分析方法

（一）肝臟均質液蛋白質濃度測定 1. 原理

以 Bradford protein-binding assay 的方法進行蛋白質定量，此定量方法利 用 coomassie brilliant blue G-250 會與蛋白質結合的特性，在 G-250 與蛋白質 結合後，G-250 的顏色會從紅色轉變成為藍色，此時在 595nm 波長下，會有 較高的吸收，以便偵測。這個方法的優點為 G-250 與蛋白質結合所需的時間 很短（大約 2 分鐘左右），且結合的 G-250-蛋白質複合物（complex）可在溶 液中維持較長的時間（大約 1 小時）。此法方便而靈敏（只需 10 ng sample），

可使用微量滴定盤進行分析。

2. 實驗步驟

（1）標準品濃度配置

tube BSA (L) dd water (L) Conc. (mg/mL)

A 0 100 0

B 10 90 0.1

C 20 80 0.2

D 30 70 0.3

E 40 60 0.4

F 50 50 0.5

（2）先將均質液稀釋 50 倍

（3）將 sample 和標準品取 10μL 加入 96-well

（4）在每個 well 中加入稀釋後的 Bio-Rad 染劑 20μl（Bio-Rad 原液：

dd water＝1：4）

（5）在室溫下搖晃 5 分鐘 （6）測其 OD595nm吸光值

3. 標準曲線

以標準品的濃度配置為 X 軸，所測得之標準品的吸光值為 Y 軸，即可得一 標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於 OD595nm吸光值後，依據標準曲線以內插法，代入一次

（二）肝臟均質液麩胱苷肽（Glutathione；GSH）濃度測定 1. 原理

本實驗是以 Cayman 的商業試驗套組來分析，是利用 GSH 的酵素氧化還 原系統，藉以測 glutathione reductase 活性，再以此定量 GSH 濃度。GSH 的 sulfhydryl group 會和 DNTB（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，Ellman’s reagent）反應，產生黃色的 5-thio-2-nitrobenzoic acid（TNB），而混合的 dislfide-GSTNB 會伴隨著產生，並藉由 GSH reductase 的還原再生成 GSH 和 TNB，而 TNB 的產生速率會直接和此還原的反應呈現比例關係而反應了 GSH 的濃度。

【圖 3.1】GSH 的循環反應圖

2. 實驗步驟

(1) 標準品濃度配置 Tube GSSG

std.(μL)

MES buffer final conc. (μL)

Final conc. (μL GSSG)

Equiv. total GSH(μL)

3. 標準曲線

以標準品的濃度為 X 軸，所測得之標準品的吸光值為Ｙ軸，即可得一標 準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於 OD405nm吸光值，依據標準曲線以內插法代入一次方程 式（y=ax+b）計算，則可求得 GSH 的濃度。

(三) 麩胱苷肽過氧化酶 (Glutathione Peroxidase ; GPX) 活性測定 1. 原理

本實驗是以商業套組進行分析，原理是利用 GPX 催化 H2O₂ 與 GSH 作用會使 GSH 轉變為 oxidized glutathione (GSSG)，而oxidized glutathione (GSSG) 會經由 glutathione reductase 的催化，由 NADPH 得到H⁺後再還原 成GSH。因此可由測定波長OD 340 nm下一分鐘吸光值之變化量，以此檢測 GPX

之活性。

2. 實驗步驟

(1) 在石英管中加入 10 μL 稀釋100倍的實驗樣品 (肝臟均質液)

(2) 依序加入 0.5 mL 以 buffer (phosphate buffer 0.05 mol / L ; pH 7.2 EDTA 4.3 mmol/ L)，稀釋過的reagent (glutathione 4mmol / L、glutathione reductase

≧0.5 U/l、NADPH 0.34 mmol / L )及以二次水稀釋過的 cumene

hydroperoxide 20 μL 後均勻混合，一分鐘後測定其在波長 OD_340nm之吸光 值。

(3) 第二分鐘再讀一次波長 OD_340nm 時之吸光值，求出第二分鐘及第一分鐘 所得吸光值之差 (ΔA) 後代入以下公式：

GPX activity (U /L) = 8412 × ΔA 340nm / minute × 100 (稀釋因子)

修正蛋白質後，濃度單位以 U / mg protein 表示

(四) 超氧化物歧化酶 (Superoxide Dimutase ; SOD) 活性測定 1. 原理

本實驗採用商業套組分析，原理是依據當 Xanthine 轉變為 Uric acid 的 過程當中，經由 Xanthine oxidase 的催化會有超氧陰離子的產生。此時若有 超氧化物歧化酶 (Superoxide Dimutase ; SOD) 存在便能催化超氧陰離子與 H⁺作用，得到H2O2及O2。

【圖 3.2】SOD 的循環反應圖

2. 實驗步驟

(1) 將 10 μL 的肝臟均質液和 200 μL的diluted Tetrazolium salt 注入96孔盤 (2) 加入20 μL 稀釋過後的黃嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase) 起始反應 (3) 室溫下使用 shaker 振盪反應二十分鐘後，測其 OD450nm下的吸光值

準品，再與實驗樣品同時以上述方法分析測定後，可由吸光值求出 linearized rate (LR)，LR (A) = standard (A)所測得吸光值 / standard(A)所測得吸光值 ; LR(B) = standard B 所測得吸光值/ standard A 所測得吸光值，以此類推。以 標準品活性 (U/mL)為X軸、LR為Y軸，則可得到一標準曲線。

4. 計算方式公式:

* LR (sample) = sample 所測得吸光值/ standard A 所測得吸光值

由標準曲線可得一次方程式 (y=ax+b)，以實驗樣品所測得之吸光值代入上述 公式可求得超氧化物歧化酶 (Superoxide Dimutase ; SOD) 的活性，活性單位 以 U / mg protein 表示。

(五) 腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor ; TNF-)濃度測定 1. 原理

本實驗是以商業套組進行分析，此分析方法是利用酵素接合免疫吸附法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ; ELISA) 的原理。因具TNF-α特異性的 多株抗體已附著在96孔盤上，故直接將實驗樣品(肝臟或心臟均質液)加入96 孔盤內，此時樣品內的TNF-α會與抗體產生專一性的結合而附著在96孔盤 中，移除96孔盤內的液體後再加入 biotin conjugated anti – TNF-α antibody 使 其與96孔盤內的 TNF-α 共軛結合，接著依序加入horseradish

peroxidase-labelled avidin (Avidin-HRP) 及 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB)。Avidin - HRP中的 Avidin 會結合上 biotin，由於 TMB 是過氧化酶 (Peroxidase)的受質，TMB受peroxidase 催化後會有藍色氧化產物產生。最後 加入終止劑中止反應後，即可測其 OD450nm之吸光值，代入標準曲線換算 TNF-α濃度。

2. 實驗步驟

(1) 將實驗樣品100 μL注入96孔盤中，室溫下使用shaker反應二小時後，以 wash buffer清洗各微孔五次 

(2) 各微孔加入100 μL稀釋250倍的detection antibody，室溫使用shaker反應三 小時後，以wash buffer清洗各微孔五次 ;

(3) 各微孔加入100 μL稀釋250倍的Avidin-HRP，室溫下使用shaker反應三十 分鐘後，以wash buffer清洗各微孔七次 ;

(4) 各微孔加入100 μL substrate solution，室溫下使用shaker反應十五分鐘後，

最後加入50 μL終止劑 (1N HCl) 後，在波長OD450nm下測其吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 pg / mL 之TNF-α 標準品和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為X軸、所測

得之OD450nm吸光值為Y軸，則可得到一標準曲線。

4. 計算方式

測得實驗樣品於波長 OD450nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內插法代 回一次方程式 (y=ax+b) 計算，則可求得 TNF-α 濃度，修正蛋白質後，濃度 單位以 pg / mg protein 表示。

(六)介白素-6 (Interlukin-6 ; IL-6)濃度測定 1. 原理

96孔盤中，移除96孔盤內的液體後再加入biotin conjugated anti- IL-6 antibody，使其與96孔盤內的IL-6共軛結合，接著依序加入 horseradish peroxidase-labelled avidin (Avidin-HRP) 及 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB)。Avidin - HRP中的Avidin 會與biotin結合。由於TMB是過氧化酶 (peroxidase) 的受質，故TMB受peroxidase 催化後會有藍色氧化產物產生。最 後加入終止劑中止反應，測其 OD450nm 之吸光值，代入標準曲線即可換算得 IL-6濃度。

2. 實驗步驟

(1) 將實驗樣品 (肝臟或心臟均質液) 100 μL 注入96孔盤中，室溫使用shaker 反應二小時後，以wash buffer清洗各微孔五次 ;

(2) 各微孔加入100 μL稀釋250倍的detection antibody，室溫使用shaker反應一 小時後，以wash buffer清洗各微孔五次 ;

(3) 各微孔加入100 μL稀釋250倍的 Avidin-HRP，室溫使用shaker反應三十分 鐘後，以wash buffer清洗各微孔七次 ;

(4) 各微孔加入100 μL substrate solution，室溫使用shaker反應十五分鐘後，最 後加入50 μL 終止劑(1N HCl)後在波長OD450nm下測其吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 pg / ml 之 IL-6 標 準品和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為X軸、所測得 波長 OD450nm下吸光值為Y軸，則可得到一標準曲線。

4. 計算方式

測得實驗樣品於波長 OD450nm下之吸光值後，依據標準曲線以內插法代 入一次方程式(y=ax+b)計算，再乘回稀釋倍數，則可求得 IL-6 濃度，修正蛋

白質後，濃度單位以 pg/mg protein 表示。

(七) 心臟及肝臟中三酸甘油脂(Triglyceride)濃度測定 1. 原理

脂解酶(Lipase)將三酸甘油脂水解成甘油及脂肪酸，甘油經由

甘油激酶，ATP 作用下產生glycerol-3-phosphate及ADP，glycerol-3-phosphate 再經 GPO(glycerol-3-phosphate oxidase)產生過氧化氫，在過氧化酶催化下，

與 4-aminophenazone 及 4-chlorophenol 氧化成quinoneimine紅紫色物。

2. 實驗步驟

將 5μl 的心臟或肝臟均質液及標準品加入含有 pipes buffer、magnesium ion、4-chloro phenol、4-aminoantipyrine、ATP、Lipase、glycerol-kinase、

glycerol-3-phosphate oxidase、peroxidase 溶液中，混合均勻，在 37°C 恆溫 下反應5分鐘，於波長 OD500nm 吸光值下，測定三酸甘油酯濃度。

3. 計算

三酸甘油酯濃度(mg/dL)=均質液樣品吸光值/標準品吸光值× 200

(八) 心臟及肝臟中膽固醇(Cholesterol)濃度測定 1. 原理

先以膽固醇酯水解酶，將膽固醇酯水解成游離膽固醇，再利用膽固醇氧 化酶分解膽固醇產生過氧化氫，然後在過氧化酶催化下，4-aminoantipyrine 及phenol 氧化成quinoneimine紅紫色物。

4-aminoantipyrine、cholesterol esterase、cholesterol oxidase、peroxidase 溶液 中，混合均勻，在 37°C恆溫箱中反應5分鐘，於波長 OD500nm 吸光值下，測 定膽固醇濃度。

3. 計算

膽固醇濃度(mg/dL)=均質液樣品吸光值/標準品吸光值× 200

(九) 血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol)濃度測定 1. 原理

先將具有特異選擇性的強離子緩衝液與表面活性劑作用於血清中CM、

VLDL、HDL，所釋放出的膽固醇再經由膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的 催化反應下生成H2O2，H2O2被過氧化氫酶分解為H2O2和O2。然後，在另一表 面活性劑的作用下，LDL顆粒中的膽固醇被釋放出來，作用於偶聯劑DSBmT (2: N,N-bis [4-sulfhobutyl]- m-Toluidine- disodium )產生呈色反應。

2. 實驗步驟 (1) 第一部份：

將 5 μL 的心臟與肝臟均質液及標準品加入含有 pipes buffer、phenol、

4-aminoantipyrine、cholesterol esterase、cholesterol oxidase、peroxidase 溶 液中，混合均勻，在 37°C 恆溫箱中反應 5 分鐘。

(2) 第二部份：

加入 100 μl 的 Buffer (DSBmT 1.2%) 100 mmol/L (pH 7.0)和 DSBmT，產生 呈色反應。

3. 計算

低密度脂蛋白膽固醇濃度(mg/dL)=均質液樣品吸光值/標準品吸光值×

標準品濃度(mg/dL)

(十) 丙二醛 (Malondialdehyde；MDA) 濃度測定 1. 原理

利用脂質過氧化會產生的降解產物 MDA 在酸性環境下會與二分子的 thiobarbituric acid (TBA) 發生縮和反應，形成一粉紅色產物 thiobarbituric acid reactive substances (TBARs)。因此，可測其在波長 OD532nm 時的吸光值，

做為檢驗 MDA 濃度之分析。

2. 實驗步驟

(1) 取樣品 1 mL 加入 30% Trichloroacetic acid (TCA) 1 mL (2) 12000 rpm 離心 10 分鐘後取上清液 500 μL

(3) 500 μL 上清液加入等量之 0.85 % TBA 溶液，在100°C下水浴 20 分鐘 (4) 測定樣品在 532 nm 之吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 0、0.2、1、2、5、10 μM 之 MDA 標準品 Trimethyl phoshite (TMP) 和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為X軸、所測

得之OD532 nm 吸光值為Y軸，則可得到一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於OD532nm波長下之吸光值後，依據標準曲線以內插法代入 一次方程式 (y=ax+b) 計算後，再乘回稀釋倍數10倍，即可求得丙二醛(MDA)

(十一) 總抗氧化濃度測定 ( Antioxidant ) 1. 原理

首先利用ABTS(2,2’-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid])與 metmyogloloin及peroxidase反應，會產生ABTS^{· +}。此為一相當穩定藍綠色物 質，於波長734 nm 有吸收波峰。抗氧化劑的加入會抑制此顏色的產生，因此 吸光值愈低，抗氧化效果愈佳。sample 依其清除自由基之能力作為總抗氧化 濃度之測定。

2. 實驗步驟

取 peroxidase、ABTS溶液以及 metmyogloloin混合均勻，待產生安定藍 綠色之ABTS^{· +}陽離子自由基後，加入不同濃度的 trolox 樣品，以分光光度 計測734 nm之吸光值，做成 trolox 之檢量線。樣品的檢測同上，測得後再由 trolox 的檢量線，換算其相當的濃度(mM)。

3. 計算

總抗氧化濃度(mM) =

（樣品的平均吸光值  y軸截距）/斜率(-1.478) 稀釋倍數(10)