摘要
中草藥在使用之前多有炮製和萃取的過程，過程中應盡量純化避免雜質干擾，
但過程太繁複也容易降低材料內目標物的含量造成損失，因此應盡可能減少此過 程所造成的變因以及選用適當的炮製和萃取方式來提升萃取效率。
本試驗使用虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)為明道大學選育 051111 選系之地下部為材料，利用正交表 L16（4
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）設計試驗，探討萃取時的乙 醇濃度、材料使用量(料液比)、萃取時間、萃取溫度對於反式白藜蘆醇trans-resveratrol 萃取測定的影響。試驗結果顯示，樣品輔以超音波處理下以 80%
乙醇進行萃取，時間為80 分鐘，料液比 1:10，萃取溫度設定為 60 ℃可萃取最多 白藜蘆醇，所有變因中唯有料液比對於萃取白藜蘆醇有顯著的影響。甲醇和丙酮 具有毒性，不適合做為食品用的白藜蘆醇萃取溶劑。
前言
白藜蘆醇(resveratrol)是一種多酚類(polyphenols)成分，在葡萄、花生、蓼科 和松樹等植物中都含有大量的白藜蘆醇(Signorelli and Ghidoni, 2005)，具有抗腫 瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功 能，極具應用價值(華，2009)。
虎杖為傳統中醫常用藥材，常用於治療癌症，心血管疾病，其萃取液更有良 好抗菌功效，白藜蘆醇含量更高過上述其他。虎杖不論中醫上使用或作為提取原 料都須經過炮製或萃取的步驟。中藥炮製主要目的有以下幾點：一、讓中藥能達
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到一定程度的淨度和純度標準，如洗去泥沙、粗皮、附著物等雜質。二、消除或 較降低中藥的毒性或副作用，如千金子、巴豆含有使人腹瀉的油脂成份，炮製去 除部份脂肪油而成千金子霜、巴豆霜入藥。三、改變和增強中藥飲片固有的性能 以提高醫療效果，如地黃生品性味為甘，寒，具滋陰涼血的作用，炮製成熟地黃 後性味轉為甘，微溫，具滋陰補血的作用。四、適應中藥製劑的配製和中藥的儲 藏（王等，2000）。
正交試驗設計(orthogonal design)是用來設計多變因試驗的一種方法，利用規 格化的正交表安排試驗，所得試驗結果再以統計方法處理得出科學結論(鄭等，
2009)。此法常用於醫藥、紡織、化工、電子、機械等行業，與常規方法相比可 以大幅減少試驗次數和繁複的分析，避免遺漏變因間的相互影響並減少時間花費 和材料浪費。
正交設計有三項特點，首先由正交表挑選出的實驗點具均勻分散性，在實驗 中是具代表性意義。其次，各實驗點皆具有整齊可比性；第三，有些效果好但未 必於實驗點中出現的組合可藉由統計分析將其發現。
本試驗利用正交表設計，以萃取時的乙醇濃度、材料使用量(料液比)、萃取 時間、萃取溫度作為試驗變因，並分為4 個級別，再以 SPSS(statistical product and service solution)進行方差分析，希望找出最佳的白藜蘆醇萃取條件，供後續試驗 之進行。
材料與方法
一 、試藥與試劑 1.標準品：
白藜蘆醇標準品 trans-resveratrol：購自 Sigma Pcode:1001309854 2.有機溶劑：
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乙腈acetonitrile：HPLC 級，Merck 甲醇methanol：HPLC 級，Merck 乙醇ethanol：食品級，友和貿易 醋酸CH
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COOH：HPLC 級，Merck二、儀器設備
1.高效能液相層析系統 Jasco HPLC Pump：Jasco PU-2089
Auto-sampler：Jasco AS-2057
Column：Water Symmetry C18，4.6X250 mm，5μm Detector：Jasco UV-2075
Intercafe box：LC-Net II/ADC
Recorder：Jasco chrompass chromatography Data system version1.7.403.1 2.磨粉機 ：榮聰精密科技股份有限公司 RT-08
3.超音波震盪機：DELTA ultra sonic cleaner DC400H 4.震盪機：Thermonies TM-100
5.烘箱：Memmert
6.電子天平：Precisa XB4200C
三、樣品處理與取樣方法
虎杖取自栽培於台大園藝系精密溫室的一年生051111 選系。取樣後地下部 以清水洗去介質後，置於50 ℃烘箱中經乾燥至乾重不再有變化為止。將乾燥樣 本切成小塊或薄片，以磨粉機磨成粉狀，置入夾鏈袋並記錄後於室溫的乾燥皿中 儲藏備用。
四、trans-resveratrol 的萃取方法設計與分析
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(一)正交試驗表設計與樣品製備
利用L16（4
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）的正交試驗表設計4 個有 4 個級別的試驗變因。乙醇濃度設 為60、70、80、90 ％， 料液比設為每 1 g 樣品分別加入 10、15、20、25 ml 的 乙醇、萃取時間設為20、40、60、80 分鐘、萃取溫度 40、50、60、70 ℃，所有 樣品於DELTA ultra sonic cleaner 中輔予超音波處理，正交表中預留空白列進行統 計分析。各樣品依設計處理後以Advantec No.2 濾紙過濾後定量至 10 ml，經 0.2 μm 薄層過濾器(直徑 13 mm，外膜材質為 PE，內膜為 PTFE，Millipore 公司出 品)過濾後，即為 HPLC 上機樣品。(二)HPLC 分析條件
分析方式以Rudolf 等(2005)的報告並加以修改。
Injection volumn：4μl Mobile phase：
Solvent A：100 ％ acetonitrile Solvent B：0.1％ acetic acid Gradient：
0-13min：移動相 A 維持 30％比例，移動相 B 維持 70％
Flow rate：1 ml/min Detecter：305 nm
(三) trans-resveratrol 標準品與檢量線製備
將 trans-resveratrol 標準品溶於甲醇中，配置成 2000 mg/L 母液(stock solution)，
分別稀釋成50、75、100、125、150 mg/L，測得標準曲線後做為地下部樣品的 檢量線，供計算濃度使用。
五、統計分析
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試驗數據以SPSS 統計軟體進行方差分析，顯著水準 p≦0.05，經最小顯著 差異法(least significant difference test , LSD)分析比較差異。極差分析以 EXCEL 計算各變因的極差值做比較。
結果
(一)以正交表測定最佳萃取條件
由(表 3)顯示此試驗相關係數(r
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)為 0.983，乙醇濃度的顯著性為 0.324、萃取 時間的為0.137、萃取溫度為 0.024、料液比為 0.005，除液料比對萃取所得白藜 蘆醇量影響極為顯著外，其他變因皆無顯著影響。依照極差分析結果(表 4)，液 料比的極差值為530.92、萃取時間為 148.87、萃取溫度為 125.02、乙醇濃度為 107.33、空白列為 83.48。又依照(表 5)各變因級別分析，最適宜的萃取方式是使 用80%乙醇為萃取溶液與原料比例 1:10，溫度設定於 60 ℃輔以超音波處理萃取 80 分鐘。(二) trans-resveratrol 分析與測定
標準品溶液以HPLC 進行分析結果於 (圖 1)，在 7.2 分鐘時出現
trans-resveratrol 的成份峰，虎杖萃取樣品也於同樣時間出現(圖 2)。經以 LCMS
分析檢測同樣的標準品溶液結果如(圖 3)，確認為 trans-resveratrol，可做為往後 試驗定性與定量依據。
討論
近年來白藜蘆醇的提取方法包含有機溶劑浸提法、超聲波或微波輔助提取法、
酶解法、超臨界萃取等，其中溶劑浸提法是國内外最廣泛應用的提取方法。(華，
2009)。
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前人指出，丙酮提取白藜蘆醇提取率最高；但丙酮具有毒性及揮發性大，回 收困難。乙醇無毒，供應充足，且價格低廉，一般選擇安全、無毒、易回收的乙 醇作为提取溶劑較適宜(李和劉，2009)。
除溶液和方法的選擇外，萃取過程的溫度、時間也會影響白藜蘆醇的萃取量。
Romero-Perez 等(2001)使用 80%乙醇為溶液萃取葡萄中的 stilbenes 物質時，80℃
下萃取30 分鐘可得最高量的 trans-resveratrol，溫度降至 25℃，萃取 120 分鐘所 得含量卻只有一半。
謝等人(2007)比較了四種不同的提取虎杖中白藜蘆醇的方法，認為超聲波萃 取收率最高。本研究輔以超音波處理樣品，利用超音波對物質造成的震動作用和 空化作用，使溶劑能與樣品充分接觸，有助提升萃取效率。
本試驗使用正交表安排各項變因，並將其中一項變因作為空白列納入統計分 析以減少試驗需要的重複數。透過SPSS 分析，結果顯示虎杖中的白藜蘆醇應以 80%乙醇為萃取溶液，與原料比例 1:10，於 60 ℃下輔以超音波處理萃取 80 分鐘，
可得最多白藜蘆醇萃取量(表 5)。而通過比較極差的大小可確定因素的主次，若 所有因素的極差都比空白列要小，則表示各因素間可能有不可忽略的交互作用，
或是忽略了對試驗結果有重要影響的其他因素(鄭等，2009)。本研究結果所有變 因的極差值皆大於空白列，因此各變因間並無明顯的交互作用，並可依照極差值 大小確定各變因影響程度依序為液料比、萃取時間、萃取溫度、乙醇濃度，此結 果與方差分析結果相同(表 4 和 5)。
除此之外，Martinez-Ortega(2000)利用提高酒槽壓力的方式來增加紅酒中的 白藜蘆醇。而由亞麻子中萃取二異落葉松脂素(seisolariciresinol)時添加纖維素酶
（cellulases）可以使提取量增至 70~80%，提取量會隨提取時間、pH 值、提取溫 度、混合酶的種類不同而增減(Renouard et al.,2010)。
Botella 等人（2005）進一步比較了纖維素酶、木質酶（xylanases）和果膠酶
（pectinases）在分解葡萄殘渣時於不同時間的活性和分解能力，發現酶解產生的
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醣類多寡與酶活性高峰時間相同。於白藜蘆醇苷標準品溶液中添加纖維素酶，3 小時後可於薄層層析圖中發現游離態的白藜蘆醇 (董等，2008)。
本研究礙於器材無法將壓力和纖維素酶等各種酵素納入試驗，後人可將此作 為萃取白藜蘆醇的變因來探討，進一步改善萃取條件。
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圖1. 白藜蘆醇標準品 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，滯留時間為 7.2 分 鐘。
Fig. 1. HPLC chromatogram of trans-resveratrol standard detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min
gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min). Trans-resveratrol retention time of 7.2 min.
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圖2. 虎杖地下部萃取液 HPLC 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯留時間為7.2 分鐘。
Fig. 2. HPLC chromatogram of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. root extract detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).Trans-resveratrol retention time of 7.2 min.
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圖3. 白藜蘆醇標準品 LCMS 層析圖(紫外線偵測器 305nm)，trans-resveratrol 滯 留時間為9.59 分鐘。
Fig. 3. (A)TIC of Liquid Chromatograph Mass Spectrometer from trans-resveratrol standard detected at 305 nm, acetonitrile and 0.01% acetic acid as mobile phase set at 1 ml/min gradient.( acetonitrile=30 %/min, acetic acid=70 %/min).(B)Mass ion spectrum of trans-resveratrol eluting at retention time of 9.59 min.(C) Demonstrating characteristic ion cluster of mass 229 (D)TIC of MRM with qualifier ions of mass 211 and 135.
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表3. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對虎杖中白藜蘆醇萃取的方差分析表
Table 3. Tests of between-subjects effect of ethanol concentration、extract time、extract temperature and mixture ratio on extraction of
trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.
Dependent Variable:resveratrol content
Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Corrected Model 856166.015 a 12.000 71347.168 14.222 0.025
Intercept 9877443.266 1.000 9877443.266 1968.983 0.000
ethanol concentration 26742.292 3.000 8914.097 1.777 0.324
extract time 62243.987 3.000 20747.996 4.136 0.137
extract temperature 43330.225 3.000 14443.308 2.879 0.204
mixture ratio 723849.510 3.000 241283.170 48.098 0.005
Error 15049.558 3.000 5016.519
Total 10750000.000 16.000
Corrected Total 871215.573 15.000
a :R sequared = 0.983(Adjusted R Squared = 0.914)
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表4. L16（4
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）正交試驗表設計萃取虎杖的白藜蘆醇Table 4. L16（4
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）orthogonal design on extract trans-resveratrol from Polygonumcuspidatum Sieb. et Zucc.
NO. ethanol extract extract mixture blank resveratrol content
concentration time temperature ratio (μg/mg DW)
1 1 1 1 1 1 1040.685
K1 722.78875 710.04 810.79625 1139.7963 800.1038
K2 777.89625 834.2375 739.23875 762.68 739.65
K3 830.125 739.65 858.9125 631.49125 779.9525
K4 812.03 858.9125 733.8925 608.8725 823.1338
107.33625 148.8725 125.02 530.92375 83.48375
4 2 3 1 5
MAX-MIN
ethanol concentration（%）：
1:60, 2:70, 3:80, 4:90 extract time（min）：
1:20, 2:40, 3:60, 4:80 extract temperature（
0
C）：1:40, 2:50, 3:60, 4:70 mixture ratio（w/v）：
1:1/10, 2:1/15, 3:1/20, 4:1/25
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表5. 乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度和料液比對萃取虎杖中的白藜蘆醇單因子 量表
Table 5. Estinated marginal means of ethanol concentration、extract time、extract temperature and ratio on extraction of trans-resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.