影響其在植物體內的含量。許多研究利用環境逆境(stress)如水分逆境、溫度逆境 及照射紫外光等方式來誘發各種植物防禦素的生成，進而提高植株的藥效或其他 利用價值。本研究利用四個不同海拔高度的栽培地點種植虎杖，藉由各不同的環 境因子影響虎杖中白藜蘆醇的濃度，並進行相關性分析與生長調查，期望能找出 生產虎杖提取優良白藜蘆醇的栽培環境條件。
第二章 前人研究
一、虎杖概述
虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.，屬於蓼科蓼屬植物，藥材名虎杖。
別名本川七、土川七、紅肉川七、紅三七。為多年生灌木狀草本，葉廣卵形，全 緣或深波狀起伏，具柄，托葉鞘短。圓錐花序，密集著生於枝端或腋生，雌雄異 株，花多數，白色，花被5 裂，具闊翅；雄花雄蕊 8 枚；雄花子房卵形，具三稜。
瘦果三角狀，具宿存之翅狀花被。有利尿、通經、鎮痛、解毒之效。治月經不調、
產後瘀血腹脹、小便不通、跌打傷、小兒發育不良等(張，2007)。
虎杖藥材主要生產於中國大陸的山東、河南、浙江、四川、貴州等地，遼寧 省和大連地區也有分佈。台灣的野生虎杖主要則分布在海拔1800 公尺以上的高 山地帶。由於在中國大陸的野生虎杖遭到大量濫採，再加上其主要藥用部位為地 下部，在過度採集的情況下數量已經大量減少(潘和王，2008)。
二、虎杖主要活性成分
中藥虎杖為蓼科植物虎杖的乾燥根莖及根，性微寒、味微苦，具去風瀝濕、
散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖含蔥醌類、二苯乙烯類(芪類) 、酚類、黄酮
3
類等多種成份，其中二苯乙烯類主要為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷(虎杖苷) ，蒽醌 類主要以大黄素、大黄素甲醚為代表，也含有多種蒽醌苷(王等，2006)。
以上的成分具有良好的抑菌效果，以虎杖萃取液、白藜蘆醇苷、大黃素作為 添加物，可明顯抑制芽孢桿菌(B. cereus)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、腸炎桿菌 (S. anatum)的生長，使其空腔化或細胞壁畸形(Shan et al., 2008)。
由於其良好的抑菌效果，因此民間也有使用虎杖萃取液來進行牙齒保健，可 以有效抑制鏈球菌(Streptococcus)在口腔內滋生，降低牙菌斑數量，有助口腔保 健衛生 (Song et al., 2007)。
Chang 等人於 2005 年利用虎杖的酒精和水萃取液，進行抑制 B 型肝炎病毒 株的試驗，結果不論酒精或水萃取液皆具有良好抑制效果，研究指出甚至能促進 T 細胞(cytotoxic T cell)攻擊受 B 型肝炎病毒感染的細胞。
三、白藜蘆醇概述
白藜蘆醇化學名為芪三酚，分子式C
14
H12
O3
，分子量為228.25，屬於類二苯 乙烯(stilbenoids)化合物，與類黃酮(flavonoids)、木脂素(lignins)及綠原酸類 (chlorogenic acid derivatives)一樣屬於多酚類(polyphenols)物質，為一種植物防禦 素。類二苯乙烯生合成路徑由莽草酸（shikimic acid pathway）生成 phenylalanine，
再經由phenylalanine ammonia lyase（PAL）作用成為 trans-cinnamic acid。經 cinnamate-4-hydroxylase（C4H）氧化反應後形成 p-coumaric acid，再經過 4- cinnamate:CoA ligase（4CL）形成 p-coumaric-CoA。經過 stilbene synthase（STS）
作用使一莫耳的p-coumaroyl-CoA 與三莫耳的 malonyl-CoA 生成類二苯乙烯物質
（Liswidowati et al., 1991；Signorelli and Ghidoni, 2005）。
白藜蘆醇以游離態和糖苷結合態兩類形式存在於植物中，植物中主要以反式
4
存在，反式活性大於順式；白藜蘆醇還具有其二聚體（ε-Viniferin）、三聚體（α -Viniferin）的形態，其功能也類似 trans-resveratrol，糖苷結合形式最常見的是在 側鏈結合一個單糖基的白藜蘆醇苷(piceid) (Signorelli and Ghidoni, 2005)。白藜蘆 醇和白藜蘆醇苷即是虎杖的主要藥效成分，白藜蘆醇苷在腸道中會因糖苷酶作用 而分解，釋放出白藜蘆醇由人體吸收。
白藜蘆醇首次分離出來是在1940 年，直到 1967 年才確認了葡萄中確實含有 該成份，並在1992 年確認紅酒含有豐富的白藜蘆醇，並引起研究者們對其影響 心血管疾病功效的興趣(Laleh Golkar et al., 2007)。
研究指出白藜蘆醇具強烈抗氧化力，有助降低血管中低密度脂蛋白固醇 (low-density lipoprotein–cholesterol)氧化和血小板聚合(platelet aggregation)的情況，
有保護心血管預防心血管疾病的作用(Manika and Dipak,2010)。
利用治癌物二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DENA)注射於小鼠誘發肝癌進 行試驗，每天除DENA 外，於飲水中給予 50 到 300 毫克的白藜蘆醇連續 20 週，
結果顯示持續攝取適量白藜蘆醇，有助減少肝癌細胞的數量，攝取越多的組別其 癌細胞減少越明顯(Bishayee et al., 2010)。
添加 100 μm 白藜蘆醇於 S2-013 和 CD18 兩種肝癌細胞株的培養中，在 24 小時內可較控制組顯著降低肝癌細胞數量，並持續有效至 72 小時(Laleh Golkar et al., 2007)。
另外白藜蘆醇也被證明對癌症有強力的化學預防（chemopreventive）作用，
唯其確切機制尚不清楚。推測白藜蘆醇能使細胞凋亡基因 P53 活躍，進而消除因 喪失功能或突變而無法自然死亡並增殖的癌細胞。因此白藜蘆醇及其衍生物可開 發作為副作用較小的癌症治療方式，深具發展潛力（Dong ,2003）。
除上述的抗氧化以及腫瘤的功效外，白藜蘆醇還具類似雌激素的作用，有預 防女性骨質疏鬆症的功效(Goswami and Das, 2009; Signorelli and Ghidoni,
2005)。
5
四、植物防禦素介紹
植物防禦素是當植物遭受天敵攻擊、真菌感染或環境嚴苛等逆境(stress)時，
產生用來抵抗的物質，藉此增加植物的環境適應能力或抗病性。以生物合成路徑 來看，是以一次代謝物(primary metabolites)為原料，因此被稱作二次代謝物 (secondary metabolites)。
依合成途徑及種類可分為萜類(terpenoids)、生物鹼(alkaloids)和多酚類。依對 抗外來威脅之方式，可分為組成型(constitutive)及誘導型(inducible)。組成型物質 在植物未受感染前就先合成，可隨時對抗入侵物，又稱為植物抗毒素
(phytoanticipins)。誘導型物質則為受生物或非生物逆境之誘發而產生，平常在植 物體內含量極低幾乎無法偵測到，又稱為植物防禦素。植物防禦素與抗毒素最大 的不同在於，防禦素平時在植物體內含量低微難以測量，但可以經由外界的刺激 而誘導其含量增加，而抗毒素只能維持相同水平而無法誘導。在生理活性方面，
植物防禦素若由多酚類物質所構成，則可能具有清除自由基或抗腫瘤功效(鄭和 古，2007)。
五、栽培環境影響白藜蘆醇含量之研究
利用逆境來影響植物體內的二次代謝物含量是可行的，包括白藜蘆醇在內的 許多二次代謝物，都可以利用這類的方式在栽培時給予逆境，以增加目標代謝物 的產量。
(1)水分
種植於法國同一地區的葡萄(Palomino fino)，連續兩年進行在乾旱和正常降 雨年份所產果實的白藜蘆醇含量分析。乾旱年份果實的白藜蘆醇含量平均為65.5 nmol/berry，是正常降雨年份的兩倍並且有較多的有機酸含量(ROLDAÄN et al., 2003)。
6
(2)溫度
Chung 等人於 2006 年以地黃(Rehmannia glutinosa)栽培於 15℃時，較 35℃
者有較高的白藜蘆醇含量，但增加的量並未達顯著水準，推測和地黃具有的耐寒 性有關。其他酚類物質和水楊酸成分，也和白藜蘆醇的提升狀況一致。
(3)真菌感染
Langcake 於 1981 年利用不同抗病力的兩個葡萄栽培種(Vitis vinifera 和 Vitis
riparia)，接種露菌病(Plasmopara vitieola)於葉片，經過病斑檢測能發現抗病力較
強的 Vitis riparia 有較高的白藜蘆醇含量。隨著葉片接種病原後的天數增加，白 藜蘆醇含量也跟著增加，並且 Vitis riparia 能在接種後於較短的時間內就能有較 多的白藜蘆醇含量提升。
(4)紫外線
利用2.15、4.30和6.45 千焦耳的紫外線處理藍莓(Vaccinium corymbosum L.)，
隨著紫外線強度的提高，藍莓內含的白藜蘆醇濃度也隨著提高。但在6.45千焦耳 下處裡的藍莓卻因為傷害過強反而使白藜蘆醇量降低 (Wang et al., 2009)。
將花生幼苗(Arachis hypogaea L.)以 254nm 之紫外光照射處理，白藜蘆醇含 量於照射後12 小時達到最大量，而後隨著時間漸減。二苯乙烯調控基因也在 12 小時有最大活性，並且隨時間經過而降低活性。經紫外光照射後的花生苗會因為 傷害而產生銹斑，浸泡過白藜蘆醇溶液後可以減少10% 銹斑發生面積，而浸泡 白藜蘆醇抑制劑MDCA 的組別則會增加銹斑的面積(Tang et al., 2009)。
以上研究顯示，栽培時利用不良的環境因子進行處理，如高溫、低溫、淹水、
乾旱、接種真菌、紫外線照射等方式，皆可以提升植物防禦素在植物體內的含量。
以往白藜蘆醇相關的研究，大多是在葡萄與真菌感染(灰霉菌)方面，利用其 他栽培條件來提升作物的白藜蘆醇含量則較少見。
雖然逆境處理可以提升二次代謝物的含量，但同時會造成光合作用的阻礙，
形成植物營養生長不良，乾物重減少的狀況，減少植物可採收利用的部位。
7
利用貫葉連翹 (Hypericum brasiliense)於低氧和乾旱逆境下栽種，發現低氧 和乾旱比起控制組可以有效提高樺木酸（betulinic acid）和多酚類物質含量，其 中乾旱組有比低氧組有更顯著的多酚類物質含量提升，但試驗組的採收部位生長 量都低於控制組(Abreu and Mazzafera, 2005)。
另外Chung 等人於 2003 年以花生作為材料，觀察產生白藜蘆醇的基因（RS mRNA）在植物的不同部位以及受到 salicylic acid (SA)、UV 射照、H
2
O2
、jasmonic acid 和 ethephon 等逆境處裡 24 小時候的表現。結果發現花生葉片的 RS mRNA 表 現量很低，反而根部的表現量較多，推測可能是根部為了因應土壤中較多的微生 物所致。也顯示植物不同部位的白藜蘆醇含量和受到逆境影響時的含量變化是有 差異的。因此，兼顧作物的有效部位採收量以及提取物質含量多寡，是使用逆境栽培 方式所要考慮的。
六、常見白藜蘆醇的分析方法
(一)氣相層析儀(gas chormatorphy, GC)
氣象層析儀是以高溫使樣品氣化，利用與分析物不作用的各種氣體作為移動 相、靜相來分離待測物。也常見連接於質譜儀(mass spectrometry,MS) ，利用其 原子的碰撞，藉此偵測樣品濃度和鑑別內含物質，同時做到分析物的定性和定量。
Goldberg 等人（1995）即以 GCMS 分析紅酒中的順式和反式白藜蘆醇。
GC 在使用上分為固相微萃取(SPEM)和自動進樣兩種使用方法。固相微萃取 是利用纖維做為媒介，吸附存放於頂空瓶中樣品所揮發出的氣體，再進一步上機 偵測。此法的優點是不需要製作樣品以及樣品的前處理，沒有萃取率和使用濃度 比的問題。缺點是只能以揮發性氣體作為吸附對象，無法用於高沸點的物質。
自動進樣則先以適當方法處理樣品，並以溶劑(solvent)進行待測物的溶出，
8
才能進行偵測，樣品前處理比固相微萃取複雜許多，並有濃度掌控不易的風險。
才能進行偵測，樣品前處理比固相微萃取複雜許多，並有濃度掌控不易的風險。