第一章 緒論
二、 兒茶素萃取與分析方法之文獻回顧
Fig. 1. Structure of caffeine.
茶中另一主要分子為咖啡因
Liao’s 研究團隊於 2000 年發表之文章中提到的萃取法為：將茶 葉以熱水煮沸半個小時，經過濾後之茶湯以等體積之乙酸乙酯震盪平 衡，在冰箱過夜後將上層之乙酸乙酯吸出，加入極性樹脂混合。將混 合溶液過濾得到的樹脂再以水溶離樹脂上的兒茶素，過濾後將濾液乾 燥，可得「粗兒茶素類製品」，其兒茶素純度約在50 % ~ 60 %，且不 含咖啡因[1]。
2000 年 Lee, B. L. 等研究團隊針對市面上常見之茶葉進行分
析，所使用的萃取方法為：各取 0.1 g 茶葉加入 10 mL 沸水，搖晃 30 秒後，在維持水溫為 90℃的情形下萃取靜置 30 min，再取出液體 部分0.2 mL，加入 0.4 mL 含有 20% 乙腈(Acetonitrile) 的水溶液，
以15000 g 離心 2 min，取出上層液進行分析[20]。
2003 年，David J. W. 的研究團隊比較日本傳統泡茶方法 ─ 取 1 g 抹茶以 85 mL、85℃熱水萃取，與 1 g 抹茶以 25 mL 甲醇萃取，
兩者經離心10 min 後取出上層液，再以 0.2 μm 尼龍膜過濾，結果發 現以甲醇萃取之兒茶素含量較以熱水萃取的量多，其中(-)-EGCG 含 量更多達580 倍以上[21]。
利用有機溶劑雖然有較好的回收率，但其有高度可燃性與殘留的 疑慮，因此另有開發較無毒性之超臨界二氧化碳加入修飾劑萃取兒茶 素的方法。
1999 年 Chang’s 研究團隊發表利用超臨界二氧化碳萃取與濃縮 烏龍茶中的茶葉精油，當使用4500 psi，60℃ 流速 5 mL/min 之超臨 界二氧化碳300 L 有較佳的萃出率(回收率)。在茶葉樣品與 46%乙醇 以3:5 比例混合後，再以最佳化萃取條件進行萃取，發現萃取出來的 濃度可再增加20%[22]。
同年Chang’s 研究團隊亦發表了利用超臨界二氧化碳萃取烏龍 茶粉中的兒茶酚類，當使用333K、31MPa 超臨界二氧化碳添加 10 mole% 乙醇修飾劑，萃取 90 g 之烏龍茶粉。發現添加乙醇修飾劑可 增加2.8 倍的總茶油量，且可增加兒茶素/咖啡因的比值，總兒茶素萃 取量可達1000 ppm 左右[23]。
2003 年 Vaher, M. et al. 發表以利用超臨界二氧化碳萃取種於愛 沙尼亞(Estonia)的虎仗(Japanese knotweed，日本蓼科雜草)之黃酮類 分子，當使用60℃，34.5 Mpa 超臨界二氧化碳萃取添加 7.5% (w/w) 乙醇之樣品，結果發現虎仗根部所含的黃酮類總量最高[24]。
雖然使用超臨界二氧化碳萃取較安全，唯系統建置成本高且萃取 效果較差，必須加入大量修飾劑，因此在產業界並不普及。
奈米科學的興起，大大改變了人們的生活方式，奈米材料的大表 面積、小尺寸效應，產生了與大尺寸時截然不同的光學、力學、熱學、
化學、電學…等性質[25]，利用這些性質，我們亦可以用作樣品前處理
的材料。
2002 年，T. Rajh 的研究團隊發現，經烯二醇類(enediol)配位基表
面修飾的金屬氧化奈米粒子，其可見光吸收峰產生紅移的現象，在膠 體二氧化鈦奈米粒子(TiO2 nanoparticles, TiO2 NPs)溶液中更可直接見 到顏色的變化，其原因是烯二醇結構對奈米粒子表面結構重組，造成 金 屬 氧 化 物 八 面 體 結 構(octahedral) 與 配 位 基 (metal-ligand) 偶 極 距 (dipole moment)改變所造成，氧化鐵奈米粒子(Fe2O3 nanoparticles, Magnetic nanoparticles, MNPs)與二氧化鋯奈米粒子(ZrO2 nanoparticles) 也有相同的影響[26]。
兒茶素分子中的烯二醇的結構，提供與TiO2 NPs 配位的橋樑，
Chang’s 研究團隊於 2007 年發表的文獻中利用 TiO2 NPs 對兒茶素等 含烯二醇之樣品進行前處理，再以表面輔助雷射脫附游離質譜法 (surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, SALDI – MS)偵測 Catechin、(-)-EGC 與(-)-EGCG，可得偵測極限(limit of detection, LOD)分別為 0.45、1.85 與 0.65 μM，並可偵測實物樣品中 之兒茶素含量，為萃取兒茶素提供了一個新的方向[27]。
烯二醇類對氧化鐵奈米粒子與二氧化鈦奈米粒子都有ligand – to – metal oxide crosstalk 的現象，且氧化鐵奈米粒子便宜、毒性極低，
萃取過程在水相中進行，減少有機溶劑污染的疑慮，且可直接使用強
力磁鐵分離氧化鐵奈米粒子，降低萃取的成本，大大的提高了使用氧 化鐵奈米粒子來萃取茶葉中兒茶素分子的可行性。
在兒茶素的分析與定量上，文獻中測定茶多酚類的方法常見有酒 石酸鐵試劑總量檢測法[28]、高效能液相層析法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)[20,23] 。 而 毛 細 管 電 泳 (Capillary Electrophoresis, CE)因為具備了高效率、高解析度、分析時間短、低 樣品與試劑消耗而在近幾年來被廣泛的應用。
2003 年 L.Suntornsuk 等研究團隊以 150 mM pH10 硼酸緩衝液進 行電泳分離桑葉中的兒茶素 (Catechin) 、芸香苷 (Rutin) 、沒食子酸 (Gallic acid) 、槲皮苷 (Quercitrin) 、山奈酚 (Kaempferol) 與槲黃素 (Quercetin)等六種黃烷醇類，在長度 51 cm，有效長度 42.5 cm,，內徑 50 μm 的玻璃毛細管，以 15 kV 電壓電泳、紫外光偵測器(UV Detector) 設定在207 nm，可得偵測極限 (LOD)在 0.86 ~ 3.16 μg/mL，實物樣 品中可測得每100 g 桑葉中含有 0.452 g 槲黃素[29]。
2004 年 Volpi, N.發表了以電泳分離蜂膠中 15 種黃烷醇類，其最
佳 化 條 件 為 使 用 30 mM pH 9 四 硼 酸 二 鈉 (Sodium tetraborate, Na2B4O7)緩衝液，使用總長 70 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 μm 的 玻璃毛細管，在15 kV 電壓，紫外光偵測器設在 254 nm，40 分鐘內 可完全分離，其變異係數(CV%)皆在 8.8%以下，且發現蜂膠中咖啡
酸(caffeic acid)、高良薑素(Galangin)、槲黃素(Quercetin)、白楊素 (Chrysin)含量較高[30]。
2005 年 X. Xu 等研究團隊分析龍牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.)中 的五種黃酮類分子(兒茶素、金絲桃苷(Hyperoside)、槲皮苷、槲黃素 與芸香苷)，在使用 pH 8.8，混合了 60 mM Na2B4O7與 120 mM 磷酸 二氫鈉(NaH2PO4)的緩衝溶液，以長 60 cm，內徑 25μm 的毛細管，以 19.5 kV 電壓進行電泳，並使用電化學法(+0.95V，vs. Ag/AgCl )進行 偵測。所有的化合物其LOD 在 0.02 ~ 0.05 μg/mL 之間，並可偵測兒 茶素在龍牙草葉之含量為264.5 μg/g，根之含量為 193 μg/g[31]。
另外，近年來也有文獻提出使用毛細管微胞電動層析(micellar electrokinetic chromatography , MEKC) 與 毛 細 管 微 乳 化 電 動 層 析 (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)等方法來分離 茶葉中的成分，其最大的優點，就是除了帶電離子之外，還可以將不 同的中性物質分離出來。方法就是在緩衝溶液中添加介面活性劑。介 面活性劑是一端親水性，另一端為疏水性之長碳鏈。當緩衝溶液中添 加之介面活性劑超過其臨界微胞濃度(critical micellar concentration, cmc)時，介面活性劑就會以疏水端互相聚集形成微胞，利用分析物質 與微胞之間的作用力不同，達成分離中性物質的目的。另有添加手相 選擇劑分離異構物。而 MEEKC 又比 MEKC 多增加了油相，以提高
分離效率[32]。
2003 年 Pomponio, R. et al. 研究團隊以毛細管微乳化電動層析法
分析綠茶中的六種兒茶素與咖啡因，在使用 24 cm (有效長度：19.5 cm)，內徑 50 μm 毛細管，最佳化緩衝溶液條件：1.36%(w/v)庚烷、
2.31%(w/v)SDS、9.72%(w/v)正丙醇與 pH 2.5 50 mM 磷酸緩衝液 88.61%下，以-10 kV 進行電泳，所有樣品可在 12 分鐘內被完全分離 出來，其中(+)-C 之線性範圍在 2~6 μg/mL，LOD 為 0.391 μg/mL，LOQ
在1.17 μg/mL[33]。
2004 年 Kodama, S. et al. 研究團隊以毛細管微胞電動層析法，並
在緩衝溶液中加入 6-O-α-D-Glucosyl-β-cyclodextrin (6G-β-CD)進行分 離茶葉中的(±)-C、(±)-EC、(-)-CG、(-)-EGCG、(-)-ECG、(-)-EGC、
Caffeine，在使用 pH 6.4，最終濃度 200 mM 硼酸與 20 mM 磷酸緩衝
液混合25 mM 6G-β-CD 與 240 mM SDS (sodium dodecyl sulfate)，在 +25 kV 下以 64.5 cm (有效長度 56 cm)，內徑 50 μm 之毛細管進行電 泳，結果發現標準品中線性範圍皆在 2~100 mg/L，偵測極限最低可 到 0.2 mg/L。在真實樣品中，發現(-)-EGCG 的含量最高，泡製的茶 (+)-C 的含量較(-)-C 的多，但茶飲料剛好相反 [34]。
2005 年 Huang H.-Y. et al. 研究團隊以毛細管微乳化電動層析法 分析十二種多酚類物質，在使用 1.36%(w/v)庚烷、2.89%(w/v)SDS、
7.66%(w/v)環己醇、2% w/v 乙腈與 pH 2.0 25 mM 磷酸緩衝液 86.1%
下，，毛細管長 48.5 cm(有效長度 40 cm)，內徑 50 μm，在-27 kV 下 進行電泳，所有樣品可在 14 分鐘內被完全分離出來，其中所有待測 物之線性範圍在2~200 μg/mL，R2都在0.999 以上。應用於真實樣品 上，可測得茶葉中(-)-EGCG 含量 21.4 μg/mL，茶飲料(-)-EGCG 含量
為57.7 μg/mL[35]。
2006 年 Gotti, R. et al. 研究團隊利用添加環糊精之毛細管微胞電 動層析法(CD-MEKC)偵測可可豆中的兒茶素。在使用緩衝溶液條件
為12 mM HP-β-CD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin)、90 mM SDS 與 50 mM pH 2.5 之 Britton-Robinson buffer(硼酸、乙酸與磷酸混合溶於水 中，以1 M 氫氧化鈉調整 pH 值為 pH 2.5，再定量到三種酸之最終濃 度都為16.8 mM 之混合液)，毛細管長 38.5 cm(有效長度 8.5 cm)，內 徑50 μm，在 15 kV 下進行電泳，所有樣品可在 12 分鐘內被完全分 離出來，其中(-)-EC 與(+)-C 線性範圍在 15.0~320.0 μg/m 與 1.0~40.0 μg/mL，R2都在 0.999 以上，LOD 都為 0.03 μg/mL，LOQ 都為 0.1 μg/mL。應用於真實樣品上，可將可可豆中(-)-EC 與(+)-C 兩鏡相異構 物分離出來 [36]。茶素萃取方法與分析整理如表2.。
Table 2. The extraction and analysis conditions of catechins
Extract Real Sample Extraction conditions Analysis
system Analysis condition conclusions Ref.
Catechins Tea 茶葉以熱水煮沸半小時，經過
濾後以等體積醋酸乙酯震盪 Caffeine, amino acid, etc. (-)-EGC, caffeine, catechin gallate adenine, gallic acid theophylline, caffeic acid,
Long-jing(龍井茶), Pu-erh(普耳茶), Jasmine(茉莉綠茶), Chrysanthemum(菊花茶), Iron Buddha(鐵觀音), Oolong tea(烏龍茶), Japanese(日本綠茶) and Ceylon tea(錫蘭紅茶).
各取0.1 g 茶葉加入 10 mL 沸 0.035% TFA aqueous and 50%
ACN with 0.025% TFA.
Flow rate : 1.0 mL/min CE：
Capillary : 40 cm×50 μm I.D.
Running buffer : 200mM boric acid, 10mM NaH2PO4, 4.5mM β-CD with 27.5% ACN.
Voltage : 25 kV
Linear range：(-)-EC, (-)-ECG, (+)-C at 0.05~50 μg/mL.
(-)-EGCG, (-)-EGC at 0.05~100 μg/mL.
[20]
(-)-EGC, (-)-EC, (-)ECG,(-)-EGCG, (-)-C, Caffeine
Matcha green tea 1. 85.0 mL、85 ℃熱水加入 1 g
Capillary : 80.5 cm (effective length of 72.0 cm)×50 μm I.D.
Running buffer : 25 mM phos- phate buffer pH 7.20 mM SDS, with 5% Methanol.
Voltage : 27 kV
Phenolic Japanese knotweed 60℃，34.5 Mpa 超臨界二氧 化碳萃取添加7.5% (w/w)乙
醇之樣品 CE –UV
(240 nm)
Capillary: 75 cm (effective length of 5 cm)×50 μm I.D.
Running buffer: 25 mM disodium tetraborate buffer at pH 9.4 . Voltage : 18 kV
Catechin: 0.45 μM (-)-EGC: 1.85 μM (-)-EGCG: 0.65 μM
[27]
Catechin, Rutin, Gallic acid, Quercitrin, Kaempferol, aglycone quercetin
Capillary : 51 cm (effective length of 42.5 cm)×50 μm I.D.
Running buffer : 150mM boric acid.
Voltage : +15 kV
aglycone quercetin：
LOD: 0.86 μg/mL LOQ: 3.16 μg/mL 0.452 g/ 100 g on dry mulberry leaves weight.
[29]
Flavonoids, phenolic acids
propolis
– CE – UV
(254 nm)
Capillary : 70 cm (effective length of 50 cm)×50 μm I.D.
A great percentage of propolis were caffeic acid, galangin, chrysin and quercetin.
[30]
Catechin, hyperoside, quercitrin, quercetin, rutin
Agrimonia pilosa Ledeb.
(龍牙草)
Running buffer : pH8.8 60 mM tetraborate, 120 mM NaH2PO4. Voltage : +19.5 kV
ECD: working electrode:500 μm diameter carbon disk; auxiliary electrode: a platinum; reference electrode: Ag/AgCl.
Linear range and LOD of catechin were 0.09
~ 53.3 μg/mL and 0.02 μg/mL.
Catechin in leaves and stems of Agrimonia pilosa Ledeb. is 264.5 μg/g and 193.6 μg/g
[31]
catechins Cistus 取4 g 樣品以 150 mL 熱水萃
取，重複三次，將三次萃取液 集中，以Buchner sintered-
glass 濾膜過濾。 CE – UV
(200 nm)
Capillary: 24 cm(effective length of 19.5 cm)×50 μm I.D.
Running buffer : 1.36% (w/v) heptane, 2.31% (w/v) SDS, 9.72% (w/v) butan-1-ol, and 50 mM sodium phosphate buffer (pH2.5) 86.61% (v/w)
Voltage : -10 kV
Linear range, LOD, and LOQ of (+)-C
(±)-C, (-)-ECG, (±)-EC, (-)-EGCG, (-)-EGC,
Green、oolong and black teas
取1 g 茶葉以 85℃ 60 mL 萃 取1 分鐘，再以 0.22 μm 濾膜
過濾。 CE – UV
(210nm)
Capillary : 64.5 cm (effective length of 56 cm)×50 μm I.D.
Running buffer : 200 mM borate- 20mM phosphate buffer (pH 6.4) containing 240 mM SDS and 25 mM 6G-β-CD.
13 phenolic compounds
Capillary : 48.5 cm (effective length of 40 cm)×50 μm I.D.
Running buffer : 1.36% (w/v) heptane, 2.89 % (w/v) SDS, 7.66% (w/v) butan-1-ol, 2%
ACN and 25 mM sodium phosphate buffer (pH2) 86.1%
(v/w) μg/mL，R2 都在 0.999 以上。應用於真實樣
catechins Theobroma cacao beans 取50 mg 樣品以體積比 71/29 之水/乙醇混合液 1mL，於溫 度65℃ 下萃取 15 分鐘，再 以4000 rpm 離心 5 分鐘，將
上層液以0.2 μm 濾膜過濾。 CE – UV (200 nm)
Capillary : 38.5 cm (effective length of 8.5 cm)×50 μm I.D.
Running buffer :12 mM HP-β- CD, 90 mM SDS and pH 2.5 50 mM Britton-Robinson running buffer
Voltage : 15 kV
(-)-EC 與(+)-C 線性範 圍在15.0~320.0 μg/m 與1.0~40.0 μg/mL，