第二章 文獻回顧
6. 溴離子
自然環境水體中多少都存在著微量的溴離子，而溴離子會與含氯 消毒劑作用，進而間接式的影響鹵乙酸物種的變化。含氯消毒劑首先 與水反應，根據pH產生次氯酸(HOCl)、次氯酸鹽(OCl-)或氯氣(Cl2) 等不同型式之具消毒力的分子或離子(反應式1、2)。而這些分子與離 子在與溴離子反應產生次溴酸(HOBr)、次溴酸離子(OBr)或溴氣 (Br2)(反應式3、4、5)，接著再和水中天然有機物作用，產生含溴之 鹵乙酸物種。(Dalvi et al. 2000)
由上述反應可知，溴離子會與含氯消毒劑的氯離子共同競爭與天 然有機物反應。研究指出，對HAAs而言，當水中氯溴比(CL2/Br-)增 加時，會促使BCAA、DCAA、TCAA增加，DBAA減少，如圖 2-4所示。研 究中也發現，HOBr對天然有機物氧化產生二鹵乙酸的能力是HOCl的25 倍 (Chang et al. 2001)。
Cl2 + H2O → HOCl + H+ + Cl- （1）
HOCl → OCl- +H+ （2）
HOCl + Br- → BrCl + OH- → HOBr + Cl- + H+ （3）
OCl- +Br- → OBr- + Cl- （4）
Br2 + H2O → HOBr +H+ +Br- （5）
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目前普遍將 Total Organic halides (TOX)濃度做為 DBPs 的指 標之一，已有實驗證實，當飲用水體中 TOX 會隨溴離子濃度增高而增 加。而研究也顯示 THMs 與 HAAs 在適當的 pH 條件下(pH 9 for THMs；
pH5~7 for HAAs )，水體中溴離子濃度越高，THMs 與 HAAs 的濃度也 會越高(Pourmoghaddas and Stevens 1995)。
2-4 含鹵乙酸與微生物之關係
自然環境中的微生物已被證實可以降解含鹵乙酸。生物利用的方 式包含在好氧的環境下進行共代謝或是直接以含鹵乙酸做為獨立碳 源 (Lignell et al. 1984; Yu et al. 1995)。
Ellis針對四種含鹵乙酸；MCAA、DCAA、TCAA與TFA;研究其代謝 過程中的可能化學機制與中間代謝產物，並比較此四種含鹵乙酸在人 工水池中被微生物降解速度的快慢(初始鹵乙酸濃度約20ug/mL)。研 究結果說明，鹵乙酸除TFA外都可被微生物所降解，生物性降解發生 時，初步會利用酵素水解，將Cl-C之間的共價鍵打斷，使得氯脫離乙 酸，而釋放出氯離子。MCAA中間代謝產物為 glycolic acid、DCAA 為glyoxalic、TCAA為oxalic acid。圖 2-5。三種含鹵乙酸在人工水
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池中降解的速度:DCAA>MCAA>TCAA (Ellis et al. 2001)。
McRae以汙水處理廠取得之biomass分別用MCAA與TCAA做為 獨立碳源進行微生物馴養。馴養後的biomass以PCR-DGGE分析微生物 菌群結構，也將biomass上的微生物轉接(transfer)至含有MCAA or TCAA的Agar plate上。DGGE圖譜分析結果顯示，MCAA馴養後之菌群，
主要屬於α- orβ-substitution of Proteobacteria，而TCAA馴養 之菌群，多屬於α-、β-、與γ-substitution of Proteobacteria。
由 MCAA agar plate 所 分 離 出 菌 種 ， 屬 於
Xanthobacter sp
. 與Sphingomonas sp
，TCAA agar plate之菌種屬於Chrysobacterium sp
。 PCR-DGGE圖譜主要色帶與agar plate所培養出之獨立菌種，無一相同，說明可培養之菌種非是 biomass馴養後的主要菌群。作者認為以 PCR-DGGE結果較接近真實的菌群結構。此外，研究也顯示MCAA馴養出 之菌群同樣具有代謝MBAA的能力 (McRae et al. 2004)。
而目前許多研究顯示，含鹵乙酸在飲用水系統中，如慢濾池、
配水管網等，皆有降解之情況發生，這些系統內HAAs降解的原因，與 該系統內微生物活性有密切的關係。例如,Baribeau 設計一套模擬的 配水系統，於入流端行加氯或氯胺消毒，在不同餘氯及溫度條件下採 集出流水，並檢測HAA濃度變化。該研究發現，模擬配水系統中，溫 度較高的水體內(17-22℃)，二鹵乙酸(dihalogenated HAA)的含量會
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隨水體中餘氯濃度的變化而有改變，而餘氯量最直接關係到水體內微 生物之生物活性，餘氯量高時，生物活性低，鹵乙酸的變動就不明顯。
而三鹵乙酸(trihalogented HAA)於此實驗低餘氯環境下，降解之情 形仍不明顯，說明飲用水系統內之微生物，較不易代謝三鹵乙酸 (Baribeau et al. 2005)。
另 一 飲 用 水 系 統 中 降 解 含 鹵 乙 酸 的 例 子 也 發 生 在 以 活 性 碳 (biological active carbon)進行過濾處理的快濾池，該研究說明，
活性碳使用初期具有吸附鹵乙酸的功能，但會隨時間增加而逐漸飽和，
取而代之的可能降解因素是附著於活性碳逐漸增長之微生物(Kim 2009)。
Ping Zhang由美國境內九處淨水廠內的GAC filter、tap water 與配水管網，成功分離出8種 HAA degradable bacteria，所有分離 出 的 菌 種 分類 上屬 於 Proteobacteria ， 其 中 6種 分 離出 的 菌 株為
Afipia spp.
，且多來自於GAC filter與配水管線，僅兩種菌株來自 tap water，說明Afipia spp
可能是biofilm降解鹵乙酸的主要角色。該學者並針對
Afipia Felis
進行7種含鹵乙酸代謝能力的降解詴驗 (DCAA,TBAA ,MCAA,MBAA,MIAA, TCAA ,DBAA)，實驗結果也顯示，以 TCAA為獨立碳源是最難被HAA degradable bacteria所利用。MCAA、DCAA則根據不同的菌種，具有不同的喜好(Zhang et al. 2009)。
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2-5 本研究相關分子生物技術簡介 1. 核醣體與 16SrRNA gene
核糖體是細胞合成多胜肽鏈(polypeptide)所需之胞器，普遍存 在於自然界所有生命體的細胞中，最主要的功能是作為mRNA轉譯出蛋 白質的場所，就原核生物而言，核糖體本身包含兩個次單元
（subunits），大次單元（large subunit）與小次單元(small subunit)。大次單元包括了約30種蛋白質、5S rRNA（約120 base）、
23S rRNA（約2900 base），小次單元則含有約20種蛋白質以及16S rRNA
（約1540 base）(圖 2-6)，而真核生物的大次單元則包括約50種蛋 白質、5S、5.8S 及28S rRNA，小次單元包括33種蛋白質及18S rRNA。
由於核糖體中的rRNA 具有廣泛的普遍性（universal）、高度保守性
（highly conservation）、演化速率慢以及基因序列包含豐富的遺 傳訊息等特性，所以rRNA gene常被用來分析微生物菌群間的演化關 係（phylogenetic relationship）。但並非所有的rRNA gene皆適合 用來做為親緣關係分析之依據，例如，5S rRNA gene序列過短，不同 生物間的基因序列差異性太低，難以分析不同菌種基因之歧異度。而 23S rRNA gene序列又過長，增加了分析基因序列時的花費與時間，
而16S rRNA gene的長度大小適中，能夠區分物種基因序列間的差異，
因此，16SrRNA gene 的分析在學術上被廣泛利用，且現今之菌種資
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料庫多以16S為分類依據，亦較為完善。依據16S rRNA gene 分類，
可將生物體區分為三個主要domian：
Archaea
、Bacteria
以及Eukarya
(Woese 1987)。
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2. 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction)
聚合酶鏈鎖反應是美國Cetus 公司的Kary Mullis 於1983 年所 發明，具有能在短的時間內，準確地在詴管中(in vitro)將某一段特 定的核酸序列放大，PCR直至目前被廣泛應用在分子生物技術上，
Mullis於1993年因PCR對生命科學之貢獻而獲頒諾貝爾化學獎。
(Bartlett et al. 2003)
PCR 名稱來自於此技術之核心關鍵酵素；DNA 聚合酶。DNA 聚合 酶是細胞合成核酸序列所必頇之蛋白質酵素。PCR 的原理包括三個主 要步驟：1、雙股 DNA 的變性(denaturing)； 2、引子的黏合(Annealing) 及 3、DNA 的複製(Extension)，在第一步驟中欲使雙股 DNA 變性，
加熱破壞其氫鍵是最簡單的方式，因此在此三步驟核酸複製反應的過 程中，DNA 聚合酶必頇具備耐高溫的特性，而某一嗜熱菌(
Thermus aquaticus
；於 1976 年自溫泉中分離而得)的 DNA 聚合酶可在高溫下 進行 DNA 合成；稱做 Taq DNA Polymerase。它的特性就在於能耐高 溫，因此在 PCR 的過程中不會變性而破壞掉。能在高溫中進行 DNA 複製的酵素反應。PCR 三步驟不斷的重複，使原先可能非常微量，只 有幾個 picogram( 10-12 gram）的 DNA，增加至 microgram,(10-6 gram），甚至到 miligram,(10-3 gram）。但由於 Taq Polyerase 複製 DNA 時 有一定的錯誤率，因此 PCR 重複的循環數(cycles)不能過多(一般以
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30 個循環數為最佳)。PCR 的基本原理就是在詴管中以因受熱變性而 脫離的單股 DNA 作為模版(template)，使 DNA 聚合酶在具有專一性、
適當的引子（primer）做為前導下，將一個個核甘酸(Nucleotide) 依照模版加以複製而成為完整的雙股 DNA，完成之雙股 DNA 再分離，
持續進行下一個 cycle，如此一來，便達到在生物體外大量合成 DNA 片段的目的。
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Table 2-4 目前常用的分子生物技術(Schloter et al. 2000) Abbreviation Standing for
AFLP amplified（DNA）fragment length polymorphism
AP-PCR arbitrary primed polymerase chain reaction（for DNA）
ARDRA BOX-PCR amplified ribosomal DNA restriction analysispolymerase chain reaction of （DNA sequence between） BOXelements DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
FAME fatty acid methyl ester analysis
IGS intergenic spacer analysis
Inter-LINE-PCR polymerase chain reaction of （DNA sequences between）
long Interspersed elements
MLEE multilocus enzyme electrophoresis
PFGE pulsed field gel electrophoresis
PCR-RFLP restriction fragment length polymorphism of polymerase chain
reaction-generated amplicons
RAP-PCR polymerase chain reaction of random-amplified polymorphic DNA
REP-PCR polymerase chain reaction of （DNA sequences between）
repetitive extragenic palindromic elements RISA ribosomal intergenic spacer analysis
TGGE temperature gradient gel electrophoresis
ERIC-PCR polymerase chain reaction of （DNA sequence between）
enterobacterial repetitive intergenic consensus
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3. 變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis；
DGGE）
DGGE是一種利用變性劑來補強傳統電泳分析的分子生物技術，傳 統DNA電泳技術只能分離不同電荷比核酸片段，意即只能分離不同大 小的DNA，無法分離不同序列的DNA片段。而DGGE不但能分離大小不同 之DNA，更可以分離大小相同但序列不同的基因片段。理論上來說，
若DGGE條件操作得宜，甚可分離僅有一個核甘酸差異之較短的兩股 DNA片段。由於具有此種特性，DGGE早期是用來偵測基因上的點突變，
進行醫學研究為主。Muyzer將此種技術加以改良後，應用於分析環境 微生物的菌群結構上，有著相當不錯的成果，而且結合PCR
（polymerase chain reaction）後的PCR-DGGE，更能夠準確地偵測 不同環境下複雜的微生物菌相。(Muyzer et al. 1993)。DGGE 原理 主要是在acrylamide/bis 電泳的過程中，加入能使雙股DNA變性的化 學物質，如urea 和formamide，使得雙股DNA 發生變性而局部或完全 分離。雙股的DNA之間，鍵結力量是是以鹼基(base)間的氫鍵為主，
一般的DNA具有四種鹼基且兩兩配對，腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、
鳥糞嘌呤（G）與胞嘧啶（C）。(A)僅與(T)配對，(A)(T)之間會形成 兩個氫鍵，而(G)與(C)配對會形成三個氫鍵。因此在基因序列中，如 果(C)與(G)的總和數量越多，打開雙股所需要的力量越大，亦即所需
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要變性劑的濃度要越高，。這也就是DGGE所應用的基本原理，利用變 性劑的濃度梯度不同，使雙股DNA在通過電泳膠時，由於變性分開而 改變形狀，雙股DNA形狀改變後，DNA在電泳膠中的泳動速率就會改變，
意謂著DGGE電泳中，GC含量高的DNA片段，會出現在高變性劑濃度的 區域。藉由這項特性，只要DNA的序列不同，便會在電泳膠上分離，
DGGE電泳分為兩種，原理皆相同，一是水帄電泳，用來評估合適的變 性劑濃度範圍，二是垂直電泳，用於分離不同序列的基因片段。
DGGE 的應用相當的廣泛，可以用來作分析混合菌群的結構組成 和分佈變化，甚至可以用來篩選clone libraries 等，但DGGE 應用 最廣的功能還是為分析微生物樣品的組成和群落的分佈變化。Muyzer 的研究結果顯示，PCR-DGGE 的指紋圖譜（gene fingerprinting）對 於DNA 的序列變異性有相當高的靈敏性，在DGGE圖譜中的色帶(band)，
DGGE 的應用相當的廣泛，可以用來作分析混合菌群的結構組成 和分佈變化，甚至可以用來篩選clone libraries 等，但DGGE 應用 最廣的功能還是為分析微生物樣品的組成和群落的分佈變化。Muyzer 的研究結果顯示，PCR-DGGE 的指紋圖譜（gene fingerprinting）對 於DNA 的序列變異性有相當高的靈敏性，在DGGE圖譜中的色帶(band)，