電泳條件之探討

文獻記載中，大多數的實驗將紫外光偵測器的波長設 於 200 nm，但在此波長之下，易受有機溶劑濃度之干擾，

有可能影響實驗定量結果，因此我們欲找尋其他不受有機 溶劑干擾之吸收波長。我們將五種兒茶素水溶液與咖啡因 水溶液，以濃度 5×10^-5 M 進行紫外可見光吸收之偵測，結 果如圖 6。從圖中我們可發現五種兒茶素水溶液與咖啡因 水溶液在 250 nm 到 300 nm 之間亦有吸收峰，雖然吸收無 200 nm 至 240 nm 間來的大，但在考慮避免有機溶劑的干 擾情況下，本實驗選擇(-)-EGCG 之第二大吸收峰 275 nm 作為我們的偵測波長。

(二) 不同濃度的硼酸緩衝溶液對分離之影響

1993 年, Morin, Ph. et al. 研究團隊提出了硼酸分子與 苯環上鄰位羥基錯合的結構模型，使得分子的電位改變而 在電泳中有較佳的分離效果^[39,40]。兒茶素分子中亦有苯環

7，其錯合物也可改善兒茶素電泳分離的效果，因此我們先

選用 pH9 之硼酸緩衝液，分別以濃度 60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM，在 15 kV 下進行電泳，其結果如 圖 8，其中 100 mM 下因電流過大，造成實驗中斷，故所以 無 100 mM 之電泳圖。從圖 8 中發現隨著硼酸緩衝液的濃 度提高，分離效果改變雖不明顯，但有越來越佳的趨勢，

推測是因為硼酸分子的量增加，與兒茶素形成錯合的機會 越高，且因濃度提高，造成離子強度增加，緻密層陽離子 量越多，排列越緊密，以至於擴散層陽離子較少，影響EOF 速度使得分離時間拉長，造成分離效果越佳。

(三) 不同濃度的 Tris-borate 緩衝溶液對分離之影響

接下來我們改使用 Tris 調整硼酸緩衝液之 pH 值到 8，

在 pH 8 的情形下，Tris 與硼酸的莫耳比為 5:9。我們選用 50 mM 、 100 mM 、 150 mM 、 200 mM 、 250 mM 的 Tris-Borate，在+25 kV 下進行電泳，其結果如圖 9，同樣的，

250 mM 下因電流過大，造成實驗中斷，所以無 250 mM 之 電泳圖。從圖 9 中發現隨著 Tris-borate 緩衝液的濃度提高，

分離效果越好，推測原因與使用硼酸緩衝液電泳的實驗雷 同，硼酸分子濃度越高，與兒茶素分子錯合的機率越大，

且因濃度提高，造成離子強度增加，緻密層陽離子量越多，

排列越緊密，以至於擴散層陽離子較少，影響 EOF 速度使 得分離時間拉長，分離效果越好。200 mM Tris-borate 是較 佳的分離濃度。

(四) 不同 pH 值緩衝溶液對分離之影響

雖然使用 Tris-Borate 緩衝液有較佳的分離度，但是 (-)-EGC 與(-)-EC，和(-)-EGCG 與(-)-EGC 的波鋒還是有部

份重疊，因此我們改變緩衝溶液的 pH 值，嘗試將(-)-EGC 與(-)-EC，和(-)-EGCG 與(-)-EGC 完全分離。我們固定硼 酸溶液之最終濃度為 360 mM，改變 Tris 溶液的最終濃 度，調配出pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9 的 Tris-Borate 緩衝溶液，以 20 kV 進行電泳，電泳結果如圖 11，其分離 度的結果如表 3。

從圖 11 中可發現隨著 pH 值的增加，電泳時間越長，

四種兒茶素的分離效果越好，推測是因為硼酸的 pKa 在 25℃時為 9.23^[41]，pH 值越高，硼酸解離成硼酸根的量較 多，而有較多的硼酸根與兒茶素錯合，且因為 pH 值越高，

tris 的濃度越多，離子強度增加，造成 EOF 降低使得分離

但是發現 pH 8.5 以上咖啡因線性範圍變小了，推測是因為 咖啡因在鹼性的環境不穩定，對真實樣品的定量上可能會 有影響，因此選擇 pH 8 的 Tris-Borate 緩衝液做為電泳的緩 衝溶液。

(五) 添加有機溶劑對分離之影響

在 緩 衝 溶 液 中 添 加 有 機 溶 劑 可 降 低 電 泳 時 電 滲 流 (EOF) 的速度^[32]，我們期待在不改變電場的情形下，藉由 有機溶劑降低電滲流，增加分離時間，提高分離度，因此 我們分別在緩衝溶液中添加了 5%、10%、15%、20% 的甲 醇，和 5%、10%、15%、20% 的乙醇，以+20 kV 進行電 泳，實驗結果如圖 12、圖 13，並整理出表 4、表 5，從兩 圖中可看出隨著有機溶液比例增加，電泳的時間也慢慢增 長，且從表中可發現(-)-EGC 與(-)-EC，和(-)-EGCG 與 (-)-EGC 的分離度越來越好，但相較於甲醇，乙醇的毒性 遠低於甲醇，因此我們選擇在緩衝溶液中添加乙醇進行電 泳，又雖然 20%乙醇雖然有較佳的分離度，但是電泳時間 必須耗費35 分鐘之久，故選擇電泳時間只需 25 分鐘之 15%

乙醇。所以最佳電泳緩衝溶液為含 15% 乙醇之 200 mM, pH 8 Tris-Borate 緩衝溶液。

(六) 改變電壓對分離之影響

提高電壓可增加電場強度，提高分離效果與速度，但 伴隨著焦耳熱過大造成再現性差的隱憂，因此希望能夠找 到最快的分離條件，又能有良好的再現性。我們分別以電 壓+15 kV、+20 kV、+25 kV、+30 kV 進行電泳，電泳結果

如圖 14，整理結果如表 6，從圖 14 中發現隨著電壓的提高，

分離的時間越短，在+30 kV 下，分離全部兒茶素只需 20 分鐘，因此我們選擇以+30 kV 進行真實樣品與之後經氧化 鐵奈米粒子吸附、脫附兒茶素實驗之檢測。

(七) 咖啡因與四種兒茶素之定量

經過以上檢測，最佳化條件列於表 7，以此條件對咖 啡因與四種兒茶素標準品進行電泳，其電泳圖如圖 15，從 圖中發現 20 分鐘內可將咖啡因與四種兒茶素完全分離。

我們在以此最佳化電泳條件，對五種標準品製作檢量 線，其檢量線如圖16，將檢量線數據整理後，結果如表 8。

從表 8 中可發現咖啡因的線性範圍(linear range) 在 90 μM

~500 μM，偵測極限 (LOD)為 75 μM (S/N=3)，定量極限 (LOQ)為 90 μM。(-)-EC 與 (-)-ECG 的線性範圍皆在 5 μM ~

1.6 μM，而(-)-ECG 之偵測極限為 1 μM。(-)-EGC 的線性範 圍在 5 μM~500 μM，偵測極限為 0.9μM (S/N=3)，定量極限 為 5 μM。(-)-EGCG 的線性範圍在 2.5 μM ~ 500 μM，偵測 極限為 0.9 μM (S/N=3)，定量極限為 2.5 μM。