國立臺東大學生命科學研究所 碩士論文
指導教授：魏百祿 博士 共同指導教授：胡焯淳 博士
以表面輔助雷射脫附游離質譜法 偵測唾液中類固醇荷爾蒙
研 究 生： 陳靜慧 撰
中 華 民 國 一 百 零 一 年 七 月
國立臺東大學生命科學研究所 碩士論文
以表面輔助雷射脫附游離質譜法 偵測唾液中類固醇荷爾蒙
研 究 生： 陳靜慧 撰
指導教授： 魏百祿、胡焯淳 博士
中 華 民 國 一 百 零 一 年 七 月
謝誌
感謝我的指導教授胡焯淳老師給予我研究的機會，並在兩年的研 究生涯中鼓勵我並給我指導，讓我可以順利的進行實驗，尤其是在論 文撰寫時給我許多寶貴的建議，在我沒有自信時提供我正確的方向，
並適時的引導我讓我可以順利進行研究。感謝魏百祿老師、李炎老師、
劉炯錫老師在我遇到問題時大力幫忙，並謝謝謝明穆老師及邱泰嘉老 師擔任我的口考委員，許多的老師幫忙讓我能順利畢業。
也要感謝實驗室的學長姊及學弟妹，學長姊留下許多寶貴的資料 讓我可以減少很多碰壁的情形，其中要感謝以婷給我許多寶貴建議及 鼓勵；感謝實驗室的專題生：盈源、玫菁、郁佳、佳倚、明輝、志翔、
詩芸、爾懋、愷嶸、威廷、振維等等，大家都很幫忙我，不論是實驗 上的幫忙，或者一起吃飯閒聊降低我的壓力，一起討論實驗、期刊、
上台簡報等，讓我在研究生的生涯可以很順利。
最後要感謝我的父母及家人支持我讀研究所，並在我難過時給我 鼓勵，在我想放棄時給我加油打氣，當我忙碌時更是小心翼翼的不敢 吵我，提供宵夜讓我在忙碌之餘不會忘記填飽肚子。在讀研究所的過 程中，家人無怨無悔的付出，我的媽媽更是一直當我最大的後盾讓我 無後顧之憂。
想感謝的人許多，請容許我以畢業證書致上我的感謝，謝謝許多
幫助過我的人。
以表面輔助雷射脫附游離質譜法 偵測唾液中類固醇荷爾蒙
作 者 ： 陳 靜 慧
國 立 臺 東 大 學 生 命 科 學 研 究 所
摘 要
本 研究開發 利用表 面輔助雷 射脫附 游離質譜 法 (surface-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry, SALDI-MS) 偵測類固醇 荷爾蒙。所使用的基質為金奈米粒子(AuNPs)。分別檢驗四種類固醇荷 爾蒙：可體松、氫基可體松、黃體素、睪固酮。並探討金奈米粒子濃 度、檸檬酸銨濃度、檸檬酸銨的 pH 值及雷射強度對偵測訊號的影響。
最佳化的條件為使用雷射強度 20.62 μJ，及濃度為 45 nM 的金奈米粒 子並含有 pH 為 5 濃度為 0.096 mM 的檸檬酸銨。在此最佳化的條件 下，黃體酮、睪固酮、氫基可體松的線性範圍為 0.02 至 0.10 mM，而 可體松的範圍為 0.01 至 0.10 mM，所得到的 R
2達到 0.966 以上。
將此最佳化的條件應用於唾液樣品檢驗，前處理使用液液萃取法，並
比較乙酸乙酯和乙醚兩種有機溶劑的方法應用在添加類固醇荷爾蒙的
唾液中，發現乙酸乙酯有較好的萃取效果。此方法可以用在偵測唾液
中的類固醇荷爾蒙。
Detection of steroid hormones in saliva with surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
Ching-Hui Chen Abstract
In our study, we developed a steroid hormones analysis with surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (SALDI-MS) method. The Au nanoparticles (AuNPs) were used as SALDI matrices. We tested four steroid hormones: cortisone, hydrocortisone, progesterone, and testosterone. The effects of the concentrations of AuNPs, the concentrations of ammonium citrate buffer, pH of ammonium citrate buffer, and laser fluence on the signal intensity were investigated. The optimum conditions were contained 45 nM AuNPs as matrices prepared in 0.096 mM ammonium citrate (pH 5.0). The laser fluence was 20.62 μJ. Under these optimum conditions, the linear range of progesterone, testosterone, and hydrocortisone were from 0.02 to 0.10 mM, and the cortisone was from 0.01 to 0.10 mM, with R
2values of 0.966 or better. This method was applied to test of steroid hormones in saliva samples. We compared two liquid-liquid extraction systems including diethyl ether and ethyl acetate, and ethyl acetate was better than diethyl ether. This method can be applied to analyze steroid hormones in real sample.
Keywords：SALDI-MS, Au nanoparticles, steroid hormones, salivary
目 錄
摘 要 ... ii
Abstract ... iii
圖目錄 ... vi
表目錄 ... vii
第一章 前言 ... 1
壹、雷射脫附游離質譜儀概述 ... 1
一、質譜儀簡介 ... 1
二、雷射脫附游離質譜儀之發展史 ... 2
三、基質在雷射脫附游離質譜法之特性與游離機制 ... 3
四、雷射脫附游離質譜儀之飛行時間質量分析器裝置 ... 5
五、奈米粒子應用在雷射脫附游離法 ... 6
貳、類固醇荷爾蒙簡介 ... 9
一、類固醇荷爾蒙 ... 9
二、睪固酮（Testosterone） ... 10
三、黃體酮（Progesterone） ... 12
四、氫基可體松（Hydrocortisone）和可體松（Cortisone） ... 13
參、文獻回顧 ... 15
肆、研究目的 ... 26
第二章 材料與方法 ... 27
壹、 藥品 ... 27
貳、 儀器 ... 27
參、 SALDI-TOF-MS 條件 ... 28
肆、實驗方法 ... 29
一、金奈米合成 ... 29
二、金奈米濃縮不同倍率 ... 31
三、石墨烯氧化物合成 ... 32
四、緩衝溶液配製 ... 34
五、唾液的收集 ... 34
六、真實樣品處理 ... 35
壹、條件探討 ... 36
一、金奈米粒子及其他基質比較 ... 36
二、不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙訊號強度的影響 ... 37
三、不同 pH 值及濃度之檸檬酸銨緩衝溶液 ... 38
四、雷射強度對分析物的影響 ... 39
五、類固醇荷爾蒙之標準曲線 ... 40
貳、真實樣品的探討 ... 41
第四章 結論 ... 53
第五章 參考文獻 ... 54
圖目錄
Fig. 1. Steroid hormone synthesis pathways. ... 10 Fig. 2. UV absorbance spectrum of AuNPs, the maximum absorbance was at 519 nm. 30 Fig. 3. TEM image of AuNPs. ... 30 Fig. 4. UV absorbance spectrum of AuNPs (a.) with concentrated and (b.) without. .... 31 Fig. 5. UV absorbance spectrum of graphene oxide, the maximum absorbance was at
230 nm. ... 33 Fig. 6. TEM image of graphene oxide. ... 33 Fig. 7. Chemical structures of four steroid hormones. ... 42 Fig. 8. The mass spectroscopy of (a) blank was using 0.2 ppm graphene oxide as matrix
and (b) steroid hormones (1.0 × 10-4 M) were using 0.2 ppm graphene oxide as matrix; (c) blank was using 45 nM AuNPs ; 0.096 mM ammonium citrate (pH 5.0) as matrix and (d) steroid hormones (1.0 × 10-4 M) were using 45 nM AuNPs ; 0.096 mM ammonium citrate (pH 5.0) as matrix. The laser fluence set at (a) 27.57 μJ (b) 27.57 μJ (c) 20.62 μJ and (d) 20.62 μJ, respectively. ... 43 Fig. 9. The intensity of steroid hormones in different concentration of AuNPs. ... 44 Fig. 10. The intensity of steroid hormones in various pH of ammonium citrate buffers
and laser fluence set at 20.62 μJ. ... 45 Fig. 11. The intensity of steroid hormones in 45 nM AuNPs and various concentration of ammonium citrate buffers (pH 5.0). ... 46 Fig. 12. The mass spectroscopy of steroid hormones in different laser fluence. (a)
without sample, and (b) to (g) with steroid hormones (1.0 × 10-4 M). ... 47 Fig. 13. The mass spectroscopy of steroid hormones (1.0 × 10-4 M) in optimum
conditions. The conditions were using 45 nM AuNPs as matrices prepared in 0.096 mM ammonium citrate (pH 5.0) and the laser fluence set at 20.62 μJ. ... 48 Fig. 14. Standard curves for progesterone, testosterone, and hydrocortisone in the range
of 0.02-0.10 mM, the cortisone in the range of 0.01-0.10 mM. Linear regression lies were obtained with R2 values of 0.966 or better. The conditions were the same as those described in Fig. 13. ... 49 Fig. 15. Intensities of SALDI-MS signals of steroid hormones in various extraction
were the same as those described in Fig. 13. ... 51 Fig. 16. The mass spectroscopy of steroid hormones in saliva extracted with ethyl
acetate. The conditions were the same as those described in Fig. 13. ... 52
表目錄
Table 1. The analysis conditions collected from previous studies... 18 Table 2. LOD, LOQ, linear range and R2 of analytes. ... 50
第一章 前言
壹、雷射脫附游離質譜儀概述
一、質譜儀簡介1
質譜儀是偵測物質質量和電荷的比值大小以分析離子，稱之為質荷比（mass to charge ratio；m/z），質譜儀系統主要分為五個部分：進樣系統 （inlet）、離子 源（ion source）、質量分析器（mass analyzer）、偵測器（detector）和資料處理系 統（data system）。
進樣系統主要是將分析物送入儀器中，依分析物狀態或者需求會使用不同的 進樣系統，使分析物可以分離或純化，常見的有氣相層析（gas chromatography；
GC）、高效能液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）、毛細管 電泳（capillary Electrophoresis；CE）、固相探針（solids probe）、不鏽鋼目標盤
（stainless steel target plate）等。
分析物經過進樣系統在進入質譜分析前，需要將其離子化（ionization），目 的是將分析物經過游離源處理後轉變成氣相的帶電離子，目前有許多不同的游離 法針對各種不同的需求，常見的有電子撞擊游離法 （electron-impact ionization；
EI）、化學游離法（chemical ionization；CI）、場脫附法（field desorption ionization；
FD）、快速原子撞擊法（fast atom bombardment；FAB）、雷射脫附游離法 （laser desorption ionization；LDI）、大氣壓力化學游離法（atmosphere pressure chemical ionization；APCI）、電噴灑游離法（electron spray ionization；ESI）等。
分析物成為帶電離子後，需經過質量分析器將各個帶電離子分離，質量分析 器主要是以質荷比的不同來分離各個離子的場所，常見的質量分析器有飛行時間
（time-of-flight, TOF）、四極柱（Quadrupole）、離子阱（ion trap）等。
最後經過質量分析器的帶電離子再經由偵測器偵測，此時的離子數量稀少，
因此偵測器需要具有將分析物離子增幅（multiplying）的功能，目前最常見的離 子增幅偵測器為法拉地杯（Faraday cup）和達利偵測器又稱光電增幅器（Daly detector；photomultiplier；PMT）、微通道盤（micro channel plate；MCP）等，主 要的目的是將微量的帶電離子增幅，其中達利偵測器大約可以增幅幅度為 1010， 為目前增幅幅度最大的離子偵測器。
最後為資料處理系統，此部份主要將偵測器所接收到的離子轉換成電腦軟體 可以接收的資料，大部分由儀器的製造商提供相關軟體，包含各種條件的控制及 最後收到的圖譜設定等，此時離子偵測訊號會被轉換成圖譜的方式呈現給使用者，
由使用者進一步分析數據。
二、雷射脫附游離質譜儀之發展史
雷射脫附游離質譜法（laser desorption ionization mass spectrometry）是以紫外 光雷射光源的能量傳遞給分析物，使分析物進行脫附並游離後進行質量分析的偵 測技術。在分析物上可能會因為雷射直接施加能量過強而被破壞，或者無法有效 脫附游離，因此需要透過可以吸收雷射能量的基質達到間接傳遞能量予分析物，
基質主要可以分成兩種：一是有機基質；一是無機基質。
其中有機基質的分析技術稱為基質輔助雷射脫附游離質譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS），在 1988 年時，Karas 和
Hillenkamp2 提出以可吸收雷射能量的有機基質與高分子蛋白混合進行偵測。
MALDI-MS 的技術主要於質譜分析前，先將分析物和大量可吸收紫外光雷射能量 的有機基質進行混合，待分析物和有機基質乾燥形成共結晶後，上機施加雷射激 發後，有機基質可以吸收雷射能量並傳遞能量給分析物，使分析物脫附與游離產 生氣化的離子，再以質量分析器進行質荷比（mass to charge ratio, m/z）分析。
另外無機基質的分析技術稱為表面輔助雷射脫附游離質譜法（surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, SALDI-MS），在 1988 年時，Tanaka3 等人則是利用鈷金屬粒子（Co，300Å）混合甘油當做基質，成功應用於偵測高分 子量的蛋白質和聚合物，包含溶菌酶（lysozyme，14306 Da）、胰凝乳蛋白酶
（chymotrypsinogen，25717 Da）、聚丙二醇（poly(propylene glycol)，平均分子量 4 kDa）等分析物，但鈷不易取得且昂貴，因此此方法沒有被廣泛的應用及開發。在 此之後，1995 年 Sunner4 等人應用相同的概念以石墨粉末混合甘油當做基質，成 功分析胜肽類樣品，並提出 SALDI 這個名詞的說法。SALDI 較 MALDI 具有優 勢，因為 SALDI 不是使用有機基質，所以在低分子量的區域可以降低干擾訊號；
另外有機基質和分析物形成共結晶時，容易有結晶分布不均勻的情形產生，稱之 為 sweet spot。當雷射光照射激發在 sweet spot 上時會有較強的訊號值，但並非每 次實驗所產生的結晶皆相同，易造成再現性不佳，由文獻發現 SALDI 可以降低 結晶不均勻的情況，因此 SALDI 具有很大發展潛力。
三、基質在雷射脫附游離質譜法之特性與游離機制
有機基質在 1988 年之後被大量應用在雷射脫附游離質譜儀以分析生物樣品
2-3 ， 常 見 的 基 質 有 ： α-Cyano-4-hydroxy cinnamic acid （ α-CHCA ）、
2,5-Dihydroxybenzoic acid（2,5-DHB）、Sinapinic acid（SA）等5, 6, 7。有機基質雖 然被大量使用在生物樣品上，但對於質荷比小於 2000 的小分子容易造成干擾，
所以主要還是應用在蛋白質、胜肽、聚合物等大分子的分析物上。
無機基質在 1995 年被正式提出後4，已經被多方面探討，以白金（Platinum）
當做基質8、金奈米粒子9當作基質等，其中奈米（nanometer, nm）材料具有比表面 積大、紫外光範圍吸收係數（molar absorptivity）較高、較容易進行表面化學修飾 等性質，所以在小分子的研究中無機奈米材料逐漸成趨勢。
不論是有機基質或者無機基質，所扮演的角色主要是幫助分析物進行脫附游 離。良好的基質可以形成良好的共結晶並有效的傳導能量予分析物，可以將特性
歸類如下10：所使用的基質應能吸收雷射波長並具有類似分析物的溶解特性，並且
可以快速有效率的傳遞能量給相鄰的分析物分子，使分析物可以得到足夠的能量 脫附游離。基質亦扮演保護分析物的作用，通常會採用較大量的基質，分析物對 基質的莫耳數比通常在 1：100 到 1：50,000 之間，主要會希望基質的濃度遠大 於分析物，如此當雷射光照射激發時，其能量多數由基質分子吸收後再傳遞給分 析物，不會直接照射在分析物上造成分析物的破壞，因此可以達到保護分析物的 作用。分析物在脫附游離後，通常被偵測到的形式大多呈現質子化離子態 （M＋
H＋），所以基質亦擔任提供氫離子的角色，不同的基質可能會提供不同的離子，再
加上分析物的特性所以在質譜圖上也可以看到 M＋Na+、M＋K+ 等的加成鹽類訊 號出現。
目前較被接受的游離機制為 Ehring11 等人提出的看法，雷射光源提供能量在 分析物與基質之結晶體上，當紫外光雷射直接激發基質分子，此時基質分子在極
短的時間（nanoseconds）會處於激發態，同時一個或更多的光子會被吸收，進而 產生具有極高反應性的基質自由基離子和一個自由電子（M++ e-）；同時雷射能量 在轉移至分析物上時，會使分析物從凝相（固相或液相）過渡成氣相，當相轉移 的速率大於受熱分解的速率時，分析物分子能保持完整結構脫附游離至氣相12, 13， 被脫附的分析物分子和基質自由基離子會進行離子-分子反應，而產生分析物的分 子離子。
四、雷射脫附游離質譜儀之飛行時間質量分析器裝置
雷射脫附游離質譜儀除了搭配基質來輔助游離之外，還需要有偵測器進行質 量分析，最常見的是飛行時間（time-of-flight, TOF）質量分析器，通常分成直線型
（linear）、折返式（reflective）、W 型及多次折返型14，目前最常見的為直線型及 折返式的為主。
此裝置主要由一個離子加速電場與無場區域（field-free region）所組成，經雷 射照射後藉由基質輔助雷射脫附游離的分析物離子，在經過電場加速後會進入無 場區域再繼續飛行至偵測器。不同分析物經過加速電場區時所得到的動能是相同 的，因此不同質荷比（m/z）會有不同的飛行時間，當質荷比較大時，在經過電場 的速度相對會較小，飛行的時間相對較長。因此不同質荷比的分析物離子經過加 速電場後會因為質荷比大小的關係而有不同的飛行時間，再以此時間差換算出質 荷比。當分析物為小分子時，利用折返式的飛行時間管可以拉長離子飛行的距離，
而使不同質荷比的小分子可以有效分離達到增加解析度的功用。
然而分析物在接受雷射進行脫附游離時，分析物離子的起始時間、空間和接 受的能量轉換成動能分布很廣，無法讓相同質量與電荷的離子在同一時間抵達偵
測器，而造成訊號峰（signal peak）變寬降低解析度；因此發展遲製時間（delayed extraction）設計15，此技術主要在雷射照射激發分析物時先施加一個微弱的反向電 場，將分析物離子拉在同一個起點後再施加加速電壓，如此設計可以使相同質荷 比的離子同時間抵達偵測器，因此可以提高解析度，下圖為示意圖。
五、奈米粒子應用在雷射脫附游離法
奈米粒子材料因具有比表面積較大、紫外光範圍吸收係數較高之特性，在小 分子的分析相對於有機基質具較少的干擾，當材料的尺寸縮小至奈米的大小時，
其能量狀態分布由連續轉變成量化的狀態，即量子效應。
以金奈米粒子而言，當尺寸縮小至奈米的大小時，其顆粒表面的自由電子照 光後被激發，會在特定吸收波長的光子能量產生瞬間誘導式偶極，並以此頻率進 行偶極震盪，而具有表面電漿共振現象；當金奈米粒子的顆粒為對稱的球型時，
其表面電漿共振的吸收主要在 520 nm 附近，所以容易會呈現酒紅色16, 17。 目前金奈米材料的合成已非常成熟，不同粒徑對分析物會有不同的結果，
Ressell 發現當金奈米粒子粒徑越小時，所測得的訊號強度越強18。而且可以和特
定分子有強作用力的特性，像是對硫醇基具非常強的鍵結作用力，因此修飾硫醇 化合物或者針對硫醇類小分子19，可以有效作用並偵測，而且應用在 SALDI-MS 上明顯降低低分子量的干擾。
應用於雷射脫附游離法的奈米粒子材料非常廣泛，最常見的為金奈米粒子9, 20,
21、銀奈米粒子22、二氧化鈦（TiO2）奈米粒子23、硫化鋅（ZnS）奈米粒子24、碲 化汞（HgTe）奈米結構25, 26、最近發展的石墨烯（graphene）27, 28 等。
其中石墨烯為最近發展的表面輔助基質材料，其和傳統基質相比具有容易製 備的優點、良好的脫附游離效率及良好的重複性，且背景干擾較小，因此石墨烯 是極具有潛力的奈米材料 。
石墨烯是由碳原子緊密排列成蜂窩狀晶格的二維（two-dimensional；2D）單 層平面結構，早期石墨烯被認為是無法以單獨穩定的結構存在，然而在 2004 年 時，由 Geim 和 Novoselov 意外地發現單獨存在的石墨烯，他們也因「二維的石 墨烯材料之開創性實驗」在 2010 年得到諾貝爾物理獎，之後石墨烯更被廣泛的 探討研究。Geim 團隊將石墨片以膠帶黏著兩側，撕開膠帶後薄片也一分為二，不
斷重複此過程即可得到僅由一層碳原子構成之「石墨烯」。
石墨烯是一種半金屬或零能隙半導體，且在室溫狀況下具有很高的電子遷移 率（electron mobility），因其具有明顯的雙極電場效應可以使電子遷移率高達 15,000 cm2V−1s−1，行為類似無靜止質量的迪拉克（Dirac） 粒子，幾乎每個被石墨 烯吸收的光子皆能產生電子電洞對，這些電子電洞對可以轉換成電流，適合作為 光電材料。雖然石墨烯僅由一層原子構成，但因迪拉克電子讓石墨烯具有極寬的 吸收光譜範圍，從可見光至遠紅外光範圍内都可以吸收入射光的 2.3 %，這些吸收
的光子能轉換成電流而應用在光電材料上29。
石墨烯的製備主要分成含機械剝離法（mechanical exfoliation）30、磊晶成長法
（Epitaxial growth）31、化學氣相沈積法32（chemical vapor deposition, CVD）及化 學剝離法（chemical exfoliation）等。其中化學剝離法則可略分為：（1）由超音波 震盪以剝離或離子插層石墨塊，（2）氧化石墨塊來剝離出石墨烯氧化物。用化學 剝離法容易量產或者進行化學改質，目前實驗幾乎以化學法進行製備石墨烯。因 石墨烯特殊的吸收光譜範圍故被用在雷射脫附游離質譜法的應用上。
貳、類固醇荷爾蒙簡介
一、類固醇荷爾蒙
類固醇荷爾蒙主要是從膽固醇（cholesterol）的分子結構為基礎合成的，其結 構包含三個六碳環及一個五碳環組成的四環核心結構之衍生物，人體生成類固醇
荷爾蒙之器官為腎上腺及性腺（卵巢、胎盤及睪丸），分泌量的多寡由腦部的下視
丘、腦下垂體及腎上腺皮質共同控制。首先膽固醇經由 cytochrome P450 side chain cleavage （P450scc）轉換成孕烯醇酮（pregnenolone），再轉換成不同種類的類固 醇荷爾蒙，主要的合成途徑如 Fig. 1. 33：
膽固醇為類固醇荷爾蒙之主要來源，經由分解酶細胞轉換成不同的荷爾蒙，
包含黃體酮（progesterone）又稱為黃體素或孕酮、氫基可體松（hydrocortisone）、
睪固酮（testosterone）及其他雌激素或雄激素等。
類固醇荷爾蒙和人體的生理調節有很密切的相關，包含內分泌系統、壓力適 應、代謝、生殖等，健康成人可以穩定生成類固醇荷爾蒙，所以藉由監測類固醇 荷爾蒙在人體的含量變化可以評估身體狀態。類固醇荷爾蒙在血液中與血漿蛋白 結合，主要是和球蛋白（globulin）及白蛋白（albumin）結合而成的結合態，大約 占了 98 % ，只有 2-3 % 是游離態34。當類固醇荷爾蒙為結合態時，因為分子量 較大不易通過血管壁的細胞膜，唯有游離態的形式可以透過滲透的方式到唾液中，
因此唾液中含有微量的游離態類固醇荷爾蒙35。游離態的睪固酮在健康人體中的血
清及唾液具有顯著的相關性，其相關性 R = 0.71（p < 0.001），在唾液中游離態睪 固酮含量大約為 193.7 ± 6.7 pg/mL36，另外研究發現男性唾液中的氫基可體松和黃
體酮的濃度具有正相關（正相關：氫基可體松濃度上升時，黃體酮的濃度亦是呈
現上升的趨勢），女性則是服用避孕藥者具有正相關；氫基可體松和黃體酮皆具有
早上濃度較高並逐漸遞減的日變化，而睪固酮則和黃體酮的濃度變化沒有太大的
相關性37，因此藉由唾液中的類固醇荷爾蒙含量可以當作生物標記的參考，所含的
濃度大約為 pg/mL 的範圍，並可以當作患者進行荷爾蒙治療時的生理監控的依 據。
Fig. 1. Steroid hormone synthesis pathways33.
二、睪固酮（Testosterone）
睪固酮（Testosterone）在男性是由睪丸所分泌；女性則是由卵巢和腎上腺合 成。其分泌控制軸為下視丘-腦下腺前葉-性腺軸（hypothalamo-pituitary-gonads axis,
HPG 軸 ）33。 此 控 制 軸 具 有 負 迴 饋 之 效 應 ， 當 下 視 丘 分 泌 性 釋 素
（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）會刺激腦下腺前葉分泌兩種性促素濾泡 刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone, LH），
這兩種性促素再分別刺激性腺產生性類固醇（sex steroids）、抑制素（inhibin）、精 子或卵子生成；當性腺被移除時，會發現濾泡刺激素和黃體生成素的分泌會較未
移除前多，這說明了負迴饋的機制38，此負迴饋機制可以控制睪丸藉由抑制素能穩
定分泌睪固酮及雄性激素。睪固酮分泌量的降低是因血液中睪固酮濃度降低，至 使性促素的含量升高，此為負迴饋作用減少所致。
因負迴饋機制使人體可以自我調節睪固酮的分泌量，此迴饋機制正常運作時 能使睪丸穩定分泌睪固酮使濃度恆定。睪固酮具有年節律（annual rhythmic）的周
期變化，一月份時的睪固酮濃度在血清及唾液中含量達最低；六月份為高峰39。然
而睪固酮的分泌量會隨著年齡及老化而減少，男性在二十至二十五歲之間睪固酮 分泌量達到最高峰40。
睪固酮主要和第二性徵有關，因此當男性邁入更年期時可能會有睪固酮缺乏 的情形產生，容易造成男性性腺機能衰退。在臨床上的診斷主要以血清中雄性荷 爾蒙濃度為依據，其中睪固酮濃度低於 8 nmol/L 時，即診斷為性腺機能衰退；高 於 12 nmol/L 診斷為正常，介於中間則需要進行進一步評估診斷41，長期睪固酮缺 乏可能會有心血管疾病和二型糖尿病的風險，主要是睪固酮缺乏和代謝症候群有
極大相關性42。另外當女性體內睪固酮濃度含量過低時，容易造成卵巢早衰；當濃
度過高時則會造成多毛症、多卵巢疾病和男性化等43，因此睪固酮的含量多寡不論
在男性或女性皆占有重要的地位。
三、黃體酮（Progesterone）
黃體酮（progesterone）又稱黃體素或助孕酮，具有穩定子宮內膜以利精子著 床 之 功 用 ， 其 分 泌 控 制 軸 和 睪 固 酮 是 一 樣 的 ： 下 視 丘 - 腦 下 腺 前 葉 - 性 腺 軸
（hypothalamo-pituitary-gonads axis, HPG 軸），亦具有負迴饋機制。其調控具有週 期性，大約 28 天為一個週期，以女性生理期來潮第一天至排卵期間稱為濾泡期
（follicular phase）；排卵後至下次生理期來潮前稱為黃體期（luteal phase）生理期 來潮此為完整的一個週期38。
濾泡期時，由腦下腺前葉分泌濾泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）促進
濾泡生長，濾泡期間雌二醇增加會刺激黃體生成素分泌的效應（正迴饋），造成黃
體生成素遽升再遽降，稱為黃體生成素急放（LH surge），黃體生成素急放造成葛 氏濾泡（graafian follicle）壁破裂而排卵38。
在黃體期時，黃體會同時分泌雌二醇（estradiol）和黃體酮，高濃度的雌二醇 和黃體酮及黃體所分泌的抑制素會共同抑制濾泡刺激素和黃體生成素的分泌，這 可以阻止其他新的濾泡發育，避免黃體期產生額外的排卵。黃體期末期因抑制素 降低，黃體功能開始退化，使雌二醇和黃體酮濃度降至非常低的濃度，造成生理 期來潮38。
口服避孕藥的使用即是服用動情愫（主要為雌二醇）和黃體酮，連續服用三 週並在第四週停止；此目的為提供身體有高濃度的雌二醇和黃體酮，如此會分泌 抑制素避免濾泡發育而沒有排卵，主要是利用負迴饋機制抑制人體排卵再藉由第 四週停止服用時可造成生理期來潮38。
女性介於更年期會面臨停經，因卵巢中的濾泡耗盡，其分泌雌二醇、黃體酮 和抑制素的能力降低，造成卵巢變化引起生理的症狀。最常發生的症狀為骨質疏 鬆及其他心理上變化，主要的原因是女性荷爾蒙在停經後分泌減少，因此需要補 充雌二醇和黃體酮減少生理上的不適及骨質疏鬆的產生44。
四、氫基可體松（Hydrocortisone）和可體松（Cortisone）
氫基可體松（hydrocortisone）又稱作皮質醇（cortisol），是人類主要的糖皮質
素，由束狀帶或網狀帶分泌45。其主要分泌的控制軸為下視丘-腦下腺前葉-腎上腺
皮質軸（hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis, HPA 軸）46，此控制軸亦具有類 似的負迴饋效應。氫基可體松和其他糖皮質素在代謝方面有許多作用，如刺激糖 質新生作用（gluconeogenesis）和抑制葡萄糖的利用，以幫助升高血糖值；促進脂 肪分解和釋出游離脂肪。
1936 年 Hans Selye47 發現將牛的卵巢萃取物注射至老鼠體內會刺激腎上腺 皮質的生長，以及其他有害的藥物也會造成類似的結果，Selye 解釋這些刺激稱為 壓 力 因 子 （ stressor ）， 在 有 壓 力 的 情 況 下 ， 腦 下 腺 前 葉 的 腎 上 腺 皮 促 素
（adrenocorticotropic hormone, ACTH）分泌量會增加，因此在此控制軸上的糖皮質 素分泌增加，當腎上腺皮促素（ACTH） 分泌量增加會刺激腎上腺皮質分泌氫基 可體松。
HPA 路徑軸在自我平衡過程中扮演重要的角色，此路徑會反應在嘗試調整日
常壓力及放鬆上48，尤其是在身體面臨壓力下是主要的生理反應，因此氫基可體松
已經被當作是生理壓力的生物標記49, 50。另外，氫基可體松具有晝夜規律的特點，
尤其是在早上醒來 30 分鐘後會上升51，並隨著時間的推移而逐漸遞減，Jensen 也 在 2011 年以液相層析串聯質譜儀證明52。
因腎上腺皮質所分泌的糖皮質素（如氫基可體松）在人體受到壓力時，會被
大量分泌，可以抑制免疫系統活性和發炎反應並暫緩非必要的生理機制53，因此在
臨床上使用可體松（cortisone）和其結構類似物（prednisone）來治療發炎疾病和 抑制器官移植的排斥作用。目前氫基可體松的研究也以在有壓力下人體唾液中的 含量為主，亦有學者針對台灣實習的護專學生進行實習壓力和唾液中氫基可體松
濃度的相關性，目前結果是沒有顯著相關，所以可能還有待進一步驗證54。
參、文獻回顧
1983 年 Riad-Fahmy 以免疫酵素法測定唾液中的氫基可體松的晝夜節律並 以唾液中的黃體酮當作監控卵巢功用的生物指標55。1999 年 Bentley 則測定唾液 中的雌二醇（estradiol）及黃體酮在懷孕女性及非懷孕女性時的濃度，並和血清中 濃度進行比較，確認唾液中的雌二醇及黃體酮濃度可用來監測卵巢狀態56。在 2001 年時，Hofman 監測唾液中類固醇荷爾蒙還有胜肽類荷爾蒙，主要是監測女性生育 週期、更年期波動，壓力和其他日變化，並和血清中結合態的荷爾蒙濃度比較，
可以由唾液中的游離態荷爾蒙濃度有效的監測人體內的荷爾蒙濃度，且唾液採樣
法相較於其他方法，如抽血；具非侵入性可以長期監控並容易取得樣品之優點57。
1984 年 Vittek 針對比較有無牙周炎疾病的男性及停經後女性在唾液中的類 固醇荷爾蒙之濃度關係，進行研究主要是以放射免疫分析偵測唾液中的睪固酮、
黃體酮、氫基可體松及其他荷爾蒙，發現患有牙周炎之患者的唾液中黃體酮濃度 會增加；在患有糖尿病或非糖尿病的女性牙周炎患者的唾液中睪固酮濃度顯著增 加，而在沒有牙周炎及糖尿病的患者則沒有明顯的濃度變化。此篇證明在牙周炎 疾病患者的類固醇荷爾蒙是具有關連性的58。
Marie Aarrebo Jensen 團隊於 2011 年開發並評估液相層析串聯電噴灑游離質 譜儀之方法（LC-ESI-MS/MS），同時測量褪黑激素（melatonin）、氫基可體松、睪 固酮。前處理使用液-液萃取法後端的儀器搭配 LC-ESI-MS/MS 偵測，並使用正 離子和多重反應監測模式（Multiple Reaction Monitoring
,
MRM）進行偵測。唾液 樣品直接以吐的方式至樣品管收集，取唾液樣品 250 μL 加入 1 mL 乙酸乙酯進 行萃取，最後以 10 % MeOH 回溶 250 μL 分析。此方法所得褪黑激素、皮質醇、睪固酮之偵測極限 （LOD）分別為 4.1、 0.27 及 10.8 pmol/L。並真實應用在四 位志願者之唾液進行晝夜規律之分析52。
Alejandro Gutierrez 團隊於 2010 年開發穩定同位素稀釋法搭配液相層析電 子捕捉大氣壓力化學游離質譜法（ECAPCI-MS），定量人類血漿中類固醇荷爾蒙，
包含雌酮（ estrone；E1） 分析物及其代謝物並與 pentafluorobenzyl （PFB）進 行衍生化，可測得的範圍在在 attomole 的濃度。E1-PFB （E1 和 PFB 進行衍生 化縮寫為：E1-PFB）的偵測極限是 740 attomole，另外使用 LC 偵測血漿中 E2 及 其代謝物，濃度範圍為 5 pg/mL 至 2,000 pg/mL。此法可以偵測低濃度之類固醇 荷爾蒙59。
Tai-Chia Chiu 於 2011 年發表使用兒茶素修飾二氧化鈦奈米粒子分析類固醇 荷爾蒙，搭配表面輔助雷射脫附游離質譜儀。使用氮氣雷射時，兒茶素修飾二氧 化鈦奈米粒子在 337 nm 有明顯吸收峰因此可以當作有效的 SALDI 基質。此實 驗分析四種類固醇荷爾蒙： 可體松、氫基可體松、黃體酮及睪固酮，其偵測極限
（LOD）分別為 1.62 μM、 0.70 μM、 0.66 μM 、 0.23 μM ，此四種分析物皆有 良好的定量線性（R2 > 0.986），並能實際應用於真實樣品尿液中60。
Ursula Turpeinen 團隊於 2012 年開發以液相層析串聯質譜儀同時偵測唾液 中睪固酮及雄二酮（androstendione），添加 100 μL 同位素標記當作內標並以乙醚 進行萃取，之後以 LC-MS/MS 於正離子模式下分析 。睪固酮與雄二酮之線性範 圍皆為 20-1000 pmol/L；平均回收率為 97-102%。此實驗健康志願者為 83 人（男 性 36 人，女性 47 人），並將測得濃度之 2.5 % - 97.5 % 當作參考範圍，其中最 大值 97.5 % 的濃度：男性的睪固酮和雄二酮分別為 356 pmol/L 及 344 pmol/L；
女性則為 39 pmol/L 和 349 pmol/L。此 LC-MS/MS 在需要定量低濃度睪固酮及
雄二酮的唾液樣品分析中，具有快速、靈敏、簡單、不需衍生化之優點61。
將相關文獻資料整理於 Table 1，並針對分析物、方法、條件和結果進行探討，
發現多數的實驗方法為市售的 Coat-A-Count 125I 免疫酵素法為主要分析法，再進 行其他相關性的研究；此外除了分析類固醇荷爾蒙外還有分析其他雌激素及雄激 素，應用分析的真實樣品包含人類的血漿、唾液、尿液還有藥品的濃度含量等，
有此可知，類固醇荷爾蒙在分析上佔有很重要的角色。
另外，還有使用 LC-MS/MS 的分析方法，搭配前處理使偵測極限可以更低，
目前文獻顯示可以偵測到的濃度為 pmol/L 範圍。唾液中游離態類固醇荷爾蒙的含 量極低，需要較靈敏的方法或者利用濃縮的方式得以偵測之。
Table 1. The analysis conditions collected from previous studies.
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
estradiol progesterone testosterone
salivary collect saliva
Vials were closed and frozen immediately.
Samples were freed from mucopolysaccarides other residuals by several freeze-thaw cycles with subsequent centrifugation.
solid-phase
Coat-A-Count 125I radioimmunoassays
measured in duplicate for 2 min on a
γ-counter (Wallac-Oy 1277 GammaMaster) after mixing,
incubation, and decanting.
normally cycling and oral contraceptives women had elevated levels of affiliation motivation and decreased levels of power motivation at midcycle.
62
Progesterone (P) Testosterone (T)
salivary collect saliva.
Vials were closed and frozen immediately.
Samples were freed from mucopolysaccarides
and other residuals by several freeze-thaw cycles with subsequent centrifugation.
solid-phase
Coat-A-Count 125I radioimmunoassays
measured in duplicate for 2 min on a
γ-counter (Wallac -Oy 1277 GammaMaster) after mixing,
incubation, and decanting.
aroused affiliation motivation has a specific stimulatory effect on P, whereas aroused power motivation has a specific stimulatory effect on T in men, but not in women, with high baseline T levels.
63
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
progesterone cortisol
salivary collect saliva.
Vials were closed and frozen immediately.
Samples were freed from mucopolysaccarides
and other residuals by several freeze-thaw cycles with subsequent centrifugation.
solid-phase
Coat-A-Count 125I radioimmunoassays
measured in duplicate for 2 min on a
γ-counter (Wallac-Oy 1277 GammaMaster) after mixing,
incubation, and decanting.
progesterone is released from the adrenal along with cortisol in humans, due to general adrenal activation and/or possibly as an additional negative feedback mechanism to down-regulate the stress response.
37
Testosterone Progesterone Hydrocortisone Cortisone Estrone Estradiol Estriol
Trisequens Trisequens tablets were
dissolved in 3 mL MeOH:H2O 60:40 (v/v).
sonication for 30 min centrifuged at 5000 rpm the supernatant was collected
CE-UV Micellar electrokinetic chromatography (MEKC) using a cationic surfactant, cetyltrimethylamm onium bromide (CTAB)
at -25 kV using 100 mM Tris-boric acid buffer (pH 9.0) containing 40 mM CTAB and 20%
2-propanol
LOD (μM) Cortisone 1.3 Hydrocortisone 1.5 Estriol 1.7
Testosterone 1.3 Estrone 1.2 Progesterone 1.3 Estradiol 1.2
64
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
Estrone (E1) Estradiol (E2) Estriol (E3)
human urine
Urine samples hydrolysis and extraction
organic phase was collected evaporation
Solutions of ammonium citrate (0.5 mM, pH 10.0, 987.5 μL) and Ag NPs (1.7 nM, 12.5 μL) were added to the dried urine samples and equilibrated for 30 min centrifuged
SALDI-MS analysis
SALDI-MS Matrix : Silver Nanoparticles
1.25 m flight tube laser fluence was adjusted to slightly higher than the threshold (102 μJ) 250 laser shots
limits of detection for E1, E2, and E3 being 2.23, 0.23, and 2.11 μM, respectively.
22
estrone （E1）
2-methoxy-E2 4-methoxy-E2 16α-hydroxy-E2 2-methoxy-E1 4-methoxy-E1 16α-hydroxy-E1
Human plasma
Reaction mixtures contained 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) steroid (36 μM DHTG, 45 μM DHTS or TibS), 0.5 mM NADPH, and 4% methanol 450 μL of total volume
addition of purified enzyme and incubated for 0–90 min at 37 °C
LC-Electrospray Ionization (ESI)-MS Negative mode
SunFire C8 column (4.6 × 150 mm, 3.5 μm Waters)
Jupiter C18 column (2.0 × 150 mm, 5 μm, Phenomenex,
Torrance, CA) Solvent A was 5 mM aqueous ammonium acetate in water, and
The method was validated for the simultaneous analysis of plasma E2 and its metabolites:
2-methoxy-E2, 4-methoxy-E2, 16α-hydroxy-E2, estrone (E1), 2- methoxy-E1,
59
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
extracted twice with 1.5 mL water-saturated ethyl acetate organic extracts were
vacuum dried
re-dissolved in 200 μL 50%
methanol
solvent B was 5 mM ammonium acetate in acetonitrile.
capillary temperature 220 °C, capillary voltage − 4 V, tube lens offset 10 V, nitrogen was used for the sheath gas at 80 psi
4-methoxy-E1, and 16α-hydroxy-E1 from 5 pg/mL to 2,000 pg/mL.
testosterone cortisol progesterone
Salivary 400 μL of the saliva samples, standards, and controls were pipetted into antibody-coated tubes
incubate overnight
solid-phase
Coat-A-Count 125I radioimmunoassays
-
Progesterone was found to be reliable after collapsing across sex. Oral contraceptive use was associated with lower levels of
testosterone, but did not affect cortisol.
65
melatonin cortisol testosterone
Salivary the samples centrifuged at 3500 g for 10 min.
250 μL of a saliva sample 63 μL internal standard and add
LC-ESI-MS/MS auto sampler 8 ℃ column oven 40 ℃ flow rate: 0.5 mL/min A: water
The limits of detection were 4.1 pmol/L, 0.27 nmol/L and 10.8 pmol/L for melatonin,
52
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
shaken for 45 min then centrifuged at 3500 g, 5 min The ethyl acetate layers was poured off and evaporated to dryness under nitrogen
The residues were redissolved in 250 μL 10% MeOH
acetate 0.1% (v/v) formic acid B: MeOH
2 mM ammonium acetate 0.1% (v/v) formic acid
testosterone, respectively.
Estrogens Androgens
Bovine colostrum
A volume of 3 mL of a mixture of tert-butyl methyl ether (MTBE) with petroleum ether (PE; 30:70 MTBE/PE, v/v) was added to all (besides butter oil) samples
homogenized 20 min centrifuged at 4000 rpm for 15 min at 18 ℃.
Organic phases were evaporated.
The extraction was repeated organic phases were
combined and evaporated.
Extracts were then
LC-MS/MS Luna C18(2), 150×3 mm, 3 μm particle size (Phenomenex,
Torrance, CA) C18 guard column, 4×3 mm (Phenomenex) column oven : at 25 ± 2 ℃
positive electrospray ionization (ESI)
Upmost determined concentrations were found in the fat fraction, with 25.56 and 7.59 μg/L for estrone and androstendione, respectively.
In defatted milk and colostrum powder, conjugated estrogens dominated, whereas total (free and conjugated) estrone (5.51 μg/L; 15.0
66
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
redissolved in 100 μL of sample diluent (estrogens and androgenst progesterone)
μg/kg) exceeded estradiol-17R (2.66 μg/L; 7.5 μg/kg) and estradiol-17β (2.28 μg/L; 3.3 μg/kg).
Cortisone Hydrocortisone Progesterone Testosterone
Human urine
a 50 mL aliquot of urine, 0.02 g sodium acetate and 0.25 g L-ascorbic acid were added 10 μL glucuronidase/sulfatase from Helix pomatia (Type H-2) and incubated overnight at 37 ℃.
10-mL urine samples were subjected to slow inverse extraction using 20 mL dichloromethane under centrifugation at 10 rpm for 30 min
organic phase were collected and then subjected to
evaporation under vacuum
SALDI-MS catechin-modified titanium dioxide nanoparticles (TiO2 NPs) as matrices
1.25 m flight Tube 337 nm nitrogen laser (50 μm diameter) 10 Hz (pulse duration:
4 ns)
Delayed extraction period of 200 ns The available
accelerating voltages are in the range +20 to
−20 kV
250 laser shots
The limits of detection at a signalto-noise ratio of 3 for cortisone, hydrocortisone, progesterone, and testosterone were 1.62, 0.70, 0.66, and 0.23 μM, respectively.
This approach provides good quantitative linearity for the four analytes (R2 > 0.986) with good reproducibility
60
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
μL of 10 mM HNO3 (pH 2.0) and 12.5 μL of 240 nM catechin-modified TiO2 NPs solution were added for 30 min
nonpolar lipids studied
cholesterol 5α-cholestane cholesta-3,5-diene squalene
β-carotene
-
Cholesterol and five steroids were dissolved in MeOH 100 μL of each solution was deposited on thin Titanium foils (12.5 μm) by
electrospray deposition The solvent was allowed to evaporate after sample deposition, and the foil was transferred to the sample support stage of the LIAD probe
A linear
quadrupole ion trap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) was used to examine the same analytes by using ESI and APCI.
ESI conditions: spray voltage, 4.5–5 kV;
sheath gas flow, 10 (arbitrary units);
capillary temperature 275 ℃
APCI conditions:
vaporizer temperature, 450 ℃; sheath gas flow rate, 50 (arbitrary units); auxiliary gas flow rate, 5 (arbitrary units); capillary temperature, 275 ℃;
tube lens, 15 V
LIAD/ClMn(H2O)+ is the only method examined that is suitable for the mass spectrometry
characterization of underivatized
saturated hydrocarbon lipids
APCI (but not ESI) can be used to analyze unsaturated
hydrocarbons.
67
Analytes Real
Sample Preparation Analysis system Analysis condition Results Ref.
Testosterone Androstendione
Salivary To 100 μL of saliva 20 μL of 5 nmol/L IS in 50% MeOH in water (v/v) was added
The steroids were extracted for 3 min with 3 mL diethyl ether in a multi-tube vortexer.
at room temperature for 15 min
organic phase was dried under nitrogen
The residue was dissolved in 100 μL of 50% MeOH in water (v/v)
LC–MS/MS operating in the positive mode electrospray ionization (ESI) after separation on a reversed-phase column
Sunfire C18 column (2.1×50 mm, 3.5 μm) at 35 °C
flow rate : 300 μL/min The mobile phase was a linear gradient consisting of 200 μmol/L ammonium acetate (A) and MeOH (B).
The gradient was: 0 min, 50% B; 1.5 min, 95% B; 3.5 min 95%
B; 4 min 50% B; and 10 min 50% B.
multiple-reaction
monitoring (MRM) mode
probe temperature 500
°C; and ionspray voltage 5500 V
The limit of
quantitation (LOQ) was 10 pmol/L for both Steroids
The mean recovery of the analytes added to saliva ranged from 97 to 102%.
The upper limit (the 97.5 percentile) of testosterone and androstendione reference ranges for males was 356 pmol/L and 344 pmol/L and that for females 39 pmol/L and 349 pmol/L, respectively.
61
肆、研究目的
文獻中目前針對類固醇賀爾蒙的偵測主要以 LC-MS/MS 及免疫酵素分析法 進行偵測，所要耗費的偵測時間相對較多，且免疫酵素分析法容易有誤判造成高 估的情形出現，使用 SALDI-MS 則具有高通量且方便的優勢。唾液在生物樣品的 採樣上屬於容易取得，且和血液樣品相比具有非侵入性的優點，再加上唾液中的
類固醇荷爾蒙於常溫下穩定期為兩週65，因此屬於保存較容易的生物樣品。
類固醇荷爾蒙已被用來進行生理方面的監測，包含女性生育週期、更年期的 波動、壓力和其他的日變化，也用來監測卵巢功能、類固醇荷爾蒙和牙周炎之間 的關聯等，因唾液樣品容易取得又不具侵入性，可以長期和需要監測的患者建立 合作關係；唾液中類固醇荷爾蒙具穩定性，所以可以監測在家中非住院的患者，
因此唾液樣品具有很大的發展潛能。
在雷射脫附游離質譜法的研究中，基質的選擇占了很重要的地位，由文獻回 顧中發現有機基質較容易出現結晶不均勻的情形，且在小分子範圍會有較大的干 擾，另外奈米材料具有比表面積大、紫外光範圍吸收係數較高之特性，所以本研 究選擇以無機基質當作實驗基質。
由文獻回顧尚未發現將 SALDI-MS 應用於唾液中類固醇荷爾蒙的分析，因此 本研究主要是以 SALDI-MS 搭配奈米粒子作為基質針對四種類固醇荷爾蒙：睪固 酮、黃體酮、可體松和氫基可體松進行相關的研究及條件探討，包含不同奈米粒 子和濃度、pH 值的影響、緩衝溶液的濃度、雷射能量等，期望找到最佳化的條件 搭配奈米粒子即可有效偵測唾液中類固醇荷爾蒙。
第二章 材料與方法 壹、 藥品
本 實 驗 所 使 用 的 類 固 醇 賀 爾 蒙 標 準 品 黃 體 酮 （ progesterone ）、 睪 固 酮
（testosterone）、可體松（cortisone）、氫基可體松（hydrocortisone）購自 Sigma-Aldrich 公司。標準品以甲醇配製成 1×10-2 M 母液 （stock solution），避光保存於 4 ℃ 下 備用。實驗時，依當天所需濃度以甲醇稀釋之。
檸檬酸鈉（sodium citrate dihydrate）、四氯金酸鈉（sodium tetrachloroaurate(III) dihydrate ）、 檸 檬 酸 （ citric acid monohydrate ）、α- 氫 基 -4- 羥 基 桂 皮 酸
（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid；α-CHCA）購自 Sigma 公司；分析級氨水 28 %
（ammonium hydroxide solution）、HPLC 級甲醇（Methanol；MeOH）、氰甲烷
（acetonitrile；ACN）購自 J. T. Baker 公司。
石墨（graphite）、硝酸鈉（sodium nitrate；NaNO3）購自 Sigma-Aldrich 公司；
硫酸（sulfuric acid；H2SO4）、過錳酸鉀（potassium permanganate；KMnO4）購自 J.
T. Baker 公司；雙氧水 35 %（hydrogen peroxide solution，H2O2）購自Acros Organics 公司。實驗所需去離子水的部份其電阻值 ≧ 18.0 MΩ/cm 。
貳、 儀器
pH meter 製造商 HORIBA 型號 D-23
去離子水系統 製造商 Lotun technic. Co. 型號 Purity-SP 超高速離心機 製造商 SIGMA 型號 SIGMA 3K30 超音波震盪機 製造商 BRANSON 型號 1510
紫外可見光吸收儀 製造商 Perkin Elmer 型號 Lambda EZ210 減壓濃縮機 製造商 BUCHI 型號 R-210
吹氮機 製造商 Organomation Associates, Jnc 型號 N-EVAPTM 111 震盪機 製造商 DIGISYSTEM 型號 Vortex mixer VM-200
飛行時間質譜儀（TOF-MS）製造商 Bruker 型號 microflex 控制軟體 flexControl 版本 3.0
數據處理軟體 flexAnalysis 版本 3.0 96-well 不鏽鋼盤 製造商 Bruker
參、 SALDI-TOF-MS 條件
本實驗所採用的是 Bruker 公司的 microflex TOF-MS，搭配的飛行管長度為 196 公分，在正離子模式下以折返式偵測器進行偵測。所使用的氮氣雷射波長為 337 nm，加速電壓 20 kV，脈衝數 150 shot，頻率 10 Hz。SALDI 樣品製備：取 45 nM，13 nm 金奈米粒子內含緩衝溶液 0.096 mM pH 5.0 的檸檬酸銨 0.75 μL 點於 不鏽鋼樣品盤上，再取相同體積已配製好的分析物同樣點於不鏽鋼樣品盤上，接 著以可調式微量吸管（Pipette）直接於不鏽鋼樣品盤上以吸-排的方式進行混合的 動 作 ， 使 基 質 和 分 析 物 充 分 混 合 均 勻 。 待 基 質 、 分 析 物 完 全 乾 燥 後 即 可 以 SALDI-TOF-MS 偵測。
在 SALDI-TOF-MS 每次偵測前以 15 nM 的金奈米粒子進行校正質荷比，校 正的訊號為分別為 [K]+ 38.96 m/z 、 [Au]+ 196.966 m/z 、 [Au2]+ 393.932 m/z 、 [Au3]+ 590.899 m/z。
肆、實驗方法
一、金奈米合成
配製 50.0 mL（4.0 mM）的檸檬酸鈉溶液加入雙頸瓶中，架設於冷凝回流系 統下進行加熱與攪拌直至溶液劇烈沸騰，取 0.5 mL（100 mM）四氯金酸鈉溶液快 速加入雙頸瓶中，再持續攪拌加熱三分鐘。之後移除熱源並快速將雙頸瓶連同溶 液一起置於冰浴中冷卻至室溫。在加熱過程中，溶液會由一開始的淡黃色轉變成 深紫色，再漸漸形成酒紅色溶液。使用紫外可見光吸收儀（UV-visible spectrometer）
鑑定吸收波長，當吸收波長在 518-520 nm 時，金奈米粒子大小約為 13 nm，經由 計算後其金奈米粒子溶液濃度約為 15 nM。此為原始濃度金奈米粒子溶液，並避 光保存於 4 ℃ 冰箱中，每次使用前震盪混合均勻即可。鑑定金奈米粒子吸收波 長如 Fig. 2.，合成之金奈米粒子 TEM（transmission electron microscopy） 圖如 Fig.
3.，平均粒徑約為 13 nm。
金奈米粒子溶液濃度計算如下：
金的密度（ρ）：19.32 (g/cm3)
金奈米（AuNPs）體積：3 4 πr3 =43 × 3.1316 × (6.5×10-7)3 = 1.147 × 10-18 (cm3) 金奈米（AuNP）質量：m = ρv = 19.32 × 1.147 × 10-18 = 2.21 × 10-17 (g) 全部金的質量：1g = M × V × Mw
0.1 × 0.0005 × 197 = 0.00985 (g)
金奈米（AuNPs）粒子數：
全部金奈米質量
金奈米質量 = 0.009852.21 × 1017 = 4.46 × 1014 金奈米莫耳數：(4.46 × 1014) ÷ (6.02 × 1023) = 7.41 × 10-10
金奈米（AuNPs）濃度：M = moleV = 0.05 7.41 × 10-10 =14.82 × 10-9 ≒ 15 nM
Fig. 2. UV absorbance spectrum of AuNPs, the maximum absorbance was at 519 nm.
Fig. 3. TEM image of AuNPs.
300 400 500 600 700 800
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)
二、金奈米濃縮不同倍率
合成好的原始金奈米粒子取 1 mL 置於離心管中，以高速離心機進行離心；
離心機的設定條件 12000 rpm、10 分鐘。離心後將上清液去除 950 μL，並收集剩 餘的 50 μL 溶液，依相同方法收集多管於同一個離心管中，並使用紫外可見光吸 收儀鑑定，其最大吸收峰在 519 nm，同時和原始金奈米粒子之吸收進行比較，如 此即可判定金奈米粒子的濃縮倍率。原始濃度的金奈米粒子稀釋 10 倍，濃縮過 後的金奈米粒子則稀釋 100 倍，使用的計算公式：
原始金奈米吸收值 稀釋倍率（0.1） =
濃縮金奈米吸收值
稀釋倍率（0.01）
經由吸收值確認再計算後，我們所濃縮的金奈米粒子約為 26 倍（390 nM）
的金奈米粒子。紫外可見光吸收圖譜如 Fig. 4.。並以去離子水配製成不同濃度之 金奈米粒子： 7.5 、15 、45、75 及 105 nM，以此當做基質和分析物進行混合後 上機偵測。
Fig. 4. UV absorbance spectrum of AuNPs (a) with concentrated and (b) without.
三、石墨烯氧化物合成27
將 500 mg 的石墨（graphite）加入 500 mg 的硝酸鈉（NaNO3）及 24 mL 硫 酸（H2SO4）於 0 ℃下混合靜置 10 至 15 分鐘，維持 0 ℃下加入 3 g 過錳酸鉀
（KMnO4）反應 90 分鐘（此時顏色變化會由黑色轉變成墨綠色），移除冰塊改以 水浴 35 ℃ 攪拌 2 小時（此時顏色變化會由墨綠色轉變成紫紅色），再慢慢加入 20 mL 去離子水持續攪拌約 10 分鐘，之後加入 2.5 mL 35 % 的雙氧水（H2O2） 和 50 mL 去離子水並攪拌約 10 分鐘；以 16000 rpm 離心 10 分鐘後將上層去掉，
下層以去離子水回溶震盪，重複離心至去離子水震盪步驟並量 pH 值至 7 為止；
以去離子水回溶後超音波震盪 20 分鐘，再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，將上層去 掉後以去離子水回溶後震盪再以 5000 rpm 離心 5 分鐘，下層即為石墨烯氧化物
（graphene oxide）。
濃度的確認方法為取 1 mL 的石墨烯氧化物至圓底燒瓶中，以減壓濃縮的方 式至乾，進行秤重並重複三次取平均值，本實驗所合成的石墨烯氧化物的濃度約 為 20 mg/mL 換算後為 2 萬 ppm。
以去離子水配製不同濃度的石墨烯氧化物，每次配製前需將石墨烯氧化物於 超音波震盪中震開（約 20 分鐘），再以去離子水稀釋成所需的濃度。
本實驗所合成之石墨烯氧化物經由紫外可見光吸收儀鑑定吸收波長在 230 nm 時有最高吸收峰（Fig. 5.），經由 TEM 圖可以發現石墨烯氧化物為片狀的結 構（Fig. 6.）。
Fig. 5. UV absorbance spectrum of graphene oxide, the maximum absorbance was at 230 nm.
Fig. 6. TEM image of graphene oxide.
四、緩衝溶液配製
將檸檬酸（citric acid）及氨水（NH4OH）分別配製成 10.00 mM 的濃度，固 定檸檬酸的莫耳數及最後總體積，藉由改變氨水的莫耳數進行不同 pH 值的檸檬 酸銨配製（ammonium citrate），配製完成後再以 pH meter 鑑定 pH 值。配製方法 如下表配製，接著和濃縮金奈米粒子進行混合後方可當做基質。
不同濃度的檸檬酸銨則是以配製好不同 pH 值的原液，取已知體積並和濃縮 金奈米粒子進行混合，方可當做基質和分析物混合即可上機偵測。
Preparation of ammonium citrate buffer.
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 citrid acid, 10.00 mM (mL) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
NH4OH, 10.00 mM (mL) 0.40 1.00 1.50 2.00 2.35 3.00 5.00 H2O (mL) 9.10 8.50 8.00 7.50 7.15 6.50 4.50 pH of ammonium citrate 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 9.50 五、類固醇荷爾蒙
睪固酮、黃體酮、可體松、氫基可體松之母液（10 mM）配製成 1 × 10-4 M 的 稀釋液，以此稀釋液當作條件探討的依據，分別探討不同的奈米粒子、不同濃度 的金奈米粒子、檸檬酸銨濃度、檸檬酸銨的 pH 值及雷射強度對偵測訊號的影響。
五、唾液的收集52
唾液樣品取自一名健康女性（28 歲），收集前 10 分鐘不飲食，以飲用水漱 口三次，靜待 5 分鐘，利用微量吸管 1 mL 之吸管尖 （pipette tip）放置於嘴口，
並且將嘴口緊閉（避免唾液外漏）使唾液藉由吸管尖順流而下以 15 mL 離心管進 行收集，收集大約 10 分鐘的唾液後立即儲存於 -20 ℃ 冰箱，此方法收集的唾液
量大約為 10 至 13 mL，分析前於室溫下解凍後以 3000 rpm 離心 10 分鐘，取 上層不含氣泡之澄清液進行分析。
六、真實樣品處理
本實驗參考並修改 2011 年 Jensen 52及 2012 年 Turpeinen61 的方法，取唾液 1 mL 置於離心管中，加入乙酸乙酯或者乙醚 4 mL，進行液液萃取震盪 5 分鐘後，
再以 3500 rpm 離心 5 分鐘，將上層有機層取出以吹氮機吹乾後回溶 100 μL 甲 醇，即可點盤上機偵測。
第三章 實驗結果 壹、條件探討
本實驗主要的分析物為四種類固醇荷爾蒙：睪固酮（Testosterone）、黃體酮
（Progesterone）、可體松（Cortisone）、氫基可體松（Hydrocortisone），並探討不同 種類材料做為基質對每種分析物的能量傳遞和訊號的效果，所以需要找到最適和 的 SALDI-TOF-MS 分析條件。四種類固醇荷爾蒙在質譜圖得到之質荷比訊號分別 為 ： [testosterone+Na]+ = 311.42 m/z ， [progesterone+Na]+ = 337.46 m/z ， [cortisone+Na]+ = 383.44 m/z 及 [hydrocortisone+Na]+ = 385.46 m/z。Fig. 7. 為此四 種類固醇荷爾蒙之結構式和分子量，並針對以下相關的條件進行探討。
一、金奈米粒子及其他基質比較
本實驗將金奈米粒子和傳統的有機基質 α-CHCA 及石墨烯氧化物 （graphene oxide ）進行比較。原始配製出來的石墨烯氧化物為 2 萬 ppm 經去離子水稀釋 後分別配製成 2 千、2 百、20 、2 、0.2、 0.02 和 0.002 ppm 濃度，發現當石 墨烯氧化物在濃度為 0.2 ppm 時，具有較好的分析物訊號，並將此濃度的石墨烯 氧化物和金奈米粒子進行比較，類固醇荷爾蒙（睪固酮、黃體酮、可體松、氫基 可體松）的濃度皆為 1.000 × 10-4 M ，由 Fig. 8. 可以看到需要 27.57 μJ 的雷射 能量才能有較好的訊號值，而我們最佳化的金奈米粒子以 20.62 μJ 的雷射能量即 可有不錯的訊號值，推測可能的原因應是石墨烯氧化物和我們欲偵測的類固醇荷 爾蒙共結晶的效果不如預期，所以無法有效的將雷射能量傳遞與分析物。
接著亦與傳統有機基質 α-CHCA 進行比較，α-CHCA 的配製為 10 mg/mL溶 於 MeOH：ACN （v/v，1:1），經實驗比較發現 α-CHCA 得到的類固醇荷爾蒙訊 號 主 要 為 M+H+ 的 訊 號 ， 質 荷 比 分 別 為 [testosterone+H]+ = 289.42 ， [progesterone+H]+ = 315.46， [cortisone+H]+ = 361.44， 和 [hydrocortisone+H]+ = 363.46，前述有提到不同的基質可能提供給分析物不同的加成陽離子訊號，但並不 影響判斷。以 α-CHCA 為輔助基質時，在不含分析物的背景圖譜和金奈米粒子為 輔助基質時相比較，會有較多雜訊干擾，此外除了 M+H+ 的訊號外，還有部分 M+Na+ 的訊號，不論是在圖譜的判讀上或者定量上皆會有影響，因此經過比較後，
金奈米粒子當作類固醇荷爾蒙之輔助基質還是較適當的。
二、不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙訊號強度的影響
確認使用金奈米粒子為偵測類固醇荷爾蒙之輔助基質後，因不同濃度金奈米 粒子和分析物之間的結合及輔助游離效率不同，如果金奈米粒子濃度過高可能會 使分析物相對量變少，可能訊號強度反而減弱；過低則可能會無法有效地使分析 物脫附游離，故進行比較不同濃度的金奈米粒子對類固醇荷爾蒙（睪固酮、黃體 酮、可體松、氫基可體松）之分析訊號強度的影響。所偵測的類固醇荷爾蒙濃度 為 1 × 10-4 M ，將以離心方式濃縮的金奈米粒子隨後以去離子水回溶，分別配製 成 7.5 、15 、45、75 及 105 nM 之金奈米粒子。取不同濃度金奈米粒子 0.75 μL 和類固醇荷爾蒙 0.75 μL 直接於不鏽鋼樣品盤上混合後待乾燥，進行上機偵測。
由 Fig. 9. 的結果顯示，使用 45 nM 的金奈米粒子在睪固酮、黃體酮、可體 松及氫基可體松有較好的訊號強度，由結果發現黃體酮在金奈米粒子 105 nM 時，
松較不明顯，但仍可以由結果看出 45 nM 訊號強度最強，故選擇 45 nM 的金奈 米粒子當作最佳化的濃度。
三、不同 pH 值及濃度之檸檬酸銨緩衝溶液
添加緩衝溶液主要是預期降低 pH 的變化，調整不同 pH 值的變化主要在正 離子條件下，可以增加分析物的游離化，使氫離子能有效地轉移，pH 值稍微偏酸 一點時，通常可以有較好的游離效果，且基質和分析物之間的雷射能量傳遞可以 更好，並減少 sweet spot 的干擾，故針對 pH 值及檸檬酸銨緩衝溶液濃度進行探 討。將前述配製的 pH 值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 9.5 檸檬酸銨緩衝溶 液，分別使檸檬酸銨緩衝溶液末濃度為 0.096 mM 和 45 nM 的金奈米粒子混合後 以此當作基質，取基質 0.75 μL 和類固醇荷爾蒙 0.75 μL 直接於不鏽鋼樣品盤上 混合後待乾燥，上機偵測。
由 Fig. 10. 可以明顯發現睪固酮、黃體酮及可體松在 pH 為 5 時的檸檬酸銨 緩衝溶液有明顯較高的訊號強度，另外氫基可體松則較不明顯，因此將 pH 為 5 的檸檬酸銨緩衝溶液當作最佳化的條件。
不同濃度之檸檬酸銨亦會影響訊號的強度，因此以 pH 為 5 的檸檬酸銨緩衝 溶液並將末濃度配製為0、0.0385、0.096、0.192、0.288、0.385 及 0.400 mM 及 45 nM 的金奈米粒子當作基質，並以此基質和類固醇荷爾蒙於盤上混合後待乾燥，上 機偵測。
由 Fig. 11. 明顯發現在睪固酮、黃體酮、可體松、氫基可體松有較強的分析 訊號當搭配 0.096 mM 的檸檬酸銨時，因此 pH 為 5 及末濃度為 0.096 mM 的 檸檬酸銨為最佳化的條件。
