比較Bcl-2在視網膜中的表現 (紅色為Bcl-2的訊號，藍色則是 DAPI)，圖6.12顯示，在注射後第一天中，control組、注射40 mM MnCl2組以及注射80 mM MnCl2組的視網膜，Bcl-2訊號在視網膜分布 的情形與Bax表現的位置雷同，control組(圖3.13-A-1、圖3.13-B-1、
圖3.13-C-1)，GCL層有Bcl-2的表現，而注射40 mM MnCl2 組(圖3.13-D-1 、圖 3.13-E-1 、圖 3.13-F-1) 中， 在GCL層 表 現， 在 注射 80 mM MnCl2組中(圖3.13-G-1、圖3.13-H-1、圖3.13-I-1)，顯示在ONL層、
INL層、GCL層都有表現。比較注射後第三天，Bcl-2在視網膜中的 表現，顯示control組的視網膜(圖3.13-A-3、圖3.13-B-3、圖3.13-C-3) 中，GCL層、INL層及ONL層有Bcl-2表現，而注射40 mM MnCl2組 (圖3.13-D-3、圖3.13-E-3、圖3.13-F-3)與80 mM MnCl2組的視網膜中 (圖3.13-G-3、圖3.13-H-3、圖3.13-I-3)，除GCL層和INL層有表現之 外， ONL層也都有表現。最後觀察Bcl-2於注射後第七天在視網膜的 表現，結果顯示，control組(圖3.13-G-7、圖3.13-H-7、圖3.13-I-7)，
各層都沒有Bcl-2表現，而注射40 mM MnCl2 組(圖3.13-G-7、圖3.13-H-7、圖3.13-I-7)中，在GCL層、ONL層和INL層有表現，接著在注 射80 mM MnCl2組中(圖3.13-G-7、圖3.13-H-7、圖3.13-I-7)，則顯示 在ONL層、INL層、GCL層也都有表現。
41
四、討論
本研究最重要的發現是：（1）MnCl2會抑制視網膜電位a-wave 與 b-wave 的 amplitude，並延後波形的 implicit time；（2）低強度與高強 度光源照射視網膜所引起的視網膜電位a-wave 與 b-wave 的 amplitude 增強也會因為MnCl2的作用而降低；（3）MnCl2對視網膜電為的影響 可能是由於MnCl2引起視網膜神經細胞病變，由於TNF、caspase系 統以及 Bax 與 Bcl2 在視網膜的表現，MnCl2的影響可能與神經細胞 發炎與凋亡有關。
(一) 將 MnCl
2以 subconjunctival injection 方式，注射至眼球周邊，
造成視網膜的
ERG 與組織構造發生改變是一項實驗技術
視網膜是位於眼球後壁內面一層非常薄組織，它在眼睛裡面的 功能，是負責將光轉化為神經信號的部分，透過 ERG 這種測量視網 膜內細胞對光刺激後的總電反應，進一步評估視網膜上各層細胞功 能是否正常或發生變化(Gotch 1903; Oakley et al. 1977)。眼前房 (intra-cameral)注射 MnCl2，為現在研究 MnCl2對於視覺系統影響，所普遍 採用的實驗方法，且 intracameral injection 注射藥物的方式，將會造 成眼壓升高與恢復期相較於subconjunctival injection 較為長的兩個問 題，因此，intracameral injection 會難以釐清短期內注射藥物進入眼 球 造 成 視 網膜 功能 變 化 或 形態 上改 變 的 問 題來 源， 故 我 們 使用 subconjunctival injection 的方式，探討注射不同濃度的 MnCl2後第一 天、第三天以及第七天，短期內對視網膜功能和型態以及細胞生理 路徑上的影響。
42
首先，我們先釐清 subconjunctival injection 的給藥方式是否會造 成眼壓升高，故使用膽鹼乙醯轉化酵素 (choline acetyltransferase，
ChAT) 來進行評估實驗，ChAT 通常存在於視網膜層無軸突細胞。而 無軸突細胞位於視網膜內叢狀層 (inner plaxiform layer，IPL) 及少數 位於神經節細胞層，且擁有神經纖維排列特殊的雙帶狀結構，故常 常被用來做為視網膜內層組織完整性的指標之一 (Osborne et al., 2004)。Osborne 在 1999 年的文章中提到，高眼壓傷害容易傷害到視 網膜內層的細胞，造成ChAT 在視網膜內叢狀層表現消失。在免疫螢 光染色的實驗結果中，注射Saline、40 mM MnCl2及80mM MnCl2在 第一、三、七天均都有表現，暗示subconjunctival injection 的實驗並 不會造成過高的眼壓。
(二) MnCl
2可能藉由損傷感光細胞而引起視網膜a-wave 高度降低
綜合本次研究結果在 ERG 波形中發現，於 a-wave 的變化上，在 低強度光源刺激下所得到的 a-wave amplitude，不管在注射 saline、或注射 40 mM MnCl2及80 mM MnCl2上， 在第一天、第三天及第七 天都沒有差異；但在高強度光源刺激下，只有在注射後第三天的組 別，隨著注射濃度上升而明顯降低（圖3.2C），再以高、低強度光源 刺激下合併進行探討，結果也顯示注射不同濃度 MnCl2對於低光源 刺激下所產生a-wave amplitude 並不會有明顯的影響（圖 3.3 ACE），
事實上，低強度光源刺激下所引起的 a-wave amplitude 並沒有受 MnCl2的抑制（圖 3.2 A）。與 2003 年 Zhang 等人所得結果相比較，
他們是在藍耳兔眼內注射0.025 mL 的 10-40 mM MnCl2在七天時並沒 有引起a-wave amplitude 的明顯改變，就這一點來看，本研究所得結
43
果與她們是相似，不過，她們們的注射方法是 intracameral injection，
本研究是用 subconjunctival injection，經由換算，本研究所用劑量約
為她們的四倍，然而，不論是在第一、三、七天，都沒有造成
a-wave amplitude 的改變，從這樣的結果推論，不論是 intracameral in-jection 或是 subconjunctival inin-jection，所得結果顯示這樣的 MnCl2濃 度對視網膜 a-wave 可能不會引起明顯的影響。本實驗與 Zhang 等人 不同的是，我們又探索高強度光線刺激對 a-wave 的影響，發現注射 MnCl2之後第三天與第七天， a-wave amplitude 顯著降低（圖 3.2C）。
低光源強度相當於傍晚的光照強度，而高光源強度相當於白天的光 照強度，從這樣的角度來看，受 MnCl2中毒的人，其視覺在夜晚雖 然可能不受影響，但是白天視覺很可能受到影響。a-wave amplitude 主要由 ONL 層的感光細胞群所產生，而感光細胞群的感光區則位於 IS 層，感光細胞群有兩種，即桿狀細胞及錐狀細胞，其中的桿狀細 胞主要是負責傍晚或夜間的刺激，錐狀細胞是負責感受高強度光源 的刺激如白天(Armington 1974; Heckenlively and Arden 2006)，可惜的 是，H&E 染色技術無法區分桿狀細胞與錐狀細胞，不過，我們不能 排除一個可能性，那就是 MnCl2對錐狀細胞影響可能大於桿狀細胞。
組織切片在注射 40 mM MnCl2後第三天及第七天都出現 IS 層的 細胞損傷、且分層結構幾乎無法分辨，在注射 80 mM MnCl2這一組，
在注射後第一、三、七天也出現 IS 層嚴重的分層結構無法分辨，甚 至萎縮等以及不規則增生的現象，所謂不規則增生是指 IS 層的細胞 向其他層突出。在組織免疫染色結果發現(圖 3.14)，在 40 mM MnCl2
這一組的視網膜 ONL 層在注射後第一天，都沒有 Cleaved Caspase-9、
Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 等凋亡因子表現，然而，TNF-α 僅
44
表現於注射後第一天有表現於，但在注射後第三天沒有表現，但 Cleaved Caspase-9 有 表 現 ， 到 了 注 射 後 第 七 天 ， 不 但 Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP 有表現，TNF-α 也有表現，故視網膜在受 到 MnCl2 作用後，在注射後第三天與第注射後第七天這段時間，IS 層的細胞核（ONL 層是 IS 層感光細胞的細胞核）不僅發炎且發生凋 亡，但在第一天所出現的發炎現象，卻與 Wu 等人（2012）使用 subconjunctival injection 方式注射藥物、造成注射後前三天內發炎的 反應相符，暗示第一天的發炎可能僅和subconjunctival injection 方法 引起有關，但是第七天發炎才可能是由低濃度 MnCl2本身引起。 在 Bax 和 Bcl-2 的免疫染色結果， 40 mM MnCl2組的視網膜ONL 層上，
Bcl-2 是在注射後第三天才開始有表現，在注射後第七天這種表現量 還有上升的趨勢，而 Bax 在第三天、第七天有表現，感光細胞的粒 線體部分也有可能首先受到低濃度MnCl2的影響，造成 Bcl-2 到第三 天才該區開始有表現。在注射80 mM MnCl2的視網膜，ONL 層在第 一天就有 TNF-α、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3 表現，到第 三天及第七天，除了 TNF-α、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3 在該層都有表現外，還有 Cleaved PARP 的表現，這樣的結果表示高 濃度 MnCl2處理組，第一天發炎有可能是因為注射或 MnCl2引起，
但是到第三天與第七天，就可能是單純由 MnCl2本身所引起，造成 感光細胞發生凋亡。根據前述推論，MnCl2對錐狀細胞的影響可能 大於桿狀細胞，如果這樣的推論正確，那麼，細胞凋亡極有可能發 生在錐狀細胞，如果是這樣，就可以說明為何隨著 MnCl2濃度提升，
對ERG a-wave 振幅的抑制效應愈高（圖 3.2C），唯對於高濃度 MnCl2
在第七天為何沒有明顯的抑制效應，卻無法有個合理的解釋，不過，
45
就過去的研究報告指出，視網膜感光細胞受損後，ONL 層的膠質纖 維酸性蛋白(GFAP)含量升高，而鹼性纖維生長因子(bFGF)下降，表 示視網膜感光細胞變性壞死與GFAP 和 bFGF 的比值降低有關，此時 Müller 細胞（視網膜的神經膠細胞）會受到 GFAP 及 bFGF 的比值降 低而啟動增殖 Muller 細胞上 bFGF 受體，以抑制視網膜感光細胞的 凋亡程度並同時促使其修復(Cao et al. 2001)。本研究所得結果中，有 關查到 ONL 層的細胞有類似增生現象，我懷疑視網膜的 ONL 層可 能有修復現象，使得高濃度MnCl2在第七天對a-wave amplitude 的抑 制作用不顯著（圖3.2C，白色柱狀）。又 80 mMMnCl2 這一組的視網 膜的ONL 層，Bax 及 bcl-2 在第一天、第三天及第七天都有表現，更 說明感光細胞可能發凋亡。文獻上雖有注射 MnCl2影響視覺的報告，
可是卻沒有研究 MnCl2是否藉由細胞凋亡來影響視覺。然體外的實 驗報告也明確指出，將MnCl2加入到人類Gli36 細胞會造成該細胞的 粒線體受損（mitochondrial dynamics impairment），進而使 Bax/Bcl-2 比值上升，活化 Caspase-9 及 Caspase-3 的這條路徑，促使細胞走向 凋亡（Agustina 等人，2013），與此相關的其他研究，也指出當視網 膜因受到藥物或疾病而造成 ERG 的 amplitude 變小時，也同時會有 Bax/bcl-2、Caspase-9 及 Caspase-3 這條路徑的活化，促使細胞傾向 apoptosis，甚至死亡(Hernandez et al. 2013; Yamauchi et al. 2011)。本 實驗採用活體小鼠，所得結果有關 MnCl2抑制視網膜電位 a-wave 振 幅，正可以彌補這方面的不足。
46
(三) MnCl
2 可能藉由損傷視網膜ONL 層上的細胞而引起視網膜 b-wave 高度降低
本研究結果顯示 ERG 的 b-wave amplitude 也會受到 MnCl2作用而 降低，不論從注射後第一天經第三，到第七天，也不論在低強度光 源或高強度光源下，這種抑制而降低的效應，在統計上都達顯著水 準（圖3.4A 與 C）。這也顯示 b-wave 與 a-wave 對 MnCl2的反應是不 一樣的。事實上，前述曾討論到 b-wave（前言）主要是由 INL 層的 Müller cell(類神經膠細胞)及兩極細胞（Bipolar cell）所形成的，是一 種正向波形。
Zhang 等人的實驗中，以 intracameral injection 注射 0.025 mL 的 15 mM MnCl2 至藍耳兔的眼球中，雖也觀察到在注射後第七天，b-wave amplitude 顯著的下降，可是他們沒有研究注射後第一天與第三 天 的 反 應， 本研究 在 注 射後 第一天 與 第 三天 ，b-wave 確會因為 MnCl2而降低，顯示不論是長時間或短時間的作用下，MnCl2都有抑 制 b-wave 的作用。從組織切片 H&E 染色結果觀察 INL 層，發現只 有在注射 80 mM MnCl2後第一天才有明顯的局部細胞減少，而在注 射後的第三天及第七天則沒有發現組織形態上的改變。為進一步瞭 解ERG 反應的可能原因，我們以免疫染色技術)，觀察視網膜是否發 生 TNF-α 與細胞凋亡等因子表現(圖 3.14，結果顯示 TNF-α 在注射 saline（對照）、40 mM MnCl2及 80 mM MnCl2後的第一天，視網膜
Zhang 等人的實驗中，以 intracameral injection 注射 0.025 mL 的 15 mM MnCl2 至藍耳兔的眼球中，雖也觀察到在注射後第七天，b-wave amplitude 顯著的下降，可是他們沒有研究注射後第一天與第三 天 的 反 應， 本研究 在 注 射後 第一天 與 第 三天 ，b-wave 確會因為 MnCl2而降低，顯示不論是長時間或短時間的作用下，MnCl2都有抑 制 b-wave 的作用。從組織切片 H&E 染色結果觀察 INL 層，發現只 有在注射 80 mM MnCl2後第一天才有明顯的局部細胞減少，而在注 射後的第三天及第七天則沒有發現組織形態上的改變。為進一步瞭 解ERG 反應的可能原因，我們以免疫染色技術)，觀察視網膜是否發 生 TNF-α 與細胞凋亡等因子表現(圖 3.14，結果顯示 TNF-α 在注射 saline（對照）、40 mM MnCl2及 80 mM MnCl2後的第一天，視網膜