栽培環境對虎杖白藜蘆醇含量之影響

國立台灣大學生農學院園藝暨景觀學系 碩士論文

Department of Horticulture and landscape Architecture College of Bio-resources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

栽培環境對虎杖白藜蘆醇含量之影響

Effect of culture environment on resveratrol content of Polygonum cuspidatum.

黃柏任 Po-Jen Huang

指導教授：張祖亮 博士 Advisor：Tsu-Liang Chang, Ph.D.

中華民國 101 年 六月

June, 2012

i

誌謝

本論文從選定題目到撰寫完成為止也過了近三年的時間，從一開始對分析化 學完全不懂到完成論文，受到許多人在多方面的幫助。承蒙指導老師張祖亮博士 的各項指導和論文寫作上的協助，學生由衷感謝。感謝陳開憲博士在成份分析上 給予的意見，鍾仁彬博士提供試驗材料和論文上的修改以及陳右人出借分析儀器，

承蒙各位老師的指導讓這篇論文得以完成。

在台大求學的這三年終於順利結束了，感謝繼中學長和書妍學姐在分析化學 以及實驗進行上給予的諸多幫助以及忍受我的發問和騷擾。怡如學姊在植物生長 調查和初期實驗架構的建立上給我很多想法與意見，也感謝學姊一家能提供埔里 的試驗場所，打擾到學姊父母真是不好意思。一開始加入精溫實驗室有鴻均學長 在讓我放心很多，康康、小胖胖、心怡、怡瑛、宛玲、婉婷、智鈞等學長姊的經 驗相傳讓我能更順利習慣台大的生活。與我同級的宜潔更是我在台大生活共進退 的好同伴，信榮、志豪、婉婷、阮阮、康銘、彥佑、小侯、子軒有你們的陪同讓 精溫的生活歡樂不少，另外要感謝在春陽和梅峰場區給我無數方便的芳瑜學姊、

蜀龍和雅芳姊，以及2531 的真如和美玲姊在實驗和儀器操作上給予的幫助與經 驗。

最後更要感謝我的父母和弟弟，家人給我在精神和生活上無數的支持是我很 大的助力，甚至外出採樣時還要勞煩兩位協助，讓我能在無後顧之憂的情形下求 學並完成論文。

在此，僅以這篇論文見證這段時光，並獻給所有關心我與我愛的人。

黃柏任 2012 年 6 月於台大精密溫室

ii

中文摘要

白藜蘆醇(resveratrol)是一種多酚類(polyphenols)成分，屬於植物防禦素

（phytoalexin)的一種。具有抗氧化、抑制腫瘤和心血管疾病預防的作用。虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為蓼科多年生灌木狀草本，富含白藜蘆醇等 其他多酚二次代謝物，中醫上常用於治療癌症、B 型肝炎、高血壓等疾病。本研 究採用之虎杖植株，原生於南投縣仁愛鄉梅峰附近山區，由明道大學選育高白藜 蘆醇含量之單株經無性繁殖成051111 選系；具有高含量二次代謝物，除白藜蘆 醇外，尚有白藜蘆醇苷、大黃素等多種具生物活性成份。

這類植物防禦素在植物體內的含量會受到環境影響，本研究逐月探討在埔里、

台北、春陽及梅峰露地栽培虎杖，其地上部與地下部的生長情形和白藜蘆醇含量 的變化，地上部並以分級方式，研究主枝和側枝各部位間的差異。

二年生虎杖的生長情形以種植於梅峰為最佳，地上部分級採收與地下部鮮乾 重分別為55 g/part 和 401.82 g/plant，乾重 13.72 g/part 和 140.73 g/plant。白藜蘆 醇含量以台北最高，地上部與地下部分別為0.04 和 3.33 mg/g DW。採收時期為 八月時地上部與地下部皆有最高採收乾重10.59 g/part 和 118.83 g/plant，地上部 白藜蘆醇含量於五月時達最高 0.06 mg/g DW，地下部於八月達最高 3.19 mg/g DW。地上部不同部位中的生長量和白藜蘆醇含量以側枝較主枝佳，以側枝的 Part5(第 4~6 節)和 Part6(第 7 節以上)最高。評估白藜蘆醇總產量，地上部於梅峰 所產植株於七月時採摘Part6 部位最佳(1.98 mg/part)，地下部以梅峰所產於八月 採收者最佳(561.35 mg/plant)。

關鍵字：植物防禦素、多酚類、乾重、栽培地點、採收部位

iii

英文摘要

Resveratrol(,trans-3,4,5-trihydroxystilebene) is natural plant polyphenols and it is a kind of phytoalexin. It has preventative functions for cardiovascular diseases, anti-oxidative effects and anti-cancer activities.

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. belongs to Polygonaceae and is classified as

perennial shrub rich in resveratrol and other secondary metabolites. In traditional Chinese medicine, it is used for cancer, hepatitis B, hypertension and other diseases.

051111 line was derived from Meifeng and selected by Mingdao University. This line has high levels of secondary metabolites including resveratrol, piceid and emodin, etc.

The phytoalexin content in the plants will be effected by environmental factor. Studies to investigate the effects of cultivated location, seasons, harvest parts on resveratrol content and plant growth on Puli、Taipei、Chunyang、Meifong.

The growth pattern of aboveground main stem and lateral shoot had been completed for two years old P. cuspidatum.

The harvest weight showed an obviously difference between aboveground and underground. Crops two years old and cultivaled at Meifong had the highest growth and harvest parts. Fresh weight of underground parts 55 g/part and 401.82 g/plant, dry weight 13.72 g/part and 140.73 g/plant.

The highest resveratrol content was 0.04 and 3.33 mg/g DW of aboveground and underground, respectively.

Harvesting in August used 051111 line showing the dry weight of P. cuspidatum aboveground and underground had the highest（10.59 g/part and 118.83 g/plant）, the highest resveratrol content of aboveground was in May （ 0.06 mg/g DW ） , underground was in August（3.19 mg/g DW）.

iv

Harvest part showed the weight and resveratrol content of part 5 and 6 better then other.

The total resveratrol content showed crops aboveground should choice the part 6 in July at Meifong(1.98 mg/part) and underground harvest in August at Meifong(561.35 mg/plant).

Key word：phytoalexin、polyphenols、dry weight、cultivation location、harvest part

v

目錄

口試委員審定書

誌謝... i

中文摘要... ii

英文摘要... iii

表次... vii

圖次... x

第一章 前言... 1

第二章 前人研究... 2

一、虎杖概述 ... 2

二、虎杖主要藥效成分 ... 2

三、白藜蘆醇概述 ... 3

四、植物防禦素介紹 ... 5

五、栽培環境影響白藜蘆醇含量之研究 ... 5

六、常見白藜蘆醇的分析方法 ... 7

第三章 虎杖高白藜蘆醇含量選系繁殖... 9

摘要 ... 9

前言 ... 9

材料與方法 ... 10

結果 ... 11

討論 ... 12

第四章 虎杖白藜蘆醇之萃取... 16

摘要 ... 16

前言 ... 16

材料與方法 ... 17

結果 ... 20

vi

討論 ... 20

第五章 虎杖不同季節的生長量變化與形態調查... 29

摘要 ... 29

前言 ... 29

材料與方法 ... 30

結果 ... 31

討論 ... 32

第六章 虎杖不同季節與採收部位的白藜蘆醇含量和鮮乾重變化... 35

摘要 ... 35

前言 ... 35

材料與方法 ... 36

結果 ... 38

討論 ... 44

未來展望... 47 附錄

vii

表次

表1. 插穗含頂芽與否、套袋及施用 NAA 對虎杖扦插苗成活率與生長的影響 . 14 Table 1. Effect of cutting shoots with or without apical bud, bagging and NAA on survive, leaf bud and root growth of cutting Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. .. 14 表2. 單因子變方分析插穗含頂芽與否、套袋及施用 NAA 對虎杖扦插苗生長的 影響... 15 Table.2 Effect of interaction on cutting materials, bagging and NAA on survive, leaf bud and root growth of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. cutting. ... 15 表3. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對虎杖中白藜蘆醇萃取的方差分 析表... 26 Table 3. Tests of between-subjects effect of ethanol concentration、extract time、

extract temperature and mixture ratio on extraction of trans-resveratrol from

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 26 表4. L16（45）正交試驗表設計萃取虎杖的白藜蘆醇 ... 27 Table 4. L16（45）orthogonal design on extract trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 27 表5. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對萃取虎杖中的白藜蘆醇單因子 量表... 28 Table 5. Estinated marginal means of ethanol concentration、extract time、extract temperature and ratio on extraction of trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et

Zucc..………28 表6. 地點和採收時間對一年生虎杖地上部節間數、葉片數、株高與落葉數的影 響... 34 Table 6. Effect of location and harvest time on stem number, leaf number, plant height and loss leaf number of one year old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. .. 34 表 7. 地點和採收時間對一年生虎杖地上部鮮重、乾重、白藜蘆醇含量與白藜蘆 醇總量的影響... 56

viii

Table 7. Effect of location and harvest time on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of one year old Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 56 表 8. 地點和採收時間對一年生虎杖地下部鮮重、乾重、白藜蘆醇含量與白藜蘆 醇總量的影響... 57 Table 8. Effect of location and harvest time on underground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of one year old Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 57 表 9. 地點和採收時間的交感效應對一年生虎杖地上部鮮重、乾重、白藜蘆醇含 量與白藜蘆醇總量的影響... 58 Table 9. Effect of location and harvest time interaction on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of one year old

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.. ... 58 表 10. 地點和採收時間的交感效應對一年生虎杖地下部鮮重、乾重、白藜蘆醇 含量與白藜蘆醇總量的影響... 59 Table 10. Effect of location and harvest time interaction on underground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of one year old

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 59 表 11. 地點和採收時間對二年生虎杖地上部鮮重、乾重、白藜蘆醇含量與白藜 蘆醇總量的影響... 60 Table 11. Effect of location and harvest time on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 60 表 12. 地點和採收時間對二年生虎杖地下部鮮重、乾重、白藜蘆醇含量與白藜 蘆醇總量的影響... 61 Table 12. Effect of location and harvest time on underground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 61 表 13. 地點和採收時間的交感效應對二年生虎杖地上部鮮重、乾重、白藜蘆醇 含量與白藜蘆醇總量的影響... 62

ix

Table 13. Effect of location and harvest time interaction on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 62 表 14. 地點和採收時間的交感效應對二年生虎杖地下部鮮重、乾重、白藜蘆醇 含量與白藜蘆醇總量的影響... 63 Table 14. Effect of location and harvest time interaction on underground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 63 表 15. 地點、採收時間和採收部位對二年生虎杖地上部鮮重、乾重、白藜蘆醇 含量與白藜蘆醇總量的影響... 64 Table 15. Effect of location, harvest time and harvest part on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 64 表 16. 地點、採收時間和採收部位的交感效應對二年生虎杖地上部鮮重、乾重、

白藜蘆醇含量與白藜蘆醇總量的影響... 65 Table 16. Effect of interaction on location, harvest time and harvest part interaction on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 65

x

圖次

圖1. 白藜蘆醇標準品 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，滯留時間為 7.2 分鐘。

... 23 Fig. 1. HPLC chromatogram of trans-resveratrol standard detected at 305 nm,

acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min

gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min). Trans-resveratrol retention time of 7.2 min. ... 23 圖2. 虎杖地下部萃取液 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯留時間為7.2 分鐘。... 24 Fig. 2. HPLC chromatogram of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. root extract detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).Trans-resveratrol retention time of 7.2 min. ... 24 圖3. 白藜蘆醇標準品 LCMS 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯 留時間為9.59 分鐘。... 25 Fig. 3. (A)TIC of Liquid Chromatograph Mass Spectrometer from trans-resveratrol standard detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).(B)Mass ion spectrum of trans-resveratrol eluting at retention time of 9.59 min.(C) Demonstrating characteristic ion cluster of mass 229 (D)TIC of MRM with qualifier ions of mass 211 and 135. ... 25 圖4. 二年生虎杖側枝抽出節位和順序... 33 Fig 4. The side shoot growth node and sequence with main shoot of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.(no.1: the first side shoot, no.2: the second side shoot…)... 33 圖5. 一年生虎杖地上部乾重、白藜蘆醇含量和總產量的相對生長速率... 49 Fig 5. Relative growth rates (RGR) for newly emerged aboveground (A)dry weight (g g-1 month-1) (B)resveratrol content (mg mg-1 month-1) (C)total resveratrol

content(mg mg-1 month-1) of one year old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 49

xi

圖6. 一年生虎杖地下部乾重、白藜蘆醇含量和總產量的相對生長速率... 50 Fig 6. Relative growth rates (RGR) for newly emerged underground (A)dry weight (g g-1 month-1) (B)resveratrol content (mg mg-1 month-1) (C)total resveratrol content (mg mg-1 month-1)of one year old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 50 圖7. 二年生虎杖地上部乾重、白藜蘆醇含量和總產量的相對生長速率... 51 Fig 7. Relative growth rates (RGR) for newly emerged aboveground (A)dry weight (g g-1 month-1) (B)resveratrol content (mg mg-1 month-1) (C)total resveratrol content (mg mg-1 month-1)of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 51 圖8. 二年生虎杖地下部乾重、白藜蘆醇含量和總產量的相對生長速率... 52 Fig 8. Relative growth rates (RGR) for newly emerged underground (A)dry weight (g g-1 month- 1) (B)resveratrol content (mg mg-1 month-1) (C)total resveratrol content (mg mg-1 month-1)of two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 52 圖9. 虎杖栽培於(A)埔里(B)台北(C)春陽和(D)梅峰之鮮重變化 ... 53 Fig 9. Variations in fresh weight of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. cultured at ； (A) Puli (B) Taipei (C) Chunyang (D) Meifong. Form2010 May to 2011 Oct. Bars indicate standard error of the means. ... 53 圖10. 虎杖栽培於(A)埔里(B)台北(C)春陽和(D)梅峰之乾重變化 ... 54 Fig 10. Variations of dry weight of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. cultured at ； (A) Puli (B) Taipei (C) Chunyang (D) Meifong. Form2010 May to 2011 Oct. Bars indicate standard error of the means. ... 54 圖 11. (A)一年生與(B)二年生虎杖地上部與地下部乾重比 ... 55 Fig 11. Aboveground and underground dry weight ratio of (A)one year old and(B) two years old Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. ... 55 Table 7. Effect of location and harvest time on aboveground fresh weight, dry weight, resveratrol content and total resveratrol content of one year old Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc.. ... 56

1

第一章 前言

白藜蘆醇(resveratrol)為一對二苯乙烯化合物(stilbenes)，具有強烈抗氧化能力，

屬於多酚類的二次代謝物的植物防禦素(phytoalexin)。在自然界中以順式 (cis-resveratrol)和反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)以及與醣苷結合(piceid)的形式 存在。

於90 年代的西方飲食文化與心血管疾病調查研究中顯示，法國人雖處在高 熱量高脂肪的飲食環境下，心血管罹病率仍低於其他西方國家，被稱為『法國矛 盾』(French paradox) (Sun et al., 2002)。此現象引起往後一連串的相關研究，研究 後發現此現象極可能是法國人因為嗜喝紅酒，大量攝取酒中富含的多酚物質，如 白藜蘆醇、紅酒多酚等而降低心血管疾病發生(Renaud and Lorgeri,1992)。

Baur 等人於 2006 年發現給予高卡路里飲食中的小鼠，其死亡率高於控制組。

但若同時給予白藜蘆醇者，其死亡率和控制組相差無幾，並且於肝臟切片中顯示 不會有脂肪肝的情形。

Bruno 於 1999 年利用紅酒餵食大鼠顯示可有助減少血栓形成。後人深入研 究更發現紅酒中的白藜蘆醇除了能抑制心血管疾病外還具有調節免疫作用、抗氧 化、抑制腫瘤和類似雌激素的作用，可做為營療物質(nutraceuticals)保護人體健 康(Signorelli and Ghidoni, 2005； Goswami and Das, 2009) 。

已知類二苯乙烯化合物廣泛存在於松科(Pinaceae)、豆科(Leguminoaceae)、

桃金孃科(Mytaceae)、桑科(Moraceae)、殼斗科(Fagaceae)、百合科(Liliaceae)、龍 腦香科(Dipterocarpaceae)、莎草科(Cyperaceae)、買麻藤科(Gnetaceae)和葡萄科 (Vitaceae)。常見含有白藜蘆醇的植物有：藍莓、葡萄、桑葚、花生及虎杖等(Cassidy et al., 2000；Dong，2003；Beˇnova et al., 2010)。

白藜蘆醇既屬於多酚類(polyphenols)的植物防禦素，應可以利用環境變動來

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影響其在植物體內的含量。許多研究利用環境逆境(stress)如水分逆境、溫度逆境 及照射紫外光等方式來誘發各種植物防禦素的生成，進而提高植株的藥效或其他 利用價值。本研究利用四個不同海拔高度的栽培地點種植虎杖，藉由各不同的環 境因子影響虎杖中白藜蘆醇的濃度，並進行相關性分析與生長調查，期望能找出 生產虎杖提取優良白藜蘆醇的栽培環境條件。

第二章 前人研究

一、虎杖概述

虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.，屬於蓼科蓼屬植物，藥材名虎杖。

別名本川七、土川七、紅肉川七、紅三七。為多年生灌木狀草本，葉廣卵形，全 緣或深波狀起伏，具柄，托葉鞘短。圓錐花序，密集著生於枝端或腋生，雌雄異 株，花多數，白色，花被5 裂，具闊翅；雄花雄蕊 8 枚；雄花子房卵形，具三稜。

瘦果三角狀，具宿存之翅狀花被。有利尿、通經、鎮痛、解毒之效。治月經不調、

產後瘀血腹脹、小便不通、跌打傷、小兒發育不良等(張，2007)。

虎杖藥材主要生產於中國大陸的山東、河南、浙江、四川、貴州等地，遼寧 省和大連地區也有分佈。台灣的野生虎杖主要則分布在海拔1800 公尺以上的高 山地帶。由於在中國大陸的野生虎杖遭到大量濫採，再加上其主要藥用部位為地 下部，在過度採集的情況下數量已經大量減少(潘和王，2008)。

二、虎杖主要活性成分

中藥虎杖為蓼科植物虎杖的乾燥根莖及根，性微寒、味微苦，具去風瀝濕、

散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖含蔥醌類、二苯乙烯類(芪類) 、酚類、黄酮

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類等多種成份，其中二苯乙烯類主要為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷(虎杖苷) ，蒽醌 類主要以大黄素、大黄素甲醚為代表，也含有多種蒽醌苷(王等，2006)。

以上的成分具有良好的抑菌效果，以虎杖萃取液、白藜蘆醇苷、大黃素作為 添加物，可明顯抑制芽孢桿菌(B. cereus)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、腸炎桿菌 (S. anatum)的生長，使其空腔化或細胞壁畸形(Shan et al., 2008)。

由於其良好的抑菌效果，因此民間也有使用虎杖萃取液來進行牙齒保健，可 以有效抑制鏈球菌(Streptococcus)在口腔內滋生，降低牙菌斑數量，有助口腔保 健衛生 (Song et al., 2007)。

Chang 等人於 2005 年利用虎杖的酒精和水萃取液，進行抑制 B 型肝炎病毒 株的試驗，結果不論酒精或水萃取液皆具有良好抑制效果，研究指出甚至能促進 T 細胞(cytotoxic T cell)攻擊受 B 型肝炎病毒感染的細胞。

三、白藜蘆醇概述

白藜蘆醇化學名為芪三酚，分子式C

14

12

3

類二苯乙烯生合成路徑由莽草酸（shikimic acid pathway）生成 phenylalanine，

再經由phenylalanine ammonia lyase（PAL）作用成為 trans-cinnamic acid。經 cinnamate-4-hydroxylase（C4H）氧化反應後形成 p-coumaric acid，再經過 4- cinnamate:CoA ligase（4CL）形成 p-coumaric-CoA。經過 stilbene synthase（STS）

作用使一莫耳的p-coumaroyl-CoA 與三莫耳的 malonyl-CoA 生成類二苯乙烯物質

（Liswidowati et al., 1991；Signorelli and Ghidoni, 2005）。

白藜蘆醇以游離態和糖苷結合態兩類形式存在於植物中，植物中主要以反式

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存在，反式活性大於順式；白藜蘆醇還具有其二聚體（ε-Viniferin）、三聚體（α -Viniferin）的形態，其功能也類似 trans-resveratrol，糖苷結合形式最常見的是在 側鏈結合一個單糖基的白藜蘆醇苷(piceid) (Signorelli and Ghidoni, 2005)。白藜蘆 醇和白藜蘆醇苷即是虎杖的主要藥效成分，白藜蘆醇苷在腸道中會因糖苷酶作用 而分解，釋放出白藜蘆醇由人體吸收。

白藜蘆醇首次分離出來是在1940 年，直到 1967 年才確認了葡萄中確實含有 該成份，並在1992 年確認紅酒含有豐富的白藜蘆醇，並引起研究者們對其影響 心血管疾病功效的興趣(Laleh Golkar et al., 2007)。

研究指出白藜蘆醇具強烈抗氧化力，有助降低血管中低密度脂蛋白固醇 (low-density lipoprotein–cholesterol)氧化和血小板聚合(platelet aggregation)的情況，

有保護心血管預防心血管疾病的作用(Manika and Dipak,2010)。

利用治癌物二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DENA)注射於小鼠誘發肝癌進 行試驗，每天除DENA 外，於飲水中給予 50 到 300 毫克的白藜蘆醇連續 20 週，

結果顯示持續攝取適量白藜蘆醇，有助減少肝癌細胞的數量，攝取越多的組別其 癌細胞減少越明顯(Bishayee et al., 2010)。

添加 100 μm 白藜蘆醇於 S2-013 和 CD18 兩種肝癌細胞株的培養中，在 24 小時內可較控制組顯著降低肝癌細胞數量，並持續有效至 72 小時(Laleh Golkar et al., 2007)。

另外白藜蘆醇也被證明對癌症有強力的化學預防（chemopreventive）作用，

唯其確切機制尚不清楚。推測白藜蘆醇能使細胞凋亡基因 P53 活躍，進而消除因 喪失功能或突變而無法自然死亡並增殖的癌細胞。因此白藜蘆醇及其衍生物可開 發作為副作用較小的癌症治療方式，深具發展潛力（Dong ,2003）。

除上述的抗氧化以及腫瘤的功效外，白藜蘆醇還具類似雌激素的作用，有預 防女性骨質疏鬆症的功效(Goswami and Das, 2009; Signorelli and Ghidoni,

2005)。

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四、植物防禦素介紹

植物防禦素是當植物遭受天敵攻擊、真菌感染或環境嚴苛等逆境(stress)時，

產生用來抵抗的物質，藉此增加植物的環境適應能力或抗病性。以生物合成路徑 來看，是以一次代謝物(primary metabolites)為原料，因此被稱作二次代謝物 (secondary metabolites)。

依合成途徑及種類可分為萜類(terpenoids)、生物鹼(alkaloids)和多酚類。依對 抗外來威脅之方式，可分為組成型(constitutive)及誘導型(inducible)。組成型物質 在植物未受感染前就先合成，可隨時對抗入侵物，又稱為植物抗毒素

(phytoanticipins)。誘導型物質則為受生物或非生物逆境之誘發而產生，平常在植 物體內含量極低幾乎無法偵測到，又稱為植物防禦素。植物防禦素與抗毒素最大 的不同在於，防禦素平時在植物體內含量低微難以測量，但可以經由外界的刺激 而誘導其含量增加，而抗毒素只能維持相同水平而無法誘導。在生理活性方面，

植物防禦素若由多酚類物質所構成，則可能具有清除自由基或抗腫瘤功效(鄭和 古，2007)。

五、栽培環境影響白藜蘆醇含量之研究

利用逆境來影響植物體內的二次代謝物含量是可行的，包括白藜蘆醇在內的 許多二次代謝物，都可以利用這類的方式在栽培時給予逆境，以增加目標代謝物 的產量。

(1)水分

種植於法國同一地區的葡萄(Palomino fino)，連續兩年進行在乾旱和正常降 雨年份所產果實的白藜蘆醇含量分析。乾旱年份果實的白藜蘆醇含量平均為65.5 nmol/berry，是正常降雨年份的兩倍並且有較多的有機酸含量(ROLDAÄN et al., 2003)。

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(2)溫度

Chung 等人於 2006 年以地黃(Rehmannia glutinosa)栽培於 15℃時，較 35℃

者有較高的白藜蘆醇含量，但增加的量並未達顯著水準，推測和地黃具有的耐寒 性有關。其他酚類物質和水楊酸成分，也和白藜蘆醇的提升狀況一致。

(3)真菌感染

Langcake 於 1981 年利用不同抗病力的兩個葡萄栽培種(Vitis vinifera 和 Vitis

riparia)，接種露菌病(Plasmopara vitieola)於葉片，經過病斑檢測能發現抗病力較

強的 Vitis riparia 有較高的白藜蘆醇含量。隨著葉片接種病原後的天數增加，白 藜蘆醇含量也跟著增加，並且 Vitis riparia 能在接種後於較短的時間內就能有較 多的白藜蘆醇含量提升。

(4)紫外線

利用2.15、4.30和6.45 千焦耳的紫外線處理藍莓(Vaccinium corymbosum L.)，

隨著紫外線強度的提高，藍莓內含的白藜蘆醇濃度也隨著提高。但在6.45千焦耳 下處裡的藍莓卻因為傷害過強反而使白藜蘆醇量降低 (Wang et al., 2009)。

將花生幼苗(Arachis hypogaea L.)以 254nm 之紫外光照射處理，白藜蘆醇含 量於照射後12 小時達到最大量，而後隨著時間漸減。二苯乙烯調控基因也在 12 小時有最大活性，並且隨時間經過而降低活性。經紫外光照射後的花生苗會因為 傷害而產生銹斑，浸泡過白藜蘆醇溶液後可以減少10% 銹斑發生面積，而浸泡 白藜蘆醇抑制劑MDCA 的組別則會增加銹斑的面積(Tang et al., 2009)。

以上研究顯示，栽培時利用不良的環境因子進行處理，如高溫、低溫、淹水、

乾旱、接種真菌、紫外線照射等方式，皆可以提升植物防禦素在植物體內的含量。

以往白藜蘆醇相關的研究，大多是在葡萄與真菌感染(灰霉菌)方面，利用其 他栽培條件來提升作物的白藜蘆醇含量則較少見。

雖然逆境處理可以提升二次代謝物的含量，但同時會造成光合作用的阻礙，

形成植物營養生長不良，乾物重減少的狀況，減少植物可採收利用的部位。

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利用貫葉連翹 (Hypericum brasiliense)於低氧和乾旱逆境下栽種，發現低氧 和乾旱比起控制組可以有效提高樺木酸（betulinic acid）和多酚類物質含量，其 中乾旱組有比低氧組有更顯著的多酚類物質含量提升，但試驗組的採收部位生長 量都低於控制組(Abreu and Mazzafera, 2005)。

另外Chung 等人於 2003 年以花生作為材料，觀察產生白藜蘆醇的基因（RS mRNA）在植物的不同部位以及受到 salicylic acid (SA)、UV 射照、H

2

2

因此，兼顧作物的有效部位採收量以及提取物質含量多寡，是使用逆境栽培 方式所要考慮的。

六、常見白藜蘆醇的分析方法

(一)氣相層析儀(gas chormatorphy, GC)

氣象層析儀是以高溫使樣品氣化，利用與分析物不作用的各種氣體作為移動 相、靜相來分離待測物。也常見連接於質譜儀(mass spectrometry,MS) ，利用其 原子的碰撞，藉此偵測樣品濃度和鑑別內含物質，同時做到分析物的定性和定量。

Goldberg 等人（1995）即以 GCMS 分析紅酒中的順式和反式白藜蘆醇。

GC 在使用上分為固相微萃取(SPEM)和自動進樣兩種使用方法。固相微萃取 是利用纖維做為媒介，吸附存放於頂空瓶中樣品所揮發出的氣體，再進一步上機 偵測。此法的優點是不需要製作樣品以及樣品的前處理，沒有萃取率和使用濃度 比的問題。缺點是只能以揮發性氣體作為吸附對象，無法用於高沸點的物質。

自動進樣則先以適當方法處理樣品，並以溶劑(solvent)進行待測物的溶出，

8

才能進行偵測，樣品前處理比固相微萃取複雜許多，並有濃度掌控不易的風險。

利用GC 可以使用極少量的樣品就可進行分析，固相微萃取則只需要吸附微 量氣體成份即可，甚至不需要製作分析樣品或衍生物。缺點是二次代謝物的分析 結果再現性較差，以及設備耗材較為昂貴。

使用GC 分析白藜蘆醇這類 stillbenes 化合物，因為其沸點超過 300℃，以至 於無法順利氣化分析時，必須利用MSTFA、BSTFA 等衍生劑，使 stillbenes 化合 物氫氧基甲基化、醛化而改變化學結構，藉此降低沸點，方便實驗進行 (Rimando et al., 2004) 。

(二) 高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)

高效能液相層析廣泛在食品、生化、醫藥、農業等方面，利用選擇不同極性 的移動相、分離管柱、固定相來分離各種常溫下不易揮發的物質，管柱可依照分 離物質的性質順序不同分為正向和逆向兩種，HPLC 亦可配合使用螢光測定儀、

紫外光測定儀、質譜儀來進行檢測，此技術發展至今已相當成熟。

此方法分析結果再現性高，唯移動相廢液需要額外處理避免造成環境污染，

且分離物質會沾附溶劑需另外純化。使用HPLC 分析白藜蘆醇大多使用 C18 管 柱，移動相選擇多以甲醇、乙腈等極性溶液以不同比例配合水相液移動來分離 (Rudolf et al., 2005) 。

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第三章 虎杖高白藜蘆醇含量選系之繁殖

摘要

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)繁殖時可採用種子播種、扦插、或 以地下莖為材料進行分株，近期也有以組織培養方式繁殖的研究。唯目前在大量 栽培時，仍以種子或扦插為主要方式。本研究以明道大學梅峰地區選育高量白藜 蘆醇之虎杖無性繁殖051111 選系作為材料。試驗使用一年生枝條進行扦插，以 扦插材料(含頂芽部位)、套袋與否、NAA 粉劑的用與否作為變因，觀察對於扦插 苗的存活與生長之影響，依變因分設計2x2x2 複因子試驗，每處理 15 株。結果 顯示使用套袋、以不包含頂芽的節間插穗並使用500 mg/L NAA 粉劑，在本試驗 中有100 ％的成苗率；每株平均發根數 3.5 根、平均根長為 0.35 公分，各項評 估指標中僅平均根長之影響未達顯著差異水準。綜合言之，套袋處理是虎杖扦插 時的重要操作，應該是因為能保持較高的濕度，而有較佳的扦插苗成活率。

前言

虎杖繁殖方式甚多，通常在早春或生長旺盛的季節以扦插法或分株法繁殖進 行。扦插材料選用生長勢強的新生枝條為材料，分株時將長有新芽的地下莖分段，

留2~3片葉後定植於畦中。種子繁殖以春播為佳，高溫季節播種需遮陰並定時灑 水降溫，低溫季節則須塑膠膜覆蓋保溫保濕，以利出苗。在人工繁殖虎杖上，由 於種子繁殖有發芽率低、發芽整齊度不足的缺點，因此分株和扦插繁殖是最主要 的方法(王等，2007)。

虎杖利用種子繁殖雖然快速、便利，但發芽率和整齊度皆過低，且種子不易 儲藏，生產上不能使用隔年種子(孫，2005)。分株繁殖雖成功率高但較浪費材料，

且需要較大的栽培面積。扦插繁殖則需保持較高的溼度，並且易因扦插苗的材料

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狀況不同而影響後續的生長。藉由試驗可先確定較可行或經濟的繁殖方法，以保 證產品品質的一致性。由於試驗初期取得之試驗材料甚少，故選用扦插為主要繁 殖方式。

插穗本身的內生條件取決於母本，對後續扦插苗品質有所影響。扦插時插穗 的節位會影響發根率（陳惠菁，1999），依不同植物而有所不同，有些以頂芽最 好，有些以基部為佳。而插穗成熟度也會影響發根，可能原因與生長素濃度

（Vazquez and Gesto,1982），或著植株內含的營養成分有關（Hartmann et al., 1990）。

本試驗以不同節位取包含頂芽和不包含頂芽之莖段為插穗，組合是否施用NAA 與套袋操作進行試驗。試驗所生產之扦插苗則供後續試驗之用。

材料與方法

一 、試驗材料

本研究之虎杖植株源自梅峰地區，經明道大學篩選出之高白藜蘆醇含量組培 繁殖051111 選系；具有高含量二次代謝物，在梅峰種植的一年生植株，其白藜 蘆醇含量可達3.37 mg/g DW，除白藜蘆醇外尚有白藜蘆醇苷、大黃素等多種具 生物活性成份(黃，2007)。

二、試驗方法

所有插穗皆扦插於5 吋盆中，以根基旺 3 號為扦插介質。插穗為包含二節的 莖段長約10 cm，分為包含頂芽和不包含兩種。配合套袋與否及是否施用 500 mg/L NAA 發根粉劑作為處理變因。扦插 1 個月後，調查成活率，並且記錄當時之抽 芽數、每株平均發根數、每根根長的表現。

(一)插穗材料

分為包含頂芽及不包含頂芽兩種，插穗長皆為 10~12 cm，不含頂芽之節間 插穗具2 個節，頂芽插穗則包含頂端生長點。

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(二)套袋處理

本研究參考Hessayon(1997)書中的盆插法以夾鏈袋進行套袋，扦插時分為套 袋與不套袋兩種處理，套袋者將插穗連盆套入十號夾鏈袋中並置於水盤上，無套 袋者則直接置於水盤。

(三)發根劑使用

扦插時分為插穗基部施用500 mg/L NAA 粉劑或不施用兩種處理，分別扦插 於介質中。

(四)數據處理

試驗設計以2x2x2 複因子試驗進行 ，依照試驗變因分為 8 組，1 個插穗為 1 重複，每組15 重複。數據以 Costat 6 進行統計分析，計算最小顯著差異(least significant difference test, LSD)分析各處理的差異顯著性。

結果

(一)插穗材料

試驗結果顯示，扦插材料影響存活數、抽芽數和總根長皆達極顯著水準，平 均根數亦達顯著水準，但平均根長未達則差異不顯著(表 1)。使用包含頂芽的材 料其存活數為9.37 較不包含頂芽之 11 株少，後續抽芽者以不包含頂芽 8.1 個株 較含頂芽的 1.25 株要多。發根方面，每株平均根數和總根長也有相同趨勢，以 不包含頂芽的每株1.38 根和 0.81 公分為佳，但對平均根長未有顯著影響。

(二)套袋處理

套袋處理可有效增加扦插環境的相對濕度，影響存活數、後續抽芽數、平均 根數和總根長皆極顯著，唯對平均根長未達顯著影響。有套袋者存活數 12.12，

比不套袋之 8.25 株多。後續有抽芽者也以有套袋的 5.5 個比不套袋的 3.87 個要 多。平均根數和總根長則有相同趨勢，以有套袋者的每株1.68 根和 1.11 公分為

12

佳。但對平均根長未有顯著影響。

(三)發根劑使用

施用NAA 影響存活數、抽芽數、總根長皆極顯著，但對平均根數和平均根 長未有顯著影響。插穗基部施用500 mg/L NAA 粉劑存活數 11.5 株比不套袋的 8.87 株多。後續有抽芽者也以有套袋的 6.25 個較不套袋者的 3.12 個多。平均根 數和總根長趨勢相同，以施用者的1.14 根和 0.89 公分為佳，但對平均根長未有 顯著影響。

(四)交感效應分析

套袋與扦插材料間的交感作用在存活數、抽芽數、平均根數和總根長影響極 為顯著，唯在平均根長中無交感關係。套袋與施用NAA 間在總根長有顯著交感 關係。扦插材料與施用NAA 間的交感關係在存活數、抽芽數和總根長中極為顯 著，但在平均根數和平均根長中無交感關係。三因子間的交感在抽芽數和總根長 中極顯著，但對平均根數和平均根長中無交感關係。

討論

2010 年採自梅峰地區之野生虎杖種子其發芽率約為 60％，發芽整齊度差。

綜合各處理視為單一因子時(表 2)，最佳的扦插方式是以不含頂芽之插穗施用 500 mg/L NAA 粉劑並套袋。後續側芽萌發率 86.6 %、平均每株發根數為 3.5，平均 根長0.35 公分，皆優於其他處理組合。

扦插時插穗接觸的空氣保持高濕度，可以減緩失水的現象。水份逆境時插穗 會有葉片水勢下降，氣孔關閉及發根不良的現象(Loach,1997)。本試驗套袋者明 顯優於未套袋者，其存活率和發根情形皆是。

以山茶花枝條分為頂、中、基段的插穗進行扦插，結果以中段最佳，推論是 中段含有比頂端豐富的養分所致(陳等，1993)。本研究不包含頂芽的插穗相當於

13

陳等（1993）之中段及基段插穗，相同呈現出類似的結果，顯示插穗所取枝條的 部位確實會影響成活率 (表 1 和 2)。

扦插繁殖時，常使用NAA 或 IBA 作為發根劑，但 NAA 和 IBA 混合使用之 效果，常比NAA 或 IBA 單獨使用效果好(朱，1995)。農業上常使用 IBA 或 NAA 促進發根，經IBA 處理者根較長且多但比較細，處理 NAA 者則根短且少但較粗。

梨子插穗施用生長素者比未施用者有較好的發根情形(Hartmann et al., 1990)。本 試驗結果亦是施用生長素較佳。

虎杖生命力強韌，扦插繁殖容易，其莖部呈中空須注意插床濕度，在以扦插 法來繁殖虎杖時須保持較高的濕度有助提升成活率。本研究所需之扦插苗皆以此 研究結果進行繁殖供後續試驗使用。

綜合上述，本論文試驗所需之試驗材料皆以此研究成果所得之最佳方式，即 使用套袋、以不包含頂芽的節間插穗並施用500 mg/L NAA 粉劑繁殖 051111 選 系作為營養系。

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表1. 插穗含頂芽與否、套袋及施用 NAA 對虎杖扦插苗成活率與生長的影響

Table 1. Effect of cutting shoots with or without apical bud, bagging and application of NAA on cutting survival rate and growth in Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc.

survival rate laterd shooting average root average root lengh total root lemgh

(%) per cutting per cutting (cm) (cm)

bagging

Yes 80.80 a

5.50 a 1.68 a 0.24 a 1.11 a

No 55.00 b 3.87 b 0.13 b 0.05 a 0.02 b

cutting shoots(cs)

with apical bud 62.47 b 1.25 b 0.43 b 0.13 a 0.32 b

without apical bud 73.33 a 8.12 a 1.38 a 0.16 a 0.81 a

NAA(500 mg/L)

Yes 76.67 a 6.25 a 1.14 a 0.18 a 0.89 a

No 59.13 b 3.12 b 0.66 b 0.12 a 0.24 b

P value

bagging 0.0000 ***

0.0012 ** 0.0010 ** 0.1834 ns 0.0000 ***

cutting materials 0.0001 *** 0.0000 *** 0.0150 * 0.7878 ns 0.0000 ***

NAA(500 mg/L) 0.0000 *** 0.0000 *** 0.1552 ns 0.6581 ns 0.0000 ***

interaction

bag x cs 0.0002 *** 0.0093 ** 0.0163 * 0.9850 ns 0.0000 ***

bag x NAA 0.1215 ns 0.2897 ns 0.1682 ns 0.5973 ns 0.0000 ***

cs x NAA 0.0000 *** 0.0002 *** 0.1682 ns 0.7688 ns 0.0000 ***

bag x cs x NAA 0.0203 * 0.0032 ** 0.2131 ns 0.8558 ns 0.0000 ***

Z

:Mean separation within columns at P≦0.05.

y

:NS,*,**,*** Nonsignificant or significant at P≦0.05, 0.01 or 0.001, respectively.

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表2. 虎杖扦插試驗之單因子分析

Table.2 Single factor analysis of cutting test in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.

bagging cutting with bud NAA(mg/l) survive laterd shooting average root average root lengh total root lemgh

(%) per cutting per cutting (cm) (cm)

yes yes 500 83.3 ab ^Z 1.5 de 0.7 bc 0.25 a 0.393 b

yes 0 76.6 ab 1.5 de 0.7 bc 0.19 a 0.266 c

no 500 100 a 13 a 3.5 a 0.35 a 1.436 a

no 0 73.3 bc 6 c 1.7 b 0.16 a 0.224 c

no yes 500 53.3 d 2 d 0.1 c 0.02 a 0.004 d

yes 0 53.3 d 0 e 0.1 c 0.04 a 0.012 d

no 500 86.6 ab 8.5 b 0.1 c 0.07 a 0.024 d

no 0 56.6 cd 5 c 0.1 c 0.07 a 0.014 d

Z :Mean separation within columns treated as single factor analysis at P≦0.05.

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第四章 虎杖白藜蘆醇之萃取

摘要

中草藥在使用之前多有炮製和萃取的過程，過程中應盡量純化避免雜質干擾，

但過程太繁複也容易降低材料內目標物的含量造成損失，因此應盡可能減少此過 程所造成的變因以及選用適當的炮製和萃取方式來提升萃取效率。

本試驗使用虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為明道大學選育 051111 選系之地下部為材料，利用正交表 L16（4

⁵

trans-resveratrol 萃取測定的影響。試驗結果顯示，樣品輔以超音波處理下以 80%

乙醇進行萃取，時間為80 分鐘，料液比 1:10，萃取溫度設定為 60 ℃可萃取最多 白藜蘆醇，所有變因中唯有料液比對於萃取白藜蘆醇有顯著的影響。甲醇和丙酮 具有毒性，不適合做為食品用的白藜蘆醇萃取溶劑。

前言

白藜蘆醇(resveratrol)是一種多酚類(polyphenols)成分，在葡萄、花生、蓼科 和松樹等植物中都含有大量的白藜蘆醇(Signorelli and Ghidoni, 2005)，具有抗腫 瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功 能，極具應用價值(華，2009)。

虎杖為傳統中醫常用藥材，常用於治療癌症，心血管疾病，其萃取液更有良 好抗菌功效，白藜蘆醇含量更高過上述其他。虎杖不論中醫上使用或作為提取原 料都須經過炮製或萃取的步驟。中藥炮製主要目的有以下幾點：一、讓中藥能達

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到一定程度的淨度和純度標準，如洗去泥沙、粗皮、附著物等雜質。二、消除或 較降低中藥的毒性或副作用，如千金子、巴豆含有使人腹瀉的油脂成份，炮製去 除部份脂肪油而成千金子霜、巴豆霜入藥。三、改變和增強中藥飲片固有的性能 以提高醫療效果，如地黃生品性味為甘，寒，具滋陰涼血的作用，炮製成熟地黃 後性味轉為甘，微溫，具滋陰補血的作用。四、適應中藥製劑的配製和中藥的儲 藏（王等，2000）。

正交試驗設計(orthogonal design)是用來設計多變因試驗的一種方法，利用規 格化的正交表安排試驗，所得試驗結果再以統計方法處理得出科學結論(鄭等，

2009)。此法常用於醫藥、紡織、化工、電子、機械等行業，與常規方法相比可 以大幅減少試驗次數和繁複的分析，避免遺漏變因間的相互影響並減少時間花費 和材料浪費。

正交設計有三項特點，首先由正交表挑選出的實驗點具均勻分散性，在實驗 中是具代表性意義。其次，各實驗點皆具有整齊可比性；第三，有些效果好但未 必於實驗點中出現的組合可藉由統計分析將其發現。

本試驗利用正交表設計，以萃取時的乙醇濃度、材料使用量(料液比)、萃取 時間、萃取溫度作為試驗變因，並分為4 個級別，再以 SPSS(statistical product and service solution)進行方差分析，希望找出最佳的白藜蘆醇萃取條件，供後續試驗 之進行。

材料與方法

一 、試藥與試劑 1.標準品：

白藜蘆醇標準品 trans-resveratrol：購自 Sigma Pcode:1001309854 2.有機溶劑：

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乙腈acetonitrile：HPLC 級，Merck 甲醇methanol：HPLC 級，Merck 乙醇ethanol：食品級，友和貿易 醋酸CH

3

二、儀器設備

1.高效能液相層析系統 Jasco HPLC Pump：Jasco PU-2089

Auto-sampler：Jasco AS-2057

Column：Water Symmetry C18，4.6X250 mm，5μm Detector：Jasco UV-2075

Intercafe box：LC-Net II/ADC

Recorder：Jasco chrompass chromatography Data system version1.7.403.1 2.磨粉機 ：榮聰精密科技股份有限公司 RT-08

3.超音波震盪機：DELTA ultra sonic cleaner DC400H 4.震盪機：Thermonies TM-100

5.烘箱：Memmert

6.電子天平：Precisa XB4200C

三、樣品處理與取樣方法

虎杖取自栽培於台大園藝系精密溫室的一年生051111 選系。取樣後地下部 以清水洗去介質後，置於50 ℃烘箱中經乾燥至乾重不再有變化為止。將乾燥樣 本切成小塊或薄片，以磨粉機磨成粉狀，置入夾鏈袋並記錄後於室溫的乾燥皿中 儲藏備用。

四、trans-resveratrol 的萃取方法設計與分析

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(一)正交試驗表設計與樣品製備

利用L16（4

⁵

(二)HPLC 分析條件

分析方式以Rudolf 等(2005)的報告並加以修改。

Injection volumn：4μl Mobile phase：

Solvent A：100 ％ acetonitrile Solvent B：0.1％ acetic acid Gradient：

0-13min：移動相 A 維持 30％比例，移動相 B 維持 70％

Flow rate：1 ml/min Detecter：305 nm

(三) trans-resveratrol 標準品與檢量線製備

將 trans-resveratrol 標準品溶於甲醇中，配置成 2000 mg/L 母液(stock solution)，

分別稀釋成50、75、100、125、150 mg/L，測得標準曲線後做為地下部樣品的 檢量線，供計算濃度使用。

五、統計分析

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試驗數據以SPSS 統計軟體進行方差分析，顯著水準 p≦0.05，經最小顯著 差異法(least significant difference test , LSD)分析比較差異。極差分析以 EXCEL 計算各變因的極差值做比較。

結果

(一)以正交表測定最佳萃取條件

由(表 3)顯示此試驗相關係數(r

²

(二) trans-resveratrol 分析與測定

標準品溶液以HPLC 進行分析結果於 (圖 1)，在 7.2 分鐘時出現

trans-resveratrol 的成份峰，虎杖萃取樣品也於同樣時間出現(圖 2)。經以 LCMS

分析檢測同樣的標準品溶液結果如(圖 3)，確認為 trans-resveratrol，可做為往後 試驗定性與定量依據。

討論

近年來白藜蘆醇的提取方法包含有機溶劑浸提法、超聲波或微波輔助提取法、

酶解法、超臨界萃取等，其中溶劑浸提法是國内外最廣泛應用的提取方法。(華，

2009)。

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前人指出，丙酮提取白藜蘆醇提取率最高；但丙酮具有毒性及揮發性大，回 收困難。乙醇無毒，供應充足，且價格低廉，一般選擇安全、無毒、易回收的乙 醇作为提取溶劑較適宜(李和劉，2009)。

除溶液和方法的選擇外，萃取過程的溫度、時間也會影響白藜蘆醇的萃取量。

Romero-Perez 等(2001)使用 80%乙醇為溶液萃取葡萄中的 stilbenes 物質時，80℃

下萃取30 分鐘可得最高量的 trans-resveratrol，溫度降至 25℃，萃取 120 分鐘所 得含量卻只有一半。

謝等人(2007)比較了四種不同的提取虎杖中白藜蘆醇的方法，認為超聲波萃 取收率最高。本研究輔以超音波處理樣品，利用超音波對物質造成的震動作用和 空化作用，使溶劑能與樣品充分接觸，有助提升萃取效率。

本試驗使用正交表安排各項變因，並將其中一項變因作為空白列納入統計分 析以減少試驗需要的重複數。透過SPSS 分析，結果顯示虎杖中的白藜蘆醇應以 80%乙醇為萃取溶液，與原料比例 1:10，於 60 ℃下輔以超音波處理萃取 80 分鐘，

可得最多白藜蘆醇萃取量(表 5)。而通過比較極差的大小可確定因素的主次，若 所有因素的極差都比空白列要小，則表示各因素間可能有不可忽略的交互作用，

或是忽略了對試驗結果有重要影響的其他因素(鄭等，2009)。本研究結果所有變 因的極差值皆大於空白列，因此各變因間並無明顯的交互作用，並可依照極差值 大小確定各變因影響程度依序為液料比、萃取時間、萃取溫度、乙醇濃度，此結 果與方差分析結果相同(表 4 和 5)。

除此之外，Martinez-Ortega(2000)利用提高酒槽壓力的方式來增加紅酒中的 白藜蘆醇。而由亞麻子中萃取二異落葉松脂素(seisolariciresinol)時添加纖維素酶

（cellulases）可以使提取量增至 70~80%，提取量會隨提取時間、pH 值、提取溫 度、混合酶的種類不同而增減(Renouard et al.,2010)。

Botella 等人（2005）進一步比較了纖維素酶、木質酶（xylanases）和果膠酶

（pectinases）在分解葡萄殘渣時於不同時間的活性和分解能力，發現酶解產生的

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醣類多寡與酶活性高峰時間相同。於白藜蘆醇苷標準品溶液中添加纖維素酶，3 小時後可於薄層層析圖中發現游離態的白藜蘆醇 (董等，2008)。

本研究礙於器材無法將壓力和纖維素酶等各種酵素納入試驗，後人可將此作 為萃取白藜蘆醇的變因來探討，進一步改善萃取條件。

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圖1. 白藜蘆醇標準品 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，滯留時間為 7.2 分 鐘。

Fig. 1. HPLC chromatogram of trans-resveratrol standard detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min

gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min). Trans-resveratrol retention time of 7.2 min.

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圖2. 虎杖地下部萃取液 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯留時間為7.2 分鐘。

Fig. 2. HPLC chromatogram of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. root extract detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).Trans-resveratrol retention time of 7.2 min.

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圖3. 白藜蘆醇標準品 LCMS 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯 留時間為9.59 分鐘。

Fig. 3. (A)TIC of Liquid Chromatograph Mass Spectrometer from trans-resveratrol standard detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).(B)Mass ion spectrum of trans-resveratrol eluting at retention time of 9.59 min.(C) Demonstrating characteristic ion cluster of mass 229 (D)TIC of MRM with qualifier ions of mass 211 and 135.

26

表3. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對虎杖中白藜蘆醇萃取的方差分析表

Table 3. Tests of between-subjects effect of ethanol concentration、extract time、extract temperature and mixture ratio on extraction of

trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.

Dependent Variable:resveratrol content

Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Corrected Model 856166.015 ^a 12.000 71347.168 14.222 0.025

Intercept 9877443.266 1.000 9877443.266 1968.983 0.000

ethanol concentration 26742.292 3.000 8914.097 1.777 0.324

extract time 62243.987 3.000 20747.996 4.136 0.137

extract temperature 43330.225 3.000 14443.308 2.879 0.204

mixture ratio 723849.510 3.000 241283.170 48.098 0.005

Error 15049.558 3.000 5016.519

Total 10750000.000 16.000

Corrected Total 871215.573 15.000

a :R sequared = 0.983(Adjusted R Squared = 0.914)

27

表4. L16（4

⁵

Table 4. L16（4

⁵

cuspidatum Sieb. et Zucc.

NO. ethanol extract extract mixture blank resveratrol content

concentration time temperature ratio (μg/mg DW)

1 1 1 1 1 1 1040.685

2 1 2 2 2 2 655.755

3 1 3 3 3 3 589.955

4 1 4 4 4 4 604.76

5 2 1 2 3 4 538.96

6 2 2 1 4 3 668.915

7 2 3 4 1 2 988.045

8 2 4 3 2 1 915.665

9 3 1 3 4 2 604.76

10 3 2 4 3 1 687.01

11 3 3 1 2 4 823.545

12 3 4 2 1 3 1205.185

13 4 1 4 2 3 655.755

14 4 2 3 1 4 1325.27

15 4 3 2 4 1 557.055

16 4 4 1 3 2 710.04

K1 722.78875 710.04 810.79625 1139.7963 800.1038

K2 777.89625 834.2375 739.23875 762.68 739.65

K3 830.125 739.65 858.9125 631.49125 779.9525

K4 812.03 858.9125 733.8925 608.8725 823.1338

107.33625 148.8725 125.02 530.92375 83.48375

4 2 3 1 5

MAX-MIN

ethanol concentration（%）：

1:60, 2:70, 3:80, 4:90 extract time（min）：

1:20, 2:40, 3:60, 4:80 extract temperature（

⁰

1:40, 2:50, 3:60, 4:70 mixture ratio（w/v）：

1:1/10, 2:1/15, 3:1/20, 4:1/25

28

表5. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對萃取虎杖中的白藜蘆醇單因子 量表

Table 5. Estinated marginal means of ethanol concentration、extract time、extract temperature and ratio on extraction of trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.

29

第五章 虎杖不同季節的生長量變化與形態調查

摘要

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為蓼科多年生灌木狀草本，屬於高 冷地植物，台灣野生虎杖大多分布於海拔1800 公尺以上，花期為 9 到 10 月份，

10 月之後進入休眠期而使地上部死亡，在隔年 3 月重新發芽成長成新植株。主 要採收部位為地下莖，但葉片也具有藥用價值。本試驗將虎杖植株栽培於埔里、

台北、春陽及梅峰之露地，逐月記錄一年生虎杖於各區的生長量指標，可做為台 灣虎杖生長情形的參考。

結果顯示，於2010 和 2011 年比較下，栽培於埔里的植株落葉數過多對生長 有不良影響。梅峰地區的植株於2010 與 2011 年的節間數分別為 34.14 和 23.67 個，葉片數為19.79 和 20 片，株高為 116.69 和 83.7 公分，為生長量最少的試驗 區。八月與九月是虎杖生長旺盛時期，於十月開始進入休眠。

前言

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為蓼科多年生灌木狀草本，氣溫低 時有休眠習性。為傳統中醫使用藥材，主要的藥性成分為白藜蘆醇(resveratrol)、

虎杖苷(cuspidatin)等，現代藥理學實驗發現白藜蘆醇對人體有降血脂、對動脈硬 化和冠心病具有保護作用，具有對癌症的化學預防作用，現在已添加在許多保健 食品中(梁和李,2006)。

人工種植虎杖通常於四月中旬播種或分株繁殖，經兩年栽培後採收作為藥材 販售。採集加工時，葉片和莖於春、夏季採收最佳，地下莖與根則在秋季或春季

30

採收(吳和徐,1999)。

藉由生長量調查可以了解虎杖在埔里、台北、春陽及梅峰的生長情形與休眠 時間，日後配合檢測地上部和地下部的白藜蘆醇含量，可提供台灣的虎杖栽培者 最具經濟價值的採收時間參考與產量預估。

材料與方法

一 、試驗材料

本研究之虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)植株源自梅峰地區，經明 道大學篩選出之高白藜蘆醇含量組培繁殖051111 選系。將此品系種植於國立台 灣大學精密溫室，待植株成熟後依第二章試驗結果生產扦插苗供後續試驗使用。

二、試驗方法

試驗區分為4 個地點，依照海拔高度排列為台北(5~10m)、埔里(380~700m)、

春陽(1200m)、梅峰(1700m)。虎杖植株栽植於 60×40×20 ㎝ 3 塑膠盆中，以根基 旺3 號為介質，分別置於各試驗區之露地。各區栽種虎杖扦插苗 30 株，於 2010 年三月開始栽種，四月為馴化期，於五月開始採樣進行調查，隔年2011 年重複。

可得2010 年一年生與二年生和 2011 年一年生虎杖於各月份的樣本，固定選取其 中五株以進行生長量調查。

各試驗區生長量調查指標以一年生植株的節間數、株高、葉片數，其中葉面 黃化或缺口大小超過一半者不計，依節間數和葉片數可推測該區落葉程度。除紀 錄生長指標外並觀察生長週期和紀錄休眠月份。

二年生植株調查其側枝於主枝上抽出的節位與順序，基部為第1 節，依序往 上為第2、第 3 節，直至頂芽。依此做為地上部採收部位的標準，以利後續試驗 分析不同部位的白藜蘆醇濃度與產量。

31

結果

2010 年因埔里發生乾旱導致一年生植株地上部受害，損失該區七月以後的 數據。九月時氣溫漸低導致植株開始休眠影響採集作業，使各區在九月後的各項 誤差值偏高，十月時地上部已經完全枯萎進入休眠期無法收集地上部相關資料。

(一) 2010 年一年生虎杖各指標結果

結果顯示於(表 6)，台北和春陽兩地間雖未達顯著差異仍為表現最佳的試驗 區，節間數分別為52.4 和 53 個、葉片數為 34.6 和 30.3 片、株高為 155.4 和 170.5 公分，但落葉數與埔里間未達顯著。八月與九月為一年生虎杖植株的生長旺季，

節間數分別為62.6 和 63.8 個、葉片數為 41.5 和 44.4 片、株高為 208.25 和 210.45 公分；除落葉數外各項指標與其他月份皆有顯著差異。一年生虎杖於十月前無明 顯休眠，但落葉數仍以十月的43.33 片最多。雙因子試驗結果顯示，地點對節間 數、葉片數和株高的顯著性皆極顯著，唯對落葉數未有影響；月份對各指標的影 響皆達顯著；月份和地點間唯落葉數外，於其他指標間皆無交感關係。

(二) 2011 年一年生虎杖各指標結果

結果顯示於(表 6)，栽植於埔里的植株有最多的節間數 57.4 個，並有最高株 高180.08 公分，但落葉數也是最多的 33.33 片。葉片數以春陽 43.42 片最多。八 月與九月為生長旺季，各項指標與其他月份皆有顯著差異，節間數分別為49.25 和43.92 個、葉片數為 36 和 31.83 片、株高為 155.19 和 150.92 公分。一年生虎 杖於十月前無明顯休眠，但落葉數仍以十月的52 片最多。雙因子試驗結果顯示，

地點和月份對各指標的影響皆極顯著；月份和地點於各指標中並無交感關係。

(三)側枝抽出節位與順序

進行二年生虎杖的生長形態調查，並紀錄側枝抽出情形，結果如(圖 4)所示。

發現側枝開始抽出時，第一支側枝有77.7%會由第 4 節抽出，16.6%由第 5 節抽 出，5.5%由第 6 節抽出。第二支側枝有 50%會由第 5 節抽出，28.5%由第 3 節抽

32

出，7.14%由第 4 節抽出。第三支側枝有 37.5%會由第 5、6 節抽出，12.5%由第 3、7 節抽出。

討論

2010 年因埔里發生乾旱而使數據與 2011 年不同，由(表 6)可得知無論哪一 年栽植於埔里的植株節間和株高皆有顯著表現，但葉片數和節間數差距過大表示 該區落葉數較多，對生長容易造成不良影響，後續可依採收乾重量證明。綜觀兩 年，梅峰為生長量最少的試驗區，可能是與其高冷地環境氣候有關，低溫使植物 生長緩慢。

八月與九月為一年生植株生長旺盛時期，葉片數、節間數、株高皆以此時期 為最高。2010 年十月葉片數降至 19.7 片和落葉數 43.33 片，2011 年十月落葉數 也比其他月份多，可觀察到一年生植株於十月份準備進入休眠。

二年生虎杖地上部形態觀察結果如(圖 4)所示，由此可知虎杖的初期側枝萌 發都集中於第4、5 節抽出，並依序向上或下持續抽出新的側枝，推測與虎杖的 成長與成熟度有關。一年生植株地上部側枝則無此生長規則。可以此分支特性做 為地上部不同採收部位的判斷基準進行後續試驗，日後分析不同部位的白藜蘆醇 含量或許可推測白藜蘆醇與植株成熟度間的關連，並藉此了解地上部各部位的白 藜蘆醇含量變化，可供採集地上部加工產品做為參考。

33

圖4. 二年生虎杖側枝抽出節位和順序

Fig 4. The side shoot growth node and sequence with main shoot of two years old

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.(no.1: the first side shoot, no.2: the second side

0%

20%

40%

60%

80%

100%

no.1 no.2 no.3 no.4

shoot application rate

No. of side shoot

9

8

7

6

5

4

3

2

34

表6. 地點和採收時間對一年生虎杖地上部節間數、葉片數、株高與落葉數的影響

Table 6. Effect of location and harvest time on stem number, leaf number, plant height and loss leaf number of one year old Polygonum

cuspidatum Sieb. et Zucc.

2010 2011

stem leaf height loss leaf stem leaf height loss leaf

number number (cm) number number number (cm) number

location

Puli 44.79 a

25.93 b 156.55 a 20.92 ab 57.40 a 30.08 b 180.08 a 33.33 a

Taipei 52.43 a 34.61 a 155.36 a 18.00 ab 22.50 c 21.67 c 83.90 c 0.83 b

Chunyang 53.00 a 30.31 ab 170.47 a 22.04 a 45.58 b 43.42 a 135.82 b 2.60 b

Meifong 34.14 b 19.79 c 116.69 b 13.90 b 23.67 c 20.00 c 83.70 c 3.67 b

harvest time

May 24.15 c 16.50 d 79.57 c 7.65 d －

－ － －

June 36.30 b 22.50 c 111.59 b 13.80 cd 21.83 c 18.50 c 57.88 c 3.33 c

July 59.89 a 34.00 b 191.82 a 29.41 ab 35.50 b 28.83 b 119.52 b 6.67 c

August 62.60 a 41.50 a 208.25 a 21.10 bc 49.25 a 36.00 a 155.19 a 14.45 b

September 63.80 a 44.40 a 210.45 a 22.78 bc 43.92 a 31.83 ab 150.92 a 13.18 b

October 73.00 a 19.70 cd 234.93 a 43.33 a 52.00 a － － 52.00 a

P value Main effects

location 0.00 *** 0.00 *** 0.00 ** 0.18 ns 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 ***

harvest time 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 *** 0.00 ***

interaction

location x harvest time 0.29 ns 0.20 ns 0.90 ns 0.04 * 0.09 ns 0.15 ns 0.35 ns 0.09 ns

Z:Mean separation within columns at P≦0.05.

Y:Could not be detected.

NS,*,**,*** Nonsignificant or significant at P≦0.05, 0.01, or 0.001, respectively.

35

第六章 虎杖不同季節與採收部位的白藜蘆醇含量和鮮乾重變化

摘要

「道地藥材」是指傳統中草藥在一定的產地及環境之下所生產的藥材，其具 有中國古書所指特定基因型與療效等特性，因此適地適作是生產優質中草藥的關 鍵因素之一。本試驗所選用的虎杖為台灣原生種，並於台灣埔里、台北、春陽、

梅峰不同海拔的四個試驗區栽培，研究不同採收時間、栽培年限、採收部位的白 藜蘆醇含量變化以及鮮乾重的變化，可做為台灣生產虎杖的栽培與採收參考。研 究結果顯示，虎杖栽培時限應以二年較一年為佳，採收部位以地下部有較多的白 藜蘆醇含量。

二年生地上部不同部位的生長量和白藜蘆醇含量以側枝較主枝佳，以側枝的 Part5(第 4~6 節)和 Part6(第 7 節以上)最高。各處理間比較，試驗地點影響顯著大 於其他。評估白藜蘆醇總產量，地上部於梅峰所產植株於七月時採摘Part6 部位 最多(1.98 mg/part)，地上部整體採收的結果與分級採收的趨勢相同，以春陽所產 於八月份採收為最多(5.02 mg/plant)。

地下部則以種植於梅峰者生長情形最佳，每株地下部鮮重為401.8 g，乾重 為140.7 g。白藜蘆醇含量以台北最高有 3.33 mg/g DW。採收時期為八月時各試 驗區地下部皆有最高採收乾重118.83 g，白藜蘆醇含量也於八月達最高 3.19 mg/g DW。採收目標為地下部時應以梅峰所產於八月採收最佳(561.35 mg)。

前言

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為蓼科多年生灌木狀草本，為傳統