冷光酶報導基因分析

將已轉染之細胞以 PBS 清洗兩次後，加入 trypsin-EDTA 300 μl取下 細胞至微量離心管中，在 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，移除上清液，再加入 1 ml PBS 打散細胞並清洗，再以 4℃轉速 60 g 離心 5 分鐘，再 PBS 移除，

重複此步驟兩次，以 Dual-Luciferase^TM reporter assay system (Promega, Madison, USA) 進行分析。將每管細胞沉澱物加入 100 μl 之 1X Passive Lysis Buffer 均勻打散，在室溫下混勻作用 20 分鐘後，以 4℃轉速 7000 g 離心 20 分鐘，收集上清液至新的微量離心管中，此為蛋白質萃取液。

取 20 μl之蛋白質萃取液於黑色不透光之 96 well 孔盤中，再加入 40 μl 之 Luciferase Assay Reagent® (LARII)， 以 Victor^2TM 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) 測定冷光強度，此為分析 Firefly luciferase 活性。

分析完畢後，再加入 40 μl之 Stop & Glo® Reagent，同樣置於機器中判定 冷光強度，此為分析 Renilla luciferase 之活性，並以此數值作為 internal control。

第十一節 RNA 萃取

使用 6-well 孔盤，每孔皆植入等量之細胞數，預培養 24 小時後，以 藥劑進行處理，培養於 37℃培養箱中。之後去除含有處理藥劑之培養基，

加入 500 μl TRIzol reagent (Invitrogen Corpoation, California, USA)搖晃，

再取到新的微量離心管中，室溫靜置 5 分鐘。加入 100 μlchloroform 搖晃 約 15 秒，可看到溶易呈現渾濁的粉紅色，在 4℃下以 8500 g 離心 15 分 鐘，此時溶液分成三層，小心取出上清液移至新的微量離心管中。加入 等倍體積之 isopropanol，搖晃數下使其均勻，於室溫下靜置 10 分鐘，在 4℃下以 8500 g 離心 10 分鐘，將上清液去除後，加入 1 ml 75％酒精清洗 沉澱物，再以 4400 g 離心 5 分鐘，此步驟重複兩次，將上清去除後，於 室溫下晾乾。加入 20 μl之 DEPC-water (diethylpyrocarbonate) 溶解 RNA。

使用分光光度計 (UV1100 photometer; WPA, UK) 測定 RNA 濃度及純度。

第十二節 反轉錄作用

取 2 μg RNA 加入 0.5 μl Oligo dT (Protech Technology, Inc., Taipei, Taiwan)，以 DEPC 水補至總體積 13.5 μl，於 70℃作用 10 分鐘後，立刻 置於冰上 10 分鐘。之後加入 4 μl2.5 mM dNTP (Protech Technology, Inc., Taipei, Taiwan)，2 μl 10X MMLV RT buffer 及 0.5 μl 10 U/ul MMLV RTase (Epicentre biotechnologies, Wisconsin, USA)，於 37℃作用ㄧ小時，再於 95℃作用 5 分鐘，接著於 4℃作用 5 分鐘停止反轉錄酶活性，保存於 -20℃

以備用。

第 十 三 節 同 步 定 量 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)

本實驗使用 LightCycler 2.0 System (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland) 儀器，利用 LightCycler FastStart NA Master PLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland) 之試劑組合，監測聚合 酶連鎖反應過程中基因複製之情形。

取 2 μlcDNA 樣品，分別加入 0.5 μl之 forward 及 reverse 引子 (表 1) 與 2 μlMaster Mix (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland)，最後以無菌 水將總體積補至 10 μl。PCR 反應條件設定：第一週期為 95℃ Denaturation 10 分鐘；第二週期以 95℃ Denaturation 10 秒，60℃ Annealing 5 秒及 72℃

Extention 10 秒為一循環，依待測基因不同而進行 40 至 50 個循環；第三 週期以 95℃作用 0 秒，45℃作用 15 秒及緩慢升溫 (0.1℃/秒)至 95℃，於 升溫過程中持續偵測螢光反應；第四週期設定 40℃進行冷卻。

第十四節 細胞蛋白質之萃取

將細胞收集至微量離心管中，加入適量 RIPA lysis buffer (含 1M Tri-Cl (PH=7.5), 0.5M NaCl, 0.5M EDTA (pH=8.0), 10% SDS, 10% NP40, 10％

DOS, miniQ-H2O 以及 1％ protein inhibitors)，震盪細胞使之均勻，至於 冰上 15 分鐘。之後以 4℃轉速 8500 g 離心 30 分鐘，取出上清液至新的 微量離心管，即為總蛋白質萃取液，儲存於-20℃備用。

第十五節 蛋白質之定量

首 先 將 已 知 濃 度 2 mg/ml BSA (bovine serum albumin) (Pierce

Biotechnology, Rockford, USA) 以 PBS 連續兩倍稀釋 6 次，使得標準溶液 範圍介於 1- 0.031 mg/ml，以此標準溶液做出標準曲線。將分裝出來的 10 μl蛋白質萃取液以 PBS 連續五倍稀釋 6 次。定量蛋白質系統，使用 BCA kit (Pierce Biotechnology, Rockford, USA) 所附 A 溶液與 B 溶液以 50：1 的比例混合搖晃，取 10 μl蛋白質萃取液稀釋液加入 200 μl的 A 加 B 混 合液。之後以 55℃加熱 30 分鐘，使用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, VERSAmax) 在波長 595 nm 下測定溶液吸光值，以推算蛋白質 的正確濃度。

第十六節 西方點墨法分析

配製 10% SDS-PAGE (Resolving gel：2.7 ml acrylamide：bis-acryamide

= 29%：1%, 2.5 ml Tris-HCl (pH=8.8), 100 μl 10% SDS, 4.6 ml ddH2O, 100 μl 10% APS (ammonium persulfate), 6 μlTEMED；Stacking gel：0.33 ml acrylamide：bis-acryamide = 29%：1%, 0.16 ml Tris-HCl (pH=6.8), 20 μl 10%

SDS, 2.8 ml ddH2O, 20 μl 10% APS, 2μlTEMED)。取定量之蛋白質樣品加 入 2X 樣品緩衝液 (sample buffer)於 97℃煮沸 3 分鐘，置於冰上急速冷 卻，個別注入 10% SDS-PAGE well 中，以 60 volt 30 分鐘，之後 90 volt 3 小時條件下進行電泳，電泳完成後進行蛋白質轉漬。將 PVDF membrame

(polyvinyldene diflouride membrane, Amersham Pharmacia) 以 methanol 浸 潤，再將 PVDF membrane 置於 SDS-PAGE gel 上，再將含有轉漬緩衝液 10% 10X electrophoresis buffer (250 mM Tris-base, 1.92 M Glycine, 1％

SDS) 與 20% 甲醇的轉印槽中以 30 volt, 12 小時，轉漬蛋白質到 PVDF membrane 上，浸泡於含 5% skim milk (Becton, Dickison and Company, Franklin Lakes, USA) 及 5% BSA 之 TBS blocking buffer (1 M Tris-HCl, 100 mM NaCl) 作用 1 小時。去除 blocking buffer，以 TBST buffer (1 M Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Tween-20) 清洗三次，再以 TBS buffer 清洗三 次，每次 10 分鐘。再以第一級抗體於室溫進行雜合 2 小時 (表 2)，之後 以 TBST buffer 清洗三次，再以 TBS buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。接 著以第二級抗體於室溫進行雜合 1 小時，之後以 TBST buffer 清洗三次，

再 以 TBS buffer 清 洗 三 次 ， 每 次 10 分 鐘 。 以 Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent (Santa Crutz, USA) 作用 1 分鐘之後，

曝光於 X-ray film (Fuji film, Japan) 數分鐘，沖片顯影後即可觀察，利用 Image-Pro Plus 4.5 進行影像分析，分別計算密度 (density)。

第十七節 流式細胞儀分析

以 6-well 孔盤，每 well 植入等量之細胞後，預培養 24 小時後，以藥

劑進行處理，培養於 37℃培養箱中。之後去除含有處理藥劑之培養基，

以 PBS 清洗後，將細胞收下並取至微量離心管中，在 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，移除上清液，再加入 1 ml 之 PBS 打散並清洗細胞後，在 4℃以 60 g 離 心 5 分 鐘 ， 再 加 入 含 有 50 uM 之 JC-1 (5,5’,6,6’-Tetrachloro -1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide) staining buffer，置於 37℃作 用 20 分鐘後，再以 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，去除上清液，再加入 1 ml 之 PBS 將 pellet 打散並移至康氏管 (Falcon tube)中，置於冰上並避光，利 用 FACS^TMCalibur system 觀察粒線體膜電位之變化，以 CellQuest software 分析實驗結果。

第十八節 統計分析

數值以 mean ± SD 表示，SAS 軟體進行單因子變異數分析，並以 Fisher’st teat 進行統計分析，當 p <0.05 具統計上之意義。