給予多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞之影響

觀察給予多元不飽和脂肪酸 24 小時之細胞型態，發現處理 25 至 100 μM 二十碳五烯酸 24 小時後，其細胞形態與控制組較為相似，且細胞存 活率有明顯上升，顯示 25 至 100 μM 之 n-3 脂肪酸可明顯增加細胞生長 速率 (圖 12)。在二十碳四烯酸之部分，當投予 25 至 50 μM，其細胞型態 與控制組相似，而存活率顯著高於控制組；然而投予100 μM 其神經膠瘤 細胞出現多數空泡，但存活率與控制組無顯著差異。當投予二十碳五烯 酸及二十碳四烯酸 200 μM 以上，其細胞型態明顯死亡以及細胞存活率 皆顯著下降 (圖 12)，推測過高濃度的脂肪酸可能會造成細胞之毒性。

過去亦有研究顯示，n-3 脂肪酸對於細胞存活率之影響，在大鼠初代 皮質神經細胞投予二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic acid, DHA)，結果發 現給予 25至50 μM 二十二碳六烯酸，會刺激細胞之生長速率；但若給予 較高濃度如200 μM時，其細胞存活率亦有明顯下降之情形 (Cao et al., 2005 )，並且有研究顯示由於多元不飽和脂肪酸具有較高比例的雙鍵，因 此高濃度之脂肪酸容易造成脂質過氧化發生，進而造成細胞傷害 (Kubo et al., 1997)。

第三節 多元不飽和脂肪酸處理對於 C6 神經膠瘤細胞達到之保護作用

(一) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響

觀察預處理多元不飽和脂肪酸對於 ceramide 神經細胞傷害之影響，

在給予二十碳五烯酸組之結果，可發現給予濃度 25 至 50 μM 其細胞型態 與控制組相似 (圖 9)；在細胞存活率部分，亦可發現度濃度 25 至 50 μM 可維持至控制組之程度 (圖 13)。在粒線體膜電位結果發現濃度 25 μM 有 上升趨勢，當處理濃度50 μM 其膜電位則與控制組相似 (圖 18)，顯示預 處理較低濃度二十碳五烯酸可保護神經細胞以避免 ceramide 之傷害，並 可維持其粒線體之功能性。

在處理二十碳四烯酸組之結果，觀察濃度 25 μM 其細胞存活率可維 持至控制組之程度 (圖 13)，且粒線體膜電位部分亦可發現與 ceramide 組 相較有上升之趨勢 (圖 18)。然而處理濃度 50 μM 之二十碳四烯酸，雖然 膜電位有上升之趨勢 (圖 18)，然而細胞存活率顯著下降 (圖 13)。顯示僅 在預處理二十碳四烯酸濃度25 μM 時，可保護神經細胞以避免 ceramide 之傷害。

過去研究亦顯示，利用 Wistar 大鼠餵食二十二碳六烯酸，並培養視 網膜初代神經細胞並以濃度10 μM 之 ceramide 造成神經細胞傷害，亦發 現餵食二十二碳六烯酸大鼠其視神經細胞之程式化凋亡細胞數目顯著低

實驗有相似性的結果 (German et al., 2006)。

(二) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響

觀察多元不飽和脂肪酸與 ceramide 同時處理對神經細胞傷害之影 響，在處理二十碳五烯酸組之結果，發現與 ceramide 同時處理 25 至 50 μM 二十碳五烯酸 24 小時後，其細胞形態與控制組較為相似 (圖 10)；在存 活率部分亦可發現投予25 μM 與控制組相較則無顯著差異，而 50 μM 存 活率雖未回復至控制組之程度，但亦有上升之趨勢 (圖 14)。在粒線體膜 電位部份發現，不論是 25 或 50 μM 之二十碳五烯酸，其粒線體膜電位皆 顯著高於 ceramide 組且與控制組無顯著差異 (圖 19)。

在處理二十碳四烯酸組之結果，發現雖然同時處理 25 至 50 μM 二 十碳四烯酸其存活率與 ceramide 組相較皆有上升之情形 (圖 14)，但粒線 體膜電位皆沒有回復之情形 (圖 19)。結果顯示與 ceramide 同時處理多元 不飽和脂肪酸，投予二十碳五烯酸可使存活率上升且維持粒線體功能性 以達到神經保護作用，但在二十碳四烯酸僅能增加其存活率但無法維持 粒線體功能性。

第四節 多元不飽和脂肪酸對轉錄因子及相關粒線體基因表現之影響

(一) 觀察多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞對轉錄因子之影響 以多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時，發現處理二十 碳五烯酸及二十碳四烯酸 25 至 100 μM 皆會增加 PGC-1α之轉錄活性，

且二十碳四烯酸與二十碳五烯酸之間並無顯著差異 (圖 20A)。

先前研究顯示，PGC-1α之基因表現可能經由兩個途徑增加，其ㄧ為 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 途徑，其二為 PKA (protein kinase A) 途徑 (Puigserver et al., 2003)。前者主要經由外界因子刺激，如 慢性發炎、營養素等，於產生細胞激素後進一步影響 p38 MAPK 後對 PGC-1α蛋白質進行磷酸化作用，幫助其蛋白質之活化及穩定 (Puigserver et al., 2001; 2003)。亦有學者以初代肝臟細胞處理油酸或亞麻油酸，發現 會增加 p38 MAPK 之磷酸化作用，且油酸之組別 PGC-1α基因表現有顯 著增加之情形 (Collins et al, 2006)。而本次研究結果顯示，處理 EPA 及 AA 亦會增加神經細胞中 PGC-1α之轉錄活性，但是否是經由影響 p38 MAPK 來影響 PGC-1α基因，則需要進一步的研究。

以多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時，發現投予二十 碳五烯酸 25 至 100 μM皆會增加 Tfam 之轉錄活性；然而投予 25 至 50 μM 二十碳四烯酸亦會明顯增加 Tfam 之轉錄活性； 100 μM 則與控制組無顯

著差異 (圖 20B)。

Tfam 為粒線體 DNA 重要的轉錄因子，過去研究顯示，將大鼠 Tfam 報導載體與 NRF-1 大量表現載體同時轉染至大鼠 L6 myoblast 細胞中，發 現 Tfam 轉錄活性顯著上升 (Choi et al., 2002)。由於 NRF-1 活化 Tfam 啟 動子之轉錄因子，然而 NRF-1 需要 PGC-1α作為轉錄共同活化因子來結 合至 Tfam 啟動子上活化位置；亦有學者指出，轉染 PGC-1α大量表現載 體至纖維母細胞，發現 Tfam 蛋白質表現量有顯著增加之情形，並且促使 粒線體生合成增加 (Liang et al., 2007)。本次研究顯示，推測多元不飽和 脂肪酸處理亦可能藉由增加 PGC-1α轉錄活性，而進一步影響 Tfam 之轉 錄活性。

(二) 觀察 Pre-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄 因子之影響

本次研究發現，預先處理二十碳五烯酸濃度 50 與 100 μM 對於 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組 (圖 21A)，且同時發現下游核轉錄之 NDUFA9 蛋白質表現，在濃度 25 及 50 μM 與控制組相較有上升趨勢，而 100 μM 之蛋白質表現顯著上升 (圖 24)。在預處理二十碳四烯酸組之結 果，則發現100 μM 對於 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組 (圖 21A)，觀 察下游核轉錄之 NDUFA9 蛋白質表現，則發現 25μM、50 μM、100 μM 與控制組相較皆無顯著差異 (圖 24)。

在先前研究指出，PGC-1α會藉由影響 NRF-1 及 NRF-2 來調控並影 響下游核轉錄之粒線體蛋白質表現 (Evans and Scarpulla, 1990)。因此本次 研究顯示，多元不飽和脂肪酸可能藉由影響 PGC-1α轉錄活性，並進一步 影響核轉錄之粒線體蛋白質之表現。

接著觀察預處理多元不飽和脂肪酸影響 Tfam 基因表現，在二十碳五 烯酸組之結果，發現處理濃度 25 及 50 μM 其轉錄活性有顯著高於控制組 之情形，在蛋白質表現部分亦可看到相似的結果 (圖 21B, C)。同時發現 粒線體 DNA 之 ND6 (NADH dehydrogenase subunit 6) mRNA 表現，在濃 度 25 及 50 μM 顯著高於控制組 (圖 23)。然而在二十碳四烯酸組之結果，

雖然處理濃度25μM、50 μM、100μM 其轉錄活性有顯著高於控制組 (圖 21B, C)，但在 ND6 mRNA 表現與控制組相較皆無顯著影響 (圖 23)。

Tfam 為調控粒線體 DNA 複製及轉錄之轉錄因子，且 Tfam 蛋白質 對於維持粒線體 DNA 之套數具有重要性 (Larsson et al., 1998)，而本次實 驗結果顯示，預處理濃度 25 及 50 μM 之二十碳五烯酸對於 Tfam 之基因 表現及下游粒線體上基因 ND6 之表現亦有明顯的影響。

(三) 觀察 Co-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄 因子之影響

本次實驗結果發現，給予二十碳五烯酸濃度 25、50 及 100μM 對於 PGC-1α蛋白質表現有上升之趨勢，但無進行統計分析 (圖 22A)。而在核

轉錄之粒線體蛋白質 flavoprotein 之表現，則顯示 50 及 100 μM 雖然有上 升的趨勢，但不具統計差異 (圖 26)。然而二十碳四烯酸組之結果，不論 是 PGC-1α蛋白質表現或是下游 flavoprotein 之蛋白質表現皆不具上升之 趨勢 (圖 22A, 26)。

在 Tfam 轉錄活性之結果，在二十碳五烯酸組發現處理濃度 25、50 及100 μM 轉錄活性皆顯著高於控制組 (圖 22B)，同時發現粒線體 DNA 之 ND6 mRNA 表現 (圖 25)，亦有相似的結果。而二十碳四烯酸組之結 果，發現以 25 及 50 μM 處理其 Tfam 轉錄活性皆顯著高於控制組 (圖 22B)，在 ND6 mRNA 表現結果可發現相同之趨勢 (圖 25)。因此顯示多 元不飽和脂肪酸同時處理 ceramide，二十碳五烯酸亦能增加細胞核及粒 線體轉錄之粒線體蛋白質基因表現情形。

第五節 綜合討論

(一) Ceramide 影響 C6 神經膠瘤細胞粒線體之基因表現造成傷害之作用 本次實驗結果發現，ceramide 並不影響轉錄因子 PGC-1α及 Tfam 之 轉錄活性及蛋白質表現 (圖 21A, B, C)，但是對於粒線體 DNA 之 ND6 mRNA 表現，明顯低於控制組 (圖 25)。因此推測 ceramide 並不是藉由影 響轉錄因子之基因表現來影響粒線體之基因表現，而是藉由其他途徑來 造成粒線體功能異常，而造成細胞存活率明顯下降。

過去學者探討，利用大鼠分離出心臟粒線體並以 ceramide 處理，可 發現粒線體之氧消耗率明顯下降，且指出 ceramide 是直接性地抑制 Complex III 活性，而呼吸傳遞鏈上之 Complex III 亦為大多數氧自由基之 來源之一，因此 ceramide 處理使 Complex III 活性下降，而促使氧化自由 基大量生成進一步造成粒線體之功能性異常 (Gudz et al., 1997)。

(二)多元不飽和脂肪酸調控轉錄因子之表現以達到神經細胞之保護作用 本次實驗結果發現，不論是預處理或與 ceramide 同時給予低濃度之 二十碳五烯酸，會促使轉錄因子 PGC-1α及 Tfam 轉錄活性增加，並調控 下游細胞核及粒線體轉錄之基因表現有增加情形，能達到回復粒線體功 能以增加細胞存活率，達到神經細胞之保護作用。但是在處理二十碳四 烯酸之結果，發現雖然低濃度處理情況對 Tfam 轉錄活性增加，且下游粒

響，且核轉錄之粒線體蛋白質亦無顯著差異，造成即使細胞存活率增加，

但粒線體功能性依舊無法回復。

先前學者利用組織特異性之 Tfam 基因剔除小鼠，為單獨剔除多巴胺 神經中之 Tfam 基因，由結果顯示此基因剔除小鼠出現巴金森氏症之症 狀，並且以電子顯微鏡觀察發現粒線體型態有異常之情形 (Ekstrand et al., 2007)。另外有研究指出，在漢丁頓舞蹈症 (Huntingtin’s diesase) 小鼠模

先前學者利用組織特異性之 Tfam 基因剔除小鼠，為單獨剔除多巴胺 神經中之 Tfam 基因，由結果顯示此基因剔除小鼠出現巴金森氏症之症 狀，並且以電子顯微鏡觀察發現粒線體型態有異常之情形 (Ekstrand et al., 2007)。另外有研究指出，在漢丁頓舞蹈症 (Huntingtin’s diesase) 小鼠模