本 實 驗 所 使 用 的 類 固 醇 賀 爾 蒙 標 準 品 黃 體 酮 （ progesterone ）、 睪 固 酮
（testosterone）、可體松（cortisone）、氫基可體松（hydrocortisone）購自 Sigma-Aldrich 公司。標準品以甲醇配製成 1×10-2 M 母液 （stock solution），避光保存於 4 ℃ 下 備用。實驗時，依當天所需濃度以甲醇稀釋之。
檸檬酸鈉（sodium citrate dihydrate）、四氯金酸鈉（sodium tetrachloroaurate(III) dihydrate ）、 檸 檬 酸 （ citric acid monohydrate ）、α- 氫 基 -4- 羥 基 桂 皮 酸
（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid；α-CHCA）購自 Sigma 公司；分析級氨水 28 %
（ammonium hydroxide solution）、HPLC 級甲醇（Methanol；MeOH）、氰甲烷
（acetonitrile；ACN）購自 J. T. Baker 公司。
石墨（graphite）、硝酸鈉（sodium nitrate；NaNO3）購自 Sigma-Aldrich 公司；
硫酸（sulfuric acid；H2SO4）、過錳酸鉀（potassium permanganate；KMnO4）購自 J.
T. Baker 公司；雙氧水 35 %（hydrogen peroxide solution，H2O2）購自Acros Organics 公司。實驗所需去離子水的部份其電阻值 ≧ 18.0 MΩ/cm 。
貳、 儀器
pH meter 製造商 HORIBA 型號 D-23
去離子水系統 製造商 Lotun technic. Co. 型號 Purity-SP 超高速離心機 製造商 SIGMA 型號 SIGMA 3K30 超音波震盪機 製造商 BRANSON 型號 1510
紫外可見光吸收儀 製造商 Perkin Elmer 型號 Lambda EZ210 減壓濃縮機 製造商 BUCHI 型號 R-210
吹氮機 製造商 Organomation Associates, Jnc 型號 N-EVAPTM 111 震盪機 製造商 DIGISYSTEM 型號 Vortex mixer VM-200
飛行時間質譜儀（TOF-MS）製造商 Bruker 型號 microflex 控制軟體 flexControl 版本 3.0
數據處理軟體 flexAnalysis 版本 3.0 96-well 不鏽鋼盤 製造商 Bruker
參、 SALDI-TOF-MS 條件
本實驗所採用的是 Bruker 公司的 microflex TOF-MS，搭配的飛行管長度為 196 公分，在正離子模式下以折返式偵測器進行偵測。所使用的氮氣雷射波長為 337 nm，加速電壓 20 kV，脈衝數 150 shot，頻率 10 Hz。SALDI 樣品製備：取 45 nM，13 nm 金奈米粒子內含緩衝溶液 0.096 mM pH 5.0 的檸檬酸銨 0.75 μL 點於 不鏽鋼樣品盤上，再取相同體積已配製好的分析物同樣點於不鏽鋼樣品盤上，接 著以可調式微量吸管（Pipette）直接於不鏽鋼樣品盤上以吸-排的方式進行混合的 動 作 ， 使 基 質 和 分 析 物 充 分 混 合 均 勻 。 待 基 質 、 分 析 物 完 全 乾 燥 後 即 可 以 SALDI-TOF-MS 偵測。
在 SALDI-TOF-MS 每次偵測前以 15 nM 的金奈米粒子進行校正質荷比，校 正的訊號為分別為 [K]+ 38.96 m/z 、 [Au]+ 196.966 m/z 、 [Au2]+ 393.932 m/z 、 [Au3]+ 590.899 m/z。
肆、實驗方法
一、金奈米合成
配製 50.0 mL（4.0 mM）的檸檬酸鈉溶液加入雙頸瓶中，架設於冷凝回流系 統下進行加熱與攪拌直至溶液劇烈沸騰，取 0.5 mL（100 mM）四氯金酸鈉溶液快 速加入雙頸瓶中，再持續攪拌加熱三分鐘。之後移除熱源並快速將雙頸瓶連同溶 液一起置於冰浴中冷卻至室溫。在加熱過程中，溶液會由一開始的淡黃色轉變成 深紫色，再漸漸形成酒紅色溶液。使用紫外可見光吸收儀（UV-visible spectrometer）
鑑定吸收波長，當吸收波長在 518-520 nm 時，金奈米粒子大小約為 13 nm，經由 計算後其金奈米粒子溶液濃度約為 15 nM。此為原始濃度金奈米粒子溶液，並避 光保存於 4 ℃ 冰箱中，每次使用前震盪混合均勻即可。鑑定金奈米粒子吸收波 長如 Fig. 2.，合成之金奈米粒子 TEM（transmission electron microscopy） 圖如 Fig.
3.，平均粒徑約為 13 nm。
金奈米粒子溶液濃度計算如下：
金的密度（ρ）：19.32 (g/cm3)
金奈米（AuNPs）體積：3 4 πr3 =43 × 3.1316 × (6.5×10-7)3 = 1.147 × 10-18 (cm3) 金奈米（AuNP）質量：m = ρv = 19.32 × 1.147 × 10-18 = 2.21 × 10-17 (g) 全部金的質量：1g = M × V × Mw
0.1 × 0.0005 × 197 = 0.00985 (g)
金奈米（AuNPs）粒子數：
全部金奈米質量
金奈米質量 = 0.009852.21 × 1017 = 4.46 × 1014 金奈米莫耳數：(4.46 × 1014) ÷ (6.02 × 1023) = 7.41 × 10-10
金奈米（AuNPs）濃度：M = moleV = 0.05 7.41 × 10-10 =14.82 × 10-9 ≒ 15 nM
Fig. 2. UV absorbance spectrum of AuNPs, the maximum absorbance was at 519 nm.
Fig. 3. TEM image of AuNPs.
300 400 500 600 700 800
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)
二、金奈米濃縮不同倍率
合成好的原始金奈米粒子取 1 mL 置於離心管中，以高速離心機進行離心；
離心機的設定條件 12000 rpm、10 分鐘。離心後將上清液去除 950 μL，並收集剩 餘的 50 μL 溶液，依相同方法收集多管於同一個離心管中，並使用紫外可見光吸 收儀鑑定，其最大吸收峰在 519 nm，同時和原始金奈米粒子之吸收進行比較，如 此即可判定金奈米粒子的濃縮倍率。原始濃度的金奈米粒子稀釋 10 倍，濃縮過 後的金奈米粒子則稀釋 100 倍，使用的計算公式：
原始金奈米吸收值 稀釋倍率（0.1） =
濃縮金奈米吸收值
稀釋倍率（0.01）
經由吸收值確認再計算後，我們所濃縮的金奈米粒子約為 26 倍（390 nM）
的金奈米粒子。紫外可見光吸收圖譜如 Fig. 4.。並以去離子水配製成不同濃度之 金奈米粒子： 7.5 、15 、45、75 及 105 nM，以此當做基質和分析物進行混合後 上機偵測。
Fig. 4. UV absorbance spectrum of AuNPs (a) with concentrated and (b) without.
三、石墨烯氧化物合成27
將 500 mg 的石墨（graphite）加入 500 mg 的硝酸鈉（NaNO3）及 24 mL 硫 酸（H2SO4）於 0 ℃下混合靜置 10 至 15 分鐘，維持 0 ℃下加入 3 g 過錳酸鉀
（KMnO4）反應 90 分鐘（此時顏色變化會由黑色轉變成墨綠色），移除冰塊改以 水浴 35 ℃ 攪拌 2 小時（此時顏色變化會由墨綠色轉變成紫紅色），再慢慢加入 20 mL 去離子水持續攪拌約 10 分鐘，之後加入 2.5 mL 35 % 的雙氧水（H2O2） 和 50 mL 去離子水並攪拌約 10 分鐘；以 16000 rpm 離心 10 分鐘後將上層去掉，
下層以去離子水回溶震盪，重複離心至去離子水震盪步驟並量 pH 值至 7 為止；
以去離子水回溶後超音波震盪 20 分鐘，再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，將上層去 掉後以去離子水回溶後震盪再以 5000 rpm 離心 5 分鐘，下層即為石墨烯氧化物
（graphene oxide）。
濃度的確認方法為取 1 mL 的石墨烯氧化物至圓底燒瓶中，以減壓濃縮的方 式至乾，進行秤重並重複三次取平均值，本實驗所合成的石墨烯氧化物的濃度約 為 20 mg/mL 換算後為 2 萬 ppm。
以去離子水配製不同濃度的石墨烯氧化物，每次配製前需將石墨烯氧化物於 超音波震盪中震開（約 20 分鐘），再以去離子水稀釋成所需的濃度。
本實驗所合成之石墨烯氧化物經由紫外可見光吸收儀鑑定吸收波長在 230 nm 時有最高吸收峰（Fig. 5.），經由 TEM 圖可以發現石墨烯氧化物為片狀的結 構（Fig. 6.）。
Fig. 5. UV absorbance spectrum of graphene oxide, the maximum absorbance was at 230 nm.
Fig. 6. TEM image of graphene oxide.
四、緩衝溶液配製
將檸檬酸（citric acid）及氨水（NH4OH）分別配製成 10.00 mM 的濃度，固 定檸檬酸的莫耳數及最後總體積，藉由改變氨水的莫耳數進行不同 pH 值的檸檬 酸銨配製（ammonium citrate），配製完成後再以 pH meter 鑑定 pH 值。配製方法 如下表配製，接著和濃縮金奈米粒子進行混合後方可當做基質。
不同濃度的檸檬酸銨則是以配製好不同 pH 值的原液，取已知體積並和濃縮 金奈米粒子進行混合，方可當做基質和分析物混合即可上機偵測。
Preparation of ammonium citrate buffer.
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 citrid acid, 10.00 mM (mL) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
NH4OH, 10.00 mM (mL) 0.40 1.00 1.50 2.00 2.35 3.00 5.00 H2O (mL) 9.10 8.50 8.00 7.50 7.15 6.50 4.50 pH of ammonium citrate 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 9.50 五、類固醇荷爾蒙
睪固酮、黃體酮、可體松、氫基可體松之母液（10 mM）配製成 1 × 10-4 M 的 稀釋液，以此稀釋液當作條件探討的依據，分別探討不同的奈米粒子、不同濃度 的金奈米粒子、檸檬酸銨濃度、檸檬酸銨的 pH 值及雷射強度對偵測訊號的影響。
五、唾液的收集52
唾液樣品取自一名健康女性（28 歲），收集前 10 分鐘不飲食，以飲用水漱 口三次，靜待 5 分鐘，利用微量吸管 1 mL 之吸管尖 （pipette tip）放置於嘴口，
並且將嘴口緊閉（避免唾液外漏）使唾液藉由吸管尖順流而下以 15 mL 離心管進 行收集，收集大約 10 分鐘的唾液後立即儲存於 -20 ℃ 冰箱，此方法收集的唾液
量大約為 10 至 13 mL，分析前於室溫下解凍後以 3000 rpm 離心 10 分鐘，取 上層不含氣泡之澄清液進行分析。
六、真實樣品處理
本實驗參考並修改 2011 年 Jensen 52及 2012 年 Turpeinen61 的方法，取唾液 1 mL 置於離心管中，加入乙酸乙酯或者乙醚 4 mL，進行液液萃取震盪 5 分鐘後，
再以 3500 rpm 離心 5 分鐘，將上層有機層取出以吹氮機吹乾後回溶 100 μL 甲 醇，即可點盤上機偵測。
第三章 實驗結果 壹、條件探討
本實驗主要的分析物為四種類固醇荷爾蒙：睪固酮（Testosterone）、黃體酮
（Progesterone）、可體松（Cortisone）、氫基可體松（Hydrocortisone），並探討不同 種類材料做為基質對每種分析物的能量傳遞和訊號的效果，所以需要找到最適和 的 SALDI-TOF-MS 分析條件。四種類固醇荷爾蒙在質譜圖得到之質荷比訊號分別 為 ： [testosterone+Na]+ = 311.42 m/z ， [progesterone+Na]+ = 337.46 m/z ， [cortisone+Na]+ = 383.44 m/z 及 [hydrocortisone+Na]+ = 385.46 m/z。Fig. 7. 為此四 種類固醇荷爾蒙之結構式和分子量，並針對以下相關的條件進行探討。
一、金奈米粒子及其他基質比較
本實驗將金奈米粒子和傳統的有機基質 α-CHCA 及石墨烯氧化物 （graphene oxide ）進行比較。原始配製出來的石墨烯氧化物為 2 萬 ppm 經去離子水稀釋 後分別配製成 2 千、2 百、20 、2 、0.2、 0.02 和 0.002 ppm 濃度，發現當石 墨烯氧化物在濃度為 0.2 ppm 時，具有較好的分析物訊號，並將此濃度的石墨烯 氧化物和金奈米粒子進行比較，類固醇荷爾蒙（睪固酮、黃體酮、可體松、氫基 可體松）的濃度皆為 1.000 × 10-4 M ，由 Fig. 8. 可以看到需要 27.57 μJ 的雷射 能量才能有較好的訊號值，而我們最佳化的金奈米粒子以 20.62 μJ 的雷射能量即 可有不錯的訊號值，推測可能的原因應是石墨烯氧化物和我們欲偵測的類固醇荷 爾蒙共結晶的效果不如預期，所以無法有效的將雷射能量傳遞與分析物。
接著亦與傳統有機基質 α-CHCA 進行比較，α-CHCA 的配製為 10 mg/mL溶 於 MeOH：ACN （v/v，1:1），經實驗比較發現 α-CHCA 得到的類固醇荷爾蒙訊 號 主 要 為 M+H+ 的 訊 號 ， 質 荷 比 分 別 為 [testosterone+H]+ = 289.42 ， [progesterone+H]+ = 315.46， [cortisone+H]+ = 361.44， 和 [hydrocortisone+H]+ = 363.46，前述有提到不同的基質可能提供給分析物不同的加成陽離子訊號，但並不 影響判斷。以 α-CHCA 為輔助基質時，在不含分析物的背景圖譜和金奈米粒子為 輔助基質時相比較，會有較多雜訊干擾，此外除了 M+H+ 的訊號外，還有部分 M+Na+ 的訊號，不論是在圖譜的判讀上或者定量上皆會有影響，因此經過比較後，
金奈米粒子當作類固醇荷爾蒙之輔助基質還是較適當的。
二、不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙訊號強度的影響
確認使用金奈米粒子為偵測類固醇荷爾蒙之輔助基質後，因不同濃度金奈米 粒子和分析物之間的結合及輔助游離效率不同，如果金奈米粒子濃度過高可能會 使分析物相對量變少，可能訊號強度反而減弱；過低則可能會無法有效地使分析 物脫附游離，故進行比較不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙（睪固酮、黃體 酮、可體松、氫基可體松）之分析訊號強度的影響。所偵測的類固醇荷爾蒙濃度 為 1 × 10-4 M ，將以離心方式濃縮的金奈米粒子隨後以去離子水回溶，分別配製 成 7.5 、15 、45、75 及 105 nM 之金奈米粒子。取不同濃度金奈米粒子 0.75 μL
確認使用金奈米粒子為偵測類固醇荷爾蒙之輔助基質後，因不同濃度金奈米 粒子和分析物之間的結合及輔助游離效率不同，如果金奈米粒子濃度過高可能會 使分析物相對量變少，可能訊號強度反而減弱；過低則可能會無法有效地使分析 物脫附游離，故進行比較不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙（睪固酮、黃體 酮、可體松、氫基可體松）之分析訊號強度的影響。所偵測的類固醇荷爾蒙濃度 為 1 × 10-4 M ，將以離心方式濃縮的金奈米粒子隨後以去離子水回溶，分別配製 成 7.5 、15 、45、75 及 105 nM 之金奈米粒子。取不同濃度金奈米粒子 0.75 μL