胞的核。ChAT 染的是內層視網膜(inner retina)的無軸突細胞(amacrine cell)(Pang et al., 2013)，藍色 DAPI 則是染所有細胞的細胞核，在同一切片上使用這兩種方法，在 merge 之後，可以確定 ChAT 的位置。如圖 3.7 可見，觀察注射後第一天實驗小鼠的眼球視網膜切片，control 組的視網膜可以看到 ChAT (amacrine cell 指標，圖 3.7-A-1)以及免疫螢光呈現兩條藍色的帶狀(圖 3.7B-1、圖 3.7-C-1)，在注射 40 mM MnCl2 組的視網膜上(圖 3.7-D-1、圖 3.7-E-1、圖 3.7-F-1)，綠色 ChAT 與兩條藍色帶狀依然表現，在注射 80 mM MnCl2 組的視網膜上(圖 3.7-G-1、圖 3.7-H-1、圖 3.7-I-1)中，仍可看到綠色 ChAT 與兩條藍色帶狀。注射後第三天，control 組(圖 3.7-A-3、圖 3.7-B-3、圖 3.7-C-3)的視網膜，仍可以看到 ChAT 免疫螢光表現以及兩條藍色的帶狀，同樣地，在經過注射 40 mM MnCl2 組 (圖 3.7-D-3、圖 3.7-E-3、圖 3.7-F-3) 和 80 mM MnCl2 組(圖 3.7-G-3、圖 3.7-H-3、圖 3.7-I-3)這兩組中，綠色 ChAT 與兩條綠色帶狀依然表 34.

(35) 現，分布於 INL 層和 GCL 層之間。注射後第七天的 control 組(圖 3.7A-7、圖 3.7-B-7、圖 3.7-C-7)與經過注射 40 mM MnCl2 組(圖 3.7-D-7、圖 3.7-E-7、圖 3.7-F-7) 和 80 mM MnCl2 組(圖 3.7-G-7、圖 3.7-H-7、圖 3.7-I-7)別中的視網膜仍可以看到 ChAT 免疫螢光表現兩條藍色的帶狀分布於 INL 層和 GCL 層之間。. 3.TNF-α 免疫螢光染色腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor α , TNF-α ；免營疫光染色後呈現紅色) 和DAPI進行染色，TNF-α是由巨噬細胞所分泌的一種細胞激素（cytokine），它可以藉由趨化作用引導嗜中性白血球移向感染處，意即組織若出現發炎反應，則TNF-α這種激素就會大量表現(Lin et al., 2007)。結果由圖3.8顯示，在實驗後第一天不管是control組或是注射40 mM MnCl2及80 mM MnCl2組的視網膜，都有TNF-α表現，其中control組(圖3.8-A-1、圖3.8-B-1、圖3.8-C-1)的TNF-α表現在INL 層及GCL層，注射40 mM MnCl2組的視網膜(圖3.8-D-1、圖3.8-E-1、圖3.8-F-1)中同樣也有TNF-表現在INL層及GCL層，此外，在外核層(outer nuclear layer ,ONL)也有表現，經80 mM MnCl2處理的白鼠視網膜(圖3.8-G-1、圖3.8-H-1、圖3.8-I-1)中，也是ONL層、INL層以及 GCL層都有表現。接著觀察注射後第三天TNF-α在視網膜上的表現，顯示在實驗後不管是control組(圖3.8-A-3、圖3.8-B-3、圖3.8-C-3)或是注射40 mM MnCl2組的視網膜(圖3.8-D-3、圖3.8-E-3、圖3.8-F-3)中，各層中都沒有表現，而注射80 mM MnCl2組的視網膜(圖3.8-G-3、圖 3.8-H-3、圖3.8-I-3)中，INL層、ONL層與GCL層，都有表現。最後觀察注射後第七天TNF-α在視網膜上表現的情況，結果顯示，在 control組(圖3.8-A-7、圖3.8-B-7、圖3.8-C-7)的各層中都沒有表現， 35.

(36) 而在注射40 mM MnCl2組 (圖3.8-D-7、圖3.8-E-7、圖3.8-F-7)與注射 80 mM MnCl2組的視網膜(圖3.8-G-3、圖3.8-H-3、圖3.8-I-3)中， INL 層、ONL層及GCL層，都有表現。. (三) Apoptosis細胞凋亡因子免疫螢光染色結果接著我們再進一步以Apoptosis細胞凋亡因子之抗體，進行免疫螢光染色來觀察視網膜上是否經過注射處理後一天會有凋亡因子的表現，主要以 Cleaved Caspase-9 、 Cleaved Caspase-3 、 Cleaved Caspase PARP、Bax、Bcl-2為標定對象來進行觀察。前述（前言內文）Bcl-2和Bax作用於粒線體上，它們參與調控一些與凋亡有關的細胞現象，Bax是一種促凋亡蛋白，當Bax在細胞中表現上升時，暗示該細胞可能將會細胞凋亡。Bax可以形成聚合體，然後從細胞質中轉移到粒線體膜上，通過和粒線體膜上的相互作用，增強粒線體的通透性(Wei et al. 2001)，最後導致cytochrome c釋放，活化caspase-9 (Li et al. 1997)，進而造成後續的caspase-3活化，然而caspase-3則會降解PARP，抑制DNA的修復能力，最終使細胞凋亡(Cohen 1997)。此外，Bax可以和Bcl-2形成多聚體，來調節粒線體膜的通透性，抑制 cytochrome c從粒線體釋放到細胞質中(Murphy et al. 2000)。因此，當細胞死亡走向apoptosis時，這些路徑因子將會發生表現。. 1. Cleaved Caspase-9 免疫螢光染色我們先觀察Cleaved Caspase-9在視網膜中的表現，由圖3.9所示，染色結果所呈現的紅色是Cleaved Caspase-9的訊號，藍色則是DAPI。結果顯示，注射後第一天，在control組 (圖3.9-A-1、圖3.9-B-1、圖 3.9-C-1)，GCL層有Cleaved Caspase-9表現，而在注射40 mM MnCl2 36.

(37) 組(圖3.9-D-1、圖3.9-E-1、圖3.9-F-1)中，除了GCL層有表現外，在 INL層也表現，觀察注射80 mM MnCl2組(圖3.9-G-1、圖3.9-H-1、圖 3.9-I-1)，發現ONL層、INL層、GCL層都有表現。觀察注射後第三天，control組(圖3.9-A-3、圖3.9-B-3、圖3.9-C-3)，並沒有Cleaved Caspase-9的表現，而注射40 mM MnCl2 組的視網膜(圖3.9-D-3、圖 3.9-E-3、圖3.9-F-3)，除GCL層有表現外，在INL層也有表現，注射 80 mM MnCl2組的視網膜(圖3.9-G-3、圖3.9-H-3、圖3.9-I-3)，其ONL 層、INL層以及GCL層都有表現。最後觀察注射後第七天，在control 組(圖3.9-A-7、圖3.9-B-7、圖3.9-C-7)，各層都沒有Cleaved Caspase-9 表現，而在注射40 mM MnCl2組的視網膜(圖3.9-D-7、圖3.9-E-7、圖 3.9-F-7)中，除了GCL層有表現外，在INL層和ONL層也表現的情況，觀察注射80 mM MnCl2組的視網膜(圖3.9-G-7、圖3.9-H-7、圖3.9-I-7)，發現ONL層、INL層、GCL層都有表現。. 2. Cleaved Caspase-3 免疫螢光染色接著觀察 Cleaved Caspase-3 在視網膜的表現(圖 3.10)，圖中的紅色為 Cleaved Caspase-3 的訊號，藍色則是 DAPI，結果顯示，在注射後第一天 control 組(圖 3.10-A-1、圖 3.10-B-1、圖 3.10-C-1)及注射 40 mM MnCl2 組(圖 3.10-D-1、圖 3.10-E-1、圖 3.10-F-1)中，Cleaved Caspase-3 主要集中表現在 GCL 層上，而在注射 80 mM MnCl2 組(圖 3.10-G-1、圖 3.10-H-1、圖 3.10-I-1)中，則是在 GCL 層、INL 層和 ONL 層都有表現。觀察注射後第三天，在 control 組(圖 3.10-A-3、圖 3.10-B-3、圖 3.10-C-3)，視網膜各層中並沒有 Cleaved Caspase-3 表現，在注射 40 mM MnCl2 組(圖 3.10-D-3、圖 3.10-E-3、圖 3.10-F-3)的視網膜中，Cleaved Caspase-3 主要集中表現在 GCL 層和 INL 層上，而 37.

(38) 在注射 80 mM MnCl2 組(圖 3.10-G-3、圖 3.10-H-3、圖 3.10-I-3)的視網膜中，則是在 GCL 層、INL 層和 ONL 層都有表現。最後觀察注射後第七天結果顯示，在 control 組(圖 3.10-A-7、圖 3.10-B-7、圖 3.10C-7)中，視網膜各層組織並沒有 Cleaved Caspase-3 的表現，在注射 40 mM MnCl2 組(圖 3.10-D-7、圖 3.10-E-7、圖 3.10-F-7)中，Cleaved Caspase-3 表現在 GCL 層和 ONL 層以及 INL 層上，而在注射 80 mM MnCl2 組(圖 3.10-G-7、圖 3.10-H-7、圖 3.10-I-7)中，則是在 GCL 層、 INL 層和 ONL 層都有出現 Cleaved Caspase-3 的訊號。. 3. Cleaved PARP 免疫螢光染色 Cleaved PARP 在視網膜上表現顯示於圖 3.11，圖中的紅色是 Cleaved PARP的訊號，藍色則是DAPI，在注射後第一天結果發現 Control組(圖3.11-A-1、圖3.11-B-1、圖3.11-C-1)與注射40 mM MnCl2 組(圖3.11-D-1、圖3.11-E-1、圖3.11-F-1)， Cleaved PARP並沒有表現，然而 80 mM MnCl2 組 ( 圖 3.11-G-1 、圖 3.11-H-1 、圖 3.11-I-1) 中， Cleaved PARP的表現除GCL層外，ONL層及INL層均有表現。觀察注射後第三天，在control組(圖3.11-A-3、圖3.11-B-3、圖3.11-C-3)和注射40 mM MnCl2組(圖3.11-D-3、圖3.11-E-3、圖3.11-F-3)中，視網膜各層組織並沒有Cleaved PARP的表現，但在注射80 mM MnCl2組 (圖3.11-G-3、圖3.11-H-3、圖3.11-I-3)的視網膜中，Cleaved PARP在 GCL層呈現大量表現。Cleaved PAR在注射後第七天，發現在control 組(圖3.11-A-7、圖3.11-B-7、圖3.11-C-7)中，視網膜各層組織並沒有 Cleaved PARP的表現，而在注射40 mM MnCl2 組(圖3.11-D-7、圖 3.11-E-7、圖3.11-F-7)和注射80 mM MnCl2組(圖3.11-G-7、圖3.11-H7、圖3.11-I-7)的視網膜中，在GCL層、INL層和ONL層都有Cleaved 38.

(39) PARP的表現。. 4. Bax 免疫螢光染色由於我們觀察到 Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase PARP，在注射實驗後第一天、第三天、第七天的視網膜組織免疫染色中有表現，為確定細胞凋亡確實在進行，及評估細胞凋亡訊息是否來自粒線體的影響，故進一步觀察 Bax 和 Bcl-2 在視網膜的表現。在Bax的染色中顯示，紅色是Bax的訊號，藍色是DAPI，觀察注射後第一天，結果顯示在control組(圖3.12-A-1、圖3.12-B-1、圖3.12C-1)，GCL層有Bax表現，而在注射40 mM MnCl2組(圖3.12-D-1、圖 3.12-E-1、圖3.12-F-1)中，除了GCL層有表現外，在INL層也有表現，在注射80 mM MnCl2組的視網膜中(圖3.12-G-1、圖3.12-H-1、圖3.12I-1)，則顯示在ONL層、INL層、GCL層都有表現。在注射第三天中， control組的視網膜(圖3.12-A-3、圖3.12-B-3、圖3.12-C-3)，GCL層有 Bax表現，而在注射40 mM MnCl2組的視網膜(圖3.12-D-3、圖3.12-E3、圖3.12-F-3)中，除了GCL層有表現外，ONL層和INL層也有表現，在注射80 mM MnCl2組的視網膜中(圖3.12-G-3、圖3.12-H-3、圖3.12I-3)，顯示在ONL、INL與GCL三層都有表現。最後觀察注射後第七天，在control組(圖3.12-A-7、圖3.12-B-7、圖3.12-C-7)，各層都沒有有Bax表現，而在注射40 mM MnCl2組視網膜(圖3.12-D-7、圖3.12-E7、圖3.12-F-7)中，除了GCL層有表現外，在ONL層和INL層也有表現，在注射80 mM MnCl2 組視網膜中(圖3.12-G-7、圖3.12-H-7、圖 3.12-I-7)，顯示在ONL層、INL層、GCL層都有表現。 39.

(40) 5. Bcl-2 免疫螢光染色比較Bcl-2在視網膜中的表現 (紅色為Bcl-2的訊號，藍色則是 DAPI)，圖6.12顯示，在注射後第一天中，control組、注射40 mM MnCl2組以及注射80 mM MnCl2組的視網膜，Bcl-2訊號在視網膜分布的情形與Bax表現的位置雷同，control組(圖3.13-A-1、圖3.13-B-1、圖3.13-C-1)，GCL層有Bcl-2的表現，而注射40 mM MnCl2組(圖3.13D-1、圖3.13-E-1 、圖3.13-F-1)中，在GCL層表現，在注射 80 mM MnCl2 組中(圖3.13-G-1、圖3.13-H-1、圖3.13-I-1)，顯示在ONL層、 INL層、GCL層都有表現。比較注射後第三天，Bcl-2在視網膜中的表現，顯示control組的視網膜(圖3.13-A-3、圖3.13-B-3、圖3.13-C-3) 中，GCL層、INL層及ONL層有Bcl-2表現，而注射40 mM MnCl2組 (圖3.13-D-3、圖3.13-E-3、圖3.13-F-3)與80 mM MnCl2組的視網膜中 (圖3.13-G-3、圖3.13-H-3、圖3.13-I-3)，除GCL層和INL層有表現之外， ONL層也都有表現。最後觀察Bcl-2於注射後第七天在視網膜的表現，結果顯示，control組(圖3.13-G-7、圖3.13-H-7、圖3.13-I-7)，各層都沒有Bcl-2表現，而注射40 mM MnCl2組(圖3.13-G-7、圖3.13H-7、圖3.13-I-7)中，在GCL層、ONL層和INL層有表現，接著在注射80 mM MnCl2組中(圖3.13-G-7、圖3.13-H-7、圖3.13-I-7)，則顯示在ONL層、INL層、GCL層也都有表現。. 40.

(41) 四、討論本研究最重要的發現是：（1）MnCl2 會抑制視網膜電位 a-wave 與 b-wave 的 amplitude，並延後波形的 implicit time；（2）低強度與高強度光源照射視網膜所引起的視網膜電位 a-wave 與 b-wave 的 amplitude 增強也會因為 MnCl2 的作用而降低；（3）MnCl2 對視網膜電為的影響可能是由於 MnCl2 引起視網膜神經細胞病變，由於 TNF、caspase 系統以及 Bax 與 Bcl2 在視網膜的表現，MnCl2 的影響可能與神經細胞發炎與凋亡有關。. (一) 將 MnCl2 以 subconjunctival injection 方式，注射至眼球周邊，造成視網膜的 ERG 與組織構造發生改變是一項實驗技術視網膜是位於眼球後壁內面一層非常薄組織，它在眼睛裡面的功能，是負責將光轉化為神經信號的部分，透過 ERG 這種測量視網膜內細胞對光刺激後的總電反應，進一步評估視網膜上各層細胞功能是否正常或發生變化(Gotch 1903; Oakley et al. 1977)。眼前房 (intracameral)注射 MnCl2，為現在研究 MnCl2 對於視覺系統影響，所普遍採用的實驗方法，且 intracameral injection 注射藥物的方式，將會造成眼壓升高與恢復期相較於 subconjunctival injection 較為長的兩個問題，因此，intracameral injection 會難以釐清短期內注射藥物進入眼球造成視網膜功能變化或形態上改變的問題來源，故我們使用 subconjunctival injection 的方式，探討注射不同濃度的 MnCl2 後第一天、第三天以及第七天，短期內對視網膜功能和型態以及細胞生理路徑上的影響。. 41.