分子生物技術於環境工程上之應用

傳統微生物菌群研究是以分離純化和實驗室培養等方法為主，藉 由 觀 察 菌 株 的 外 觀 型 態 (morphology) 、 生 理 特 徵 (physiological characteristics)、生化特性 (biochemical characteristics)和代謝功能等特 性來加以分類，如表2-1 所列。

表 2-1 細菌系統分類學之種類與特性 (Busse et al., 1996 )

Categorie Examples

Cultural

Colony morphology Color of colonies Fruiting bodies Mycelia

Morphological

Cell morphology Cell size

Motility

Flagellation type Reserve material Gram stain Acid-fast stain

Physiological

Temperature range pH range

Salinity tolerance

Biochemical

Carbon source utilization Oxidation of carbohydrates Enzyme profile

Inhibitory test

Selective media Antibiotics Dyes

Serological Agglutination Immundiffusion

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表2-1 細菌系統分類學之種類與特性-續 (Busse et al., 1996 )

Categorie Examples

Chemotaxonomic

Fatty acids Polar lipids Mycolic acids

Lipopolysaccharide composition PAGE of lipopolysaccharide Cell wall diaminoacids

Cell wall aminoacid composition Whole cell sugars

Cellular pigments

Quinone system Polyamine content Whole cell protein PAGE

Genotypic

DNA base ration (G+C -content)

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Pulsed field gel electrophoresis of DNA fragments

DNA probe

Phylogenetic

DNA:DNA hybridization DNA:rRNA hybridization 16S rRNA sequence 23S rRNA sequence

Sequence of the β-subunit of ATP-synthase GroEL (Chaperonin) sequence

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然而以傳統培養法來研究微生物菌群，面臨了諸多限制，主要因 素是大部分的微生物仍無法以人工方式分離培養。據估計，目前可以 人工方式在實驗室培養的微生物僅佔全部微生物族群的0.1 % ~ 10 %

(Amann et al., 1995; Ranjard et al., 2000) 。圖 2-4 為微生物族群在組成和結構分析上

之步驟 (Muyzer and Smalla., 1998) 。

圖2-4 微生物族群在組成和結構分析上之步驟(Muyzer and Smalla, 1998)

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在環境工程方面，分子生物技術最廣泛的應用於鑑定生物處理系 統中活性污泥之菌相，且逐漸成為目前活性污泥微生物鑑定的主要趨 勢。目前較常應用於環工之分子生物技術包括螢光原位雜合技術 (Fluorescence in situ Hybridization, FISH)、瓊脂糖凝膠電泳法、限制酵 素 法 (T-RFLP) 、 變 性 梯 度 凝 膠 電 泳 法 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)、流式細胞儀 (Flow Cytometry)、生物晶片等。 (Amann et al., 1990;

Abughararah and Randall, 1991; Bond et al., 1995; Wagner et al., 1995; Liu et al., 1996; Regan et al., 2002)

這些應用於環工上的分子生物技術具有傳統鑑定細菌法上所不

PCR 的原理為：藉由加入適當的引子對 (primer set)、dNTP (即 為 ATP、TTP、GTP、CTP 等 DNA 的組成成分)、DNA 聚合酵素 (polymerase)等反應物，及目標序列 (template)，經一連串循環的升溫 降溫控制，使目標DNA (template)經變性反應 (Denature)、鍊合反應 (Annealing)、延長合成反應 (Extension)循環進而放大複製目標序列。

1. 變性反應 (Denaturation)：模版 DNA 在高溫狀態下，由原先互補之 兩股分離為單股DNA。

2. 鍊合反應 (Annealing)：使所加入之正向引子 (forward primer)、逆 向引子 (reverse primer)與變性後單股目標 DNA 鍊合配對。

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13 象，且反應槽中以 Flavobacterium-like bacterial 族群佔大多數，佔總 亮帶強度的50 %以上。

Miura et al.,(2007)亦表示，反應槽進流水的組成對於微生物的菌 群結構將會有很大的影響。因此，LaPara et al.,(2006)利用人工合成的 生物相是大致相同的，與 LaPara 學者之研究相符。所以，由 LaPara 與 Choi 學者的研究得知，反應槽所使用的薄膜孔徑並不影響反應槽 中的微生物相。

Jinhua et al.,(2006)提出，反應槽中懸浮生長之微生物相與薄膜表 面上附著生長之微生物相有很大的差異。薄膜表面上的微生物相以 Gammaproteobacteria 佔大多數。因學者僅提出有極大的差異，促使本 研究想進一步瞭解差異性背後所代表之意義。且學者表示薄膜表面之 微生物相以 Gammaproteobacteria 佔大多數，但 Gammaproteobacteria 是利用傳統微生物培養法能佔有優勢之族群，在利用分子生物技術監