利用專一性 dsRNA 所產生的特定基因靜默化試驗 Trx 對白點症病毒感染蝦 體過程當之影響

最後我們針對白點症病毒在感染蝦體的過程中是否需要 Trx 進行試驗，

首先利用體外合成的 Trx 雙股將蝦體中的 Trx 產生基因靜默化效果，在前驅 試驗當中，高劑量(5 μg/每克蝦)的 Trx dsRNA 注射蝦體雖然能抑制 Trx 基因 的表現，但同時也容易造成蝦體的死亡，故在本試驗中以 1μg/每克蝦的劑量 對蝦體進行施打；在以 Trx dsRNA 注射 48 小時後，結果如圖十七(A)所示，

RT-PCR 的結果顯示在鰓組織中 Trx 的基因表現比起對照組(PBS injection only 與 EGFP dsRNA)有明顯的下降；接續以白點症病毒進行兩組的攻毒試驗，一 組攻毒試驗的目的在觀測白點症病毒複製數目的差異，另一組的目的是觀測 死亡率的變化，結果如圖十七(B)與圖十七(C)所示，經白點症病毒感染三天 後 dsTrx-WSSV 組別其白點症病毒複製數目與 dsRNA 控制組(dsEGFP-WSSV) 相較之下有顯著性的降低(p<0.01)，而死亡率亦會在攻毒第四天之後有顯著性 的降低(p<0.01 與 p<0.005)，結果顯示在白點症病毒感染蝦體的過程當中需要 宿主的 Trx 來增進白點症病毒的致病力(pathogenicity)。

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五、討論:

Trx 基本特性之論述

Trx 為普遍性存在的一個蛋白質，從原核生物至真核生物皆擁有此蛋白，最 初在大腸桿菌體內發現 Trx 時，功能為氫離子及電子的提供者 (Hydrogen Donor) 並參與去氧核糖核苷酸 (Deoxyribonucleotides) 之合成(31)。但隨著研究發現 Trx 其功能與角色非常的多樣化，在細胞外時具有促進細胞生長發育的功能，為一種 促 細 胞 生 長 因 子 (cell growth factor) ； 在 細 胞 質 當 中 主 要 功 能 為抗 氧 化 劑 (antioxidant) 以及胞內還原劑之輔因子 (reductant cofactor)；在細胞核內主要功能 為調控轉錄因子之活性(25)，雖然 Trx 本身缺少入核訊號 (nuclear localization sequence)，但當生物體或是細胞遭受到不同種類的逆境壓力 (stress) 時，如當細 胞受到雙氧水的處理(49)、UV 光的照射(50)、缺氧處理(hypoxia)(9)或是抗癌藥物 cisplatin 的處理時(71)，皆會導致 Trx 有入核的情況產生，進而利用本身還原蛋 白的特性幫助轉錄因子維持其還原態，使轉錄因子可以與目標基因啟動子區域結 合。在細胞株實驗當中更進一步的發現，當過量表現 Trx 蛋白時，Trx 在細胞質 中會抑制 Iκ-B 蛋白的降解，進而抑制 NF-κB 的表現，但當 Trx 進入核內時，會 直接增進 NF-κB 的活性(23)，以此結果而言，Trx 在細胞質中與在細胞核內對於 NF-κB 是扮演著相對立的功能。

在圖四中序列分析的結果顯示，草蝦 Trx 開放轉譯區大小為 315 bp，其蛋白 質分子量大小約為 10 kDa，並且草蝦(P. monodon)、白蝦(L. vannamei)與中國對 蝦(F. chinensis)三者 Trx 胺基酸相似度均超過 90 %，雖然與人類 Trx-1 僅有約 50%

的胺基酸相似度，但仍具有四個 Cysteine (-Cys³²-Cys³⁵-Cys⁶²-Cys⁷³-)並活性作用 區位依舊為高度保守性的 CxxC motif (-Cys³²-Cys³⁵-)； Trx 會自發性的藉由兩 Trx 的 Cys⁷³相互鍵結而形成雙單元(homodimer) (78)，並且雙單元的 Trx 會失去促進 細胞生長的能力，針對促生長因子這個角色而言，反而可以利用點突變的技術產 製 Cys⁷³→Ser⁷³的 Trx，將有利於維持 Trx 促進細胞生長的能力(15)。人類 Trx-1

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總有有五個 Cysteine (-Cys³²-Cys³⁵-Cys⁶²-Cys⁶⁹-Cys⁷³-)，除了 CXXC motif 之外尚 含有另外三個 Cys，分別位於 Cys⁶²、 Cys⁶⁹與 Cys⁷³，目前的研究皆指出這三個 Cys 各自擁有不同的功能，目前較為被接受的是 Trx 會藉由 Cys⁷³形成分子間的 雙硫鍵以產生 Trx 的雙聚體、與 Trx 會藉由-Cys⁶²-Cys⁶⁹-形成第二對分子內的雙 硫鍵，並且這對雙硫鍵亦受氧化還原的調控 (19,77)；但除了雙硫鍵的形成之外，

亦有研究報告指出在體外試驗的模式中這三個 Cys 可以進行 S-nitrosylation 反應 (17,19)，並調控著 Trx 本身的功能以及後續的生物反應路徑(60)。而蝦類的 Trx 相較於人類 Trx 缺少了 Cys⁶⁹，故蝦類 Trx 是否會有第二對分子間的雙硫鍵鍵結 目前仍不清處，而蝦類 Trx 的 Cys⁶²與 Cys⁷³是否亦可進行 S-nitrosylation 反應目 前也尚未有任何的研究報告出現。

在大腸桿菌進行的研究發現，過氧化氫會造成體內受質蛋白雙硫鍵的形成，

而 Trx 可以有效將這些因為過氧化氫處理後失去活性的受質蛋白還原並恢復其 活性，甚至 Trx 活性效率比 DTT 還要更加快速，換句話說，Trx 在體內亦是一個 即有效率的自由基移除系統(62)。

從文獻顯示，雖然 Trx 已經被研究有超過 50 年的歷史，但近年來還是一直 不斷有關於 Trx 的新功能或是新的 Trx 生物反應路徑被發現，在不同的生物體內 Trx 所作用的受質分子也會稍有不同，例如生物體內氧化態的 Prx 需要藉由 Trx system(Trx-1)幫忙進行還原作用，但在果蠅中發現，果蠅的 Trx-2 才是 Prx 的受 質分子，並非如同哺乳動物系統中的 Trx-1(5)。

另外也有越來越多的証據顯示，Trx system 與 Grx system 會有 cross-talk 的 可能性，利用放射線標定過後的 GSH 與細胞株進行培養後的體外試驗中發現，

Trx 會利用 Cys⁷³與 GSH 進行結合(glutathionylation, Trx-S-SG)，而 Trx-S-SG 除了 會失去將 insulin 還原的酵素活性之外，即使 Trx reductase 與 NADPH 亦無法回復 Trx-S-SG 的酵素活性(6)；而在缺少 GR 酵素活性的果蠅品系之中，原本預期在 氧化劑的處理後會因為無法藉由 GR 讓 GSSG 還原為 GSH 而造成 GSSG 的累積，

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但在此試驗中發現 Trx 可以將 GSSG 還原為 GSH，直接參與 Grx system 的調控 (29)。

白點症病毒的 CXXC motif

有些病毒會攜帶自己的 Glutaredoxin 或是 thioredoxin 基因，如同屬於痘病毒 科的 Vaccinia virus 與 Ectromelia virus；或是藻類病毒(chlorella virus)與 T4 phage (1,4,11,16,55,79)(或是於 pubmed 的蛋白資料庫中搜尋”virus thioredoxin”)，故 對於白點症病毒而言，有很大的可能性會有白點症病毒自己的氧化還原調控相關 基因，對於尚為有註解但是有 CxxC motif 的蛋白當中，有些 ORF 可能為氧化還 原 相 關 蛋 白 ， 如 WSSV240 (AAL89108.1) ， 其 胺 基 酸 序 列 具 有 通 常 在 Nucleoredoxin 其活性區位的 CPPC motif (30)；另外如 WSSV009 (AAL88877.1) 以及 WSSV263 (AAL89131.1)，其 CxxC motife 剛好皆坐落於-Cys³²-Cys³⁵-；

WSSV187 (AAL89055.1)，與 Vaccinia virus 之 thioredoxin-like 蛋白(YP_232963.1) 有相同的 CxxC motif 位置，皆位於 Cys¹³-Cys¹⁶；另外氧化還原蛋白(如 GSH、GSSG、

Grx 與 Trx)其分子量通常都在 10 kDa 左右，如果搭配 pubmed 中其它病毒所攜 帶的 thioredoxin-like 基因來看，其序列大約在 150 個胺基酸上下，故我們可以先 將 WSSV 在 20 kDa 以內的 ORF 進行鑑定，而符合這些條件的有 WSSV022、

WSSV032、WSSV060、WSSV107、WSSV114、WSSV150、WSSV158、WSSV163、

WSSV181、WSSV187、WSSV199、WSSV216、WSSV225、WSSV258、WSSV263、

WSSV303、WSSV328、WSSV346、WSSV371、WSSV389、WSSV438、WSSV456、

WSSV464、WSSV493 與 WSSV527。

Trx 與 IE1 之蛋白-蛋白交互作用

根據 Wang 等人的研究指出 Trx 亦會調控肌動蛋白(actin)其氧化還原的狀態，

且在有氧化壓力(oxidative stress)存在下時會增進與 Trx 的蛋白-蛋白交互作用，更

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進一步 Wang 等人利用點突變技術構築不同 Cys 突變的 Trx 突變株後進行共免疫 沉澱分析法後可以發現，Trx 與 actin 蛋白交互作用之機制並非藉由 Trx 中 Cys³² 或 Cys³⁵與肌動蛋白產生鍵結，而是藉由 Trx 上 Cys⁶²與肌動蛋白產生蛋白交互 作用(75)，我們也在 Trx 與 IE1 的蛋白-蛋白交互作用中發現類似的狀況；如圖六 及圖七所示， diamide 是具專一性可催化雙硫鍵形成的氧化劑，在有 diamide 一 同反應的情況下，Trx 可以跟 IE1 產生專一性的鍵結，原本我們預測此專一性鍵 結是透過 Trx 本身的活性作用區位 Cys³²-x-x-Cys³⁵與 IE1 產生蛋白交互作用，但 以活性區位雙點突變株的 Trx 在有 diamide 存在下仍可以跟 IE1 產生蛋白交互作 用，只有包含 Cys⁶²的三點突變株 tmTrx 與全部 Cys 皆突變為 Ser 的 qmTrx 才會 造成與 IE1 蛋白交互作用的失去，這個結果証實 Trx 的 Cys⁶²對於 Trx 與 IE1 產 生蛋白-蛋白交互作用是重要的胺基酸，並這裡會產生兩種推論，在有 diamide 的情況下，Trx 與 IE1 是直接透過雙硫鍵進行鍵結，另一種推論為將 Cys⁶²突變 為 Ser 後會對 Trx 的結構產生改變，使其就算有 diamide 的狀況下其結構亦無法 與 IE1 結合，要解開這個問題，可利用 X-ray 晶體繞射解出結構方面著手。而雖 然在本篇論文中只驗証了 Trx 與 IE1 的蛋白交互作用，但亦有極高的可能性在另 外的 69 個具有 CxxC motif 的白點症病毒 ORF 中，還會有可以與 Trx 產生不論是 蛋白交互作用或是功能上受到比此調控的 ORFs，這些都可以提供其他蝦類學者 一個研究的方向。

IE1 與 DNA 結合能力的調控機制

病毒本身極早期基因之表現主要是利用宿主細胞內蛋白質的調控，在先前由 Liu 等人已經証實蝦轉錄因子 STAT 可與白點症病毒 ie1 啟動子區域結合且使下 游基因表現(42)，並且還可以與宿主體內的 TATA-box 結合蛋白產生蛋白-蛋白交 互作用(41)，但 IE1 本身又是怎麼樣被調控直到本篇論文始有初步的探討(27)；

蛋白質本身二硫醇與二硫化物(dithiol-disulfide)的轉換會導致蛋白質的構型不同，

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進而影響到蛋白質的功能(24)，故以本篇 EMSA 試驗的結果得知，白點症病毒 IE1 本身的調控是受到氧化還原反應的影響，在氧化態時會失去活性，而 Trx 其功能 與 DTT 相近，能針對硫醇-二硫化物之雙硫鍵進行氧化還原反應，故推論白點症 病毒 IE1 應可以利用宿主的 Trx 幫助其恢復或維持還原態的構型而保有與 DNA 結合的能力，這也是繼細胞內源性的 Trx 可以為第一型單純疱疹病毒之氫離子提 供者 (Hydrogen Donor)並參與病毒本身去氧核糖核苷酸 (Deoxyribonucleotides) 之合成後(8)，我們認為可以用 WSSV IE1 來証實宿主本身的 Trx 還可以直接參與 病毒轉錄因子的活性調控。

許多轉錄因子與 DNA 結合的活性主要藉由 Zinc finger motif 所調控，Zinc finger motif 又是由 Cysetine/Histidine 所構成，而在 IE1 胺基酸序列進行分析之 結果顯示 IE 含有九個半胱氨酸之外並具有 Cys2/His2-type zinc finger motif，但依 先前 Lui 等人的研究指出(46)，雖然此一區位有可能對轉錄因子與 DNA 結合的 能力扮演關鍵性的角色，但在針對 IE1 Zinc finger motif 之 Cysteine 進行點突變後 進行 EMSA 試驗分析結果顯示，Cys^{189, 194}→Ala^{189, 194}之 IE1 突變株仍保有與 DNA 結合的活性，以及在另外的 EMSA 試驗中，不論有無添加 Zinc，皆不會影響到 IE1 對 DNA 結合的活性(45)，由此結果推論出 IE1 與 DNA 結合的能力不是透過 Zinc finger motif 進行調控。在本篇論文中，我們試圖產製七種不同的 IE1 突變株，

但在純化重組蛋白時碰到很大的困難，IE1 原本就是一個很不穩定的蛋白質，以 大腸桿菌進行表現時可以拿到大量且純度佳的 GST-IE1 融合蛋白，但當以 thrombin 截切移除 GST 蛋白後，IE1 即使保存在有 1 mM DTT 的緩衝液中其活

但在純化重組蛋白時碰到很大的困難，IE1 原本就是一個很不穩定的蛋白質，以 大腸桿菌進行表現時可以拿到大量且純度佳的 GST-IE1 融合蛋白，但當以 thrombin 截切移除 GST 蛋白後，IE1 即使保存在有 1 mM DTT 的緩衝液中其活