前言 - 以表面輔助雷射脫附游離質譜法偵測唾液中類固醇荷爾蒙

壹、雷射脫附游離質譜儀概述

一、質譜儀簡介¹

質譜儀是偵測物質質量和電荷的比值大小以分析離子，稱之為質荷比（mass to charge ratio；m/z），質譜儀系統主要分為五個部分：進樣系統（inlet）、離子源（ion source）、質量分析器（mass analyzer）、偵測器（detector）和資料處理系統（data system）。

進樣系統主要是將分析物送入儀器中，依分析物狀態或者需求會使用不同的進樣系統，使分析物可以分離或純化，常見的有氣相層析（gas chromatography；

GC）、高效能液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）、毛細管電泳（capillary Electrophoresis；CE）、固相探針（solids probe）、不鏽鋼目標盤

（stainless steel target plate）等。

分析物經過進樣系統在進入質譜分析前，需要將其離子化（ionization），目的是將分析物經過游離源處理後轉變成氣相的帶電離子，目前有許多不同的游離法針對各種不同的需求，常見的有電子撞擊游離法（electron-impact ionization；

EI）、化學游離法（chemical ionization；CI）、場脫附法（field desorption ionization；

FD）、快速原子撞擊法（fast atom bombardment；FAB）、雷射脫附游離法（laser desorption ionization；LDI）、大氣壓力化學游離法（atmosphere pressure chemical ionization；APCI）、電噴灑游離法（electron spray ionization；ESI）等。

分析物成為帶電離子後，需經過質量分析器將各個帶電離子分離，質量分析器主要是以質荷比的不同來分離各個離子的場所，常見的質量分析器有飛行時間

（time-of-flight, TOF）、四極柱（Quadrupole）、離子阱（ion trap）等。

最後經過質量分析器的帶電離子再經由偵測器偵測，此時的離子數量稀少，

因此偵測器需要具有將分析物離子增幅（multiplying）的功能，目前最常見的離子增幅偵測器為法拉地杯（Faraday cup）和達利偵測器又稱光電增幅器（Daly detector；photomultiplier；PMT）、微通道盤（micro channel plate；MCP）等，主要的目的是將微量的帶電離子增幅，其中達利偵測器大約可以增幅幅度為 10¹⁰，為目前增幅幅度最大的離子偵測器。

最後為資料處理系統，此部份主要將偵測器所接收到的離子轉換成電腦軟體可以接收的資料，大部分由儀器的製造商提供相關軟體，包含各種條件的控制及最後收到的圖譜設定等，此時離子偵測訊號會被轉換成圖譜的方式呈現給使用者，

由使用者進一步分析數據。

二、雷射脫附游離質譜儀之發展史

雷射脫附游離質譜法（laser desorption ionization mass spectrometry）是以紫外光雷射光源的能量傳遞給分析物，使分析物進行脫附並游離後進行質量分析的偵測技術。在分析物上可能會因為雷射直接施加能量過強而被破壞，或者無法有效脫附游離，因此需要透過可以吸收雷射能量的基質達到間接傳遞能量予分析物，

基質主要可以分成兩種：一是有機基質；一是無機基質。

其中有機基質的分析技術稱為基質輔助雷射脫附游離質譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS），在 1988 年時，Karas 和

Hillenkamp² 提出以可吸收雷射能量的有機基質與高分子蛋白混合進行偵測。

MALDI-MS 的技術主要於質譜分析前，先將分析物和大量可吸收紫外光雷射能量的有機基質進行混合，待分析物和有機基質乾燥形成共結晶後，上機施加雷射激發後，有機基質可以吸收雷射能量並傳遞能量給分析物，使分析物脫附與游離產生氣化的離子，再以質量分析器進行質荷比（mass to charge ratio, m/z）分析。

另外無機基質的分析技術稱為表面輔助雷射脫附游離質譜法（surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, SALDI-MS），在 1988 年時，Tanaka³ 等人則是利用鈷金屬粒子（Co，300Å）混合甘油當做基質，成功應用於偵測高分子量的蛋白質和聚合物，包含溶菌酶（lysozyme，14306 Da）、胰凝乳蛋白酶

（chymotrypsinogen，25717 Da）、聚丙二醇（poly(propylene glycol)，平均分子量 4 kDa）等分析物，但鈷不易取得且昂貴，因此此方法沒有被廣泛的應用及開發。在此之後，1995 年 Sunner⁴ 等人應用相同的概念以石墨粉末混合甘油當做基質，成功分析胜肽類樣品，並提出 SALDI 這個名詞的說法。SALDI 較 MALDI 具有優勢，因為 SALDI 不是使用有機基質，所以在低分子量的區域可以降低干擾訊號；

另外有機基質和分析物形成共結晶時，容易有結晶分布不均勻的情形產生，稱之為 sweet spot。當雷射光照射激發在 sweet spot 上時會有較強的訊號值，但並非每次實驗所產生的結晶皆相同，易造成再現性不佳，由文獻發現 SALDI 可以降低結晶不均勻的情況，因此 SALDI 具有很大發展潛力。

三、基質在雷射脫附游離質譜法之特性與游離機制

有機基質在 1988 年之後被大量應用在雷射脫附游離質譜儀以分析生物樣品

2-3 ，常見的基質有： α-Cyano-4-hydroxy cinnamic acid （ α-CHCA ）、

2,5-Dihydroxybenzoic acid（2,5-DHB）、Sinapinic acid（SA）等^5, ^6, ⁷。有機基質雖然被大量使用在生物樣品上，但對於質荷比小於 2000 的小分子容易造成干擾，

所以主要還是應用在蛋白質、胜肽、聚合物等大分子的分析物上。

無機基質在 1995 年被正式提出後⁴，已經被多方面探討，以白金（Platinum）

當做基質⁸、金奈米粒子⁹當作基質等，其中奈米（nanometer, nm）材料具有比表面積大、紫外光範圍吸收係數（molar absorptivity）較高、較容易進行表面化學修飾等性質，所以在小分子的研究中無機奈米材料逐漸成趨勢。

不論是有機基質或者無機基質，所扮演的角色主要是幫助分析物進行脫附游離。良好的基質可以形成良好的共結晶並有效的傳導能量予分析物，可以將特性

歸類如下¹⁰：所使用的基質應能吸收雷射波長並具有類似分析物的溶解特性，並且

可以快速有效率的傳遞能量給相鄰的分析物分子，使分析物可以得到足夠的能量脫附游離。基質亦扮演保護分析物的作用，通常會採用較大量的基質，分析物對基質的莫耳數比通常在 1：100 到 1：50,000 之間，主要會希望基質的濃度遠大於分析物，如此當雷射光照射激發時，其能量多數由基質分子吸收後再傳遞給分析物，不會直接照射在分析物上造成分析物的破壞，因此可以達到保護分析物的作用。分析物在脫附游離後，通常被偵測到的形式大多呈現質子化離子態（M＋

H^＋），所以基質亦擔任提供氫離子的角色，不同的基質可能會提供不同的離子，再

加上分析物的特性所以在質譜圖上也可以看到 M＋Na⁺、M＋K⁺ 等的加成鹽類訊號出現。

目前較被接受的游離機制為 Ehring¹¹ 等人提出的看法，雷射光源提供能量在分析物與基質之結晶體上，當紫外光雷射直接激發基質分子，此時基質分子在極

短的時間（nanoseconds）會處於激發態，同時一個或更多的光子會被吸收，進而產生具有極高反應性的基質自由基離子和一個自由電子（M⁺^+ e^-）；同時雷射能量在轉移至分析物上時，會使分析物從凝相（固相或液相）過渡成氣相，當相轉移的速率大於受熱分解的速率時，分析物分子能保持完整結構脫附游離至氣相^{12, 13}，被脫附的分析物分子和基質自由基離子會進行離子-分子反應，而產生分析物的分子離子。

四、雷射脫附游離質譜儀之飛行時間質量分析器裝置

雷射脫附游離質譜儀除了搭配基質來輔助游離之外，還需要有偵測器進行質量分析，最常見的是飛行時間（time-of-flight, TOF）質量分析器，通常分成直線型

（linear）、折返式（reflective）、W 型及多次折返型¹⁴，目前最常見的為直線型及折返式的為主。

此裝置主要由一個離子加速電場與無場區域（field-free region）所組成，經雷射照射後藉由基質輔助雷射脫附游離的分析物離子，在經過電場加速後會進入無場區域再繼續飛行至偵測器。不同分析物經過加速電場區時所得到的動能是相同的，因此不同質荷比（m/z）會有不同的飛行時間，當質荷比較大時，在經過電場的速度相對會較小，飛行的時間相對較長。因此不同質荷比的分析物離子經過加速電場後會因為質荷比大小的關係而有不同的飛行時間，再以此時間差換算出質荷比。當分析物為小分子時，利用折返式的飛行時間管可以拉長離子飛行的距離，

而使不同質荷比的小分子可以有效分離達到增加解析度的功用。

然而分析物在接受雷射進行脫附游離時，分析物離子的起始時間、空間和接受的能量轉換成動能分布很廣，無法讓相同質量與電荷的離子在同一時間抵達偵

測器，而造成訊號峰（signal peak）變寬降低解析度；因此發展遲製時間（delayed extraction）設計¹⁵，此技術主要在雷射照射激發分析物時先施加一個微弱的反向電場，將分析物離子拉在同一個起點後再施加加速電壓，如此設計可以使相同質荷比的離子同時間抵達偵測器，因此可以提高解析度，下圖為示意圖。

五、奈米粒子應用在雷射脫附游離法

奈米粒子材料因具有比表面積較大、紫外光範圍吸收係數較高之特性，在小分子的分析相對於有機基質具較少的干擾，當材料的尺寸縮小至奈米的大小時，

其能量狀態分布由連續轉變成量化的狀態，即量子效應。

以金奈米粒子而言，當尺寸縮小至奈米的大小時，其顆粒表面的自由電子照光後被激發，會在特定吸收波長的光子能量產生瞬間誘導式偶極，並以此頻率進行偶極震盪，而具有表面電漿共振現象；當金奈米粒子的顆粒為對稱的球型時，

其表面電漿共振的吸收主要在 520 nm 附近，所以容易會呈現酒紅色^{16, 17}。目前金奈米材料的合成已非常成熟，不同粒徑對分析物會有不同的結果，

Ressell 發現當金奈米粒子粒徑越小時，所測得的訊號強度越強¹⁸。而且可以和特

定分子有強作用力的特性，像是對硫醇基具非常強的鍵結作用力，因此修飾硫醇化合物或者針對硫醇類小分子¹⁹，可以有效作用並偵測，而且應用在 SALDI-MS

在文檔中以表面輔助雷射脫附游離質譜法偵測唾液中類固醇荷爾蒙 (頁 12-38)