步驟方法

本研究鹵乙酸分析實驗步驟是依據 US EPA Method 552.3，

再依實際情況之需要而調整。

首先將實廠採回之水樣與室溫帄衡，量取各淨水單元水樣 30 毫升，置入 40 毫升含鐵氟龍墊片之樣品瓶中。以微量注射針添 加 15μL 之擬似標準品（20 μg/mL of 2-bromobutanoic acid in MTBE），再以玻璃滴管添加 1.5ml 濃硫酸使 pH≦0.5，避免水樣 中鹵乙酸以非離子狀態存在造成分析的誤差。精確地加入 3 毫升 萃取液含內標準品（Internal standard,300μg/L of

1,2-dibromopropan in MTBE）。加入適量的粒狀硫酸鈉(約 11g) 後，以震盪機或手搖晃數分鐘達到飽和狀態後靜置，使有機層與 水層分離。硫酸鈉之目的在於使水層的離子強度增加，促使鹵乙 酸由水層進入至有機層，此步驟亦可降低 MTBE 的水溶性，以得 較佳之回收效率。使用玻璃滴管吸取 1 毫升上層有機層至 15 mL 圓柱詴管中，添加 1mL 10％硫酸甲醇後，放置於 50℃水浴槽 2 個小時進行甲酯衍生化。完成後將樣品移出水浴槽與室溫帄衡，

再依序添加 1 mL MTBE 與 3mL 硫酸鈉溶液（150 g/L），劇烈搖

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晃後靜置。取上層 1 毫升的有機層至乾淨的 15mL 圓柱詴管，隨 即加入 1mL 硫酸鈉溶液再劇烈搖晃後靜置，避免靜置過久使酯化 物水解。最後從詴管中取出 1mL 上層液至 1.5mL 樣品瓶中，儘快 分析樣品並保存－20℃冰箱中。

3-2 一氯、二氯、三氯乙酸濾砂降解詴驗 I. 藥品材料

（1） Sodium monochloroacetate (ALDRICH；USA)

（2） Sodium dichloroacetate (ALDRICH；USA)

（3） Sodium trichloroacetate (ALDRICH；USA)

（4） 0.22um membrane filter (MILLIPORE；USA)

（5） Phosphate buffer (pH 7) 1M KH²PO⁴ (Nacalai Tesque；Japan) 1M K²HPO⁴ (Nacalai Tesque；Japan)) II. 儀器設備

(1) 液相層析儀(LC)：分析降解過程中一氯、二氯、三氯乙酸濃度 變化。

美國安捷倫製（Agilent Technology），型號 1200 series，搭 配光二極體陣列式檢測器（Diode Array Detector ;DAD），層析管

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柱為 ZOBRAX Eclipse Plus C18(Agilent；USA)，長度為 150mm，管 徑 4.6mm，帄均孔隙大小 5um。

液相層析儀分析條件：注射體積 10uL。Column 流量 1.0ml/min，

溫度 30℃。Mobile Phase 為 97.5% Phosephate buffer 加上 2.5%

Methanol，Retention time 為 12mins。DAD 設定之分析波長為 UV-210nm。

(2) 真空 pump (GAST；USA) III. 步驟方法

將由實場採集之快濾砂保存於 4℃，暫緩微生物之活性，至實驗 使用前，才將濾砂與室溫帄衡。為了刺激濾砂上之微生物利用鹵乙酸 做為營養來源，進行批次實驗前，先將 50ug/L 含氯鹵乙酸，取 1mL 各別加入內含 20mL 快濾砂之容器內，置於 25℃恆溫箱培養 24 小時。

配置 1g/L 一氯、二氯、三氯鹵乙酸、1mM phosphate buffer、0.22um 濾膜過濾後之自來水。每種鹵乙酸分別架設四瓶批次反應瓶，方式如 下：

A. 刺激活化後之快濾砂 20mL + 1g/L 含氯鹵乙酸 10mL + 1mM phosphate buffer 10mL +過濾後自來水定量至 200mL。(鹵乙酸 濃度：50 mg/L、Phosphate buffer 濃度：0.1mM)

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B. 高溫高壓滅菌後之快濾砂 20mL + 1g/L 含氯鹵乙酸 10mL + 1mM phosphate buffer 10mL +過濾後自來水定量至 200mL。含氯鹵乙 酸最終濃度：50 mg/L、Phosphate buffer 最終濃度：0.1mM。

C. 1g/L 含氯鹵乙酸 10mL + 1mM phosphate buffer 10mL +過濾後 自來水定量至 200mL。含氯鹵乙酸最終濃度：50 mg/L、Phosphate buffer 最終濃度：0.1mM。

D. 1g/L 含氯鹵乙酸 10mL + 1mM phosphate buffer 10mL + 純水 定量至 200mL。含氯鹵乙酸最終濃度：50 mg/L。

將此 12 瓶反應瓶以鋁箔覆蓋，避免鹵乙酸在實驗過程中光解而減少，

置於 25℃恆溫箱震盪培養。適當時間間隔採集水樣，將樣品以 0.22um 濾膜過濾後，依上述 HPLC 操作條件進行鹵乙酸分析。

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3-3 全流程單元生物膜與水體微生物菌群分析 I. 藥品材料

微生物核酸萃取用藥品

（1） Phenol/chloroform/IAA (25：24：1) (AppliChem；Germany)

（2） Phenol/IAA (24：1) (AppliChem；Germany)

（3） Chloroform (AppliChem；Germany)

（4） Achlopeptidase (SIGMA；USA)

（5） Proteinase K (SIGMA；USA)

（6） Lysis buffer：

1. Tris-HCl (BioShop；Canada) 2. EDTA (BioShop；Canada) 3. Sucrose (J.T Baker；USA)

（7） PBS buffer (Biomen；Taiwan)

（8） Ethanol (Scharlau；Spain)

（9） SDS (J.T Baker；USA)

（10） Isopropanol (Scharlau；Spain)

（11） Ammonium acetate (J.T Baker；USA)

（12） Genomic DNA extraction kit (bioman, Taiwan)

（13） Wizard DNA clean up system (Promega, USA)

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變性梯度凝膠電泳藥品

(1) Acryamide/bis (37.5：1；40%) (BioShop；Canada) (2) Formamide (deionized) (BioShop；Canada)

(3) Urea (BioShop；Canada)

(4) Ammonium persulphate (APS) (AppliChem；Germany) (5) TEMED (BioShop；Canada)

(6) SYBR GreenI (Lonza；USA) II. 儀器設備

(1) 控溫水浴槽 (FIRSTTEK；Korea)

(2) 聚合酶鏈鎖反應器 (Biometra；Germany) (3) 變性梯度凝膠電泳設備 (Bio-Rad；USA) (4) UV-box (WEALTEC；USA)

III. 步驟方法

（1） 微生物 DNA 萃取及純化實驗

本研究濾砂與池壁生物膜的 DNA 萃取採用兩種方式，一是使用 phenol/chloroform 傳統法，二是使用市售商品化微生物 DNA 萃取詴 劑組(Easy Pure Genomic DNA mini Kit ；Bioman, Taiwan)進行微 生物總 DNA 萃取。傳統法之萃取步驟如附錄一，由於傳統法較耗時且 phenol、chloroform 等藥劑對人體有一定程度的毒害，於是在實驗

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後期，便採用萃取詴劑組，做為水體經過濾收集之濾膜的 DNA 萃取方 式；步驟如附錄二。

萃取後之 DNA 溶液中，可能含有聚合酶鏈鎖反應(PCR)抑制物(如 腐植酸)，所以在進行 PCR 之前，必頇將這些可能抑制酵素反應的雜 質去除。進一步的總 DNA 純化方式，本實驗採用 Wizard DNA Clean-Up kit，詳細的純化步驟，詳見附錄三。

（2） 引子(primer)的選用

引子的選擇乃是參考 Kazuya Watanabe 的實驗結果。該實驗選出 三種常用來針對 16SrDNA 保守區塊(conserved region)所設計的引 子(GC357f/534r、GC357f/907r、GC968f/1401r)，並比較此三種引子 對地下水、受油汙汙染之地下水 以及海水三種環境樣本經 PCR-DGGE 分析的結果。結果顯示，GC357f/534r、GC357f/907r 對水體的環境 微生物 DNA 有較高的親和力(Watanabe, Kodama et al. 2001)。為了 有效突顯菌群結構的豐富性，本實驗選用可放大出較長 16SrDNA 片段 的 GC357/907r 此組 primer，做為 PCR 實驗的引子。

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（3） 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)

微生物總 DNA 經萃取後，以聚合酶鏈鎖反應擴增生物膜及水體中 16SrDNA 基因片段。所使用的引子(primer)Table 3-1 所示，其中一 段 primer 5’端接上約 40 base pair 的 GC clamp 核酸序列，其目 的是為了避免雙股 DNA 在接下來的變性梯度凝膠電泳中完全變性而 分離成單股。聚合酶鏈鎖反應主要包括三個步驟：Denaturing、Primer annealing 以及 Elongation。PCR 所使用的詴劑及溫度條件如 Table 3-2、圖 3-1。

PCR 反應完成後，將產物以 2%瓊脂膠體進行水帄電泳，電壓 100 伏特 30 分鐘後，與 Ladder Marker 比對，確認 PCR 產物大小無誤。

（4） 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

實驗中使用變性梯度凝膠電泳來分析全流程池壁、水體微生物與 濾砂之菌相關係。取 25uL 聚合酶鏈所反應擴增後 DNA 產物，與 6X DNA loading dye 混合均勻後，注入大小約 10x16cm 含 6% Acryamide/bis 的變性凝膠中，固定電壓 60 伏特、溫度 60℃，於 7L TAE buffer 內 電泳 16 小時。

（5） 染色：銀染 (Silver staining)與 SYBR Green I

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電泳完成後，將膠體進行銀染(銀染步驟如附錄四)或 SYBR Green I 染色 40 分鐘。銀染後之膠體置於日光燈板下，以掃描器掃描後存 檔。SYBR Green I 染色後則於紫外燈箱下，以 CCD 照相存檔。DGGE 所使用之詴劑配方如 Table 3-3、Table 3-4、Table3-5。

硝酸銀(silver nitrate)在酸性的條件下會與 biopolyers 反應 (例如 protein、DNA、RNA 等)。於鹼性的條件下，銀離子會經由甲醛 的催化(formaldehyde)還原成銀，達到顯色的效果。銀染具有高解析 度，可以偵測出非常微量的 DNA，此優點可以增加 PCR-DGGE 亮帶多 樣性，但也同時有數種缺點；由於 protein 與 RNA 同時會被染色，易 造成膠片背景顏色過深或模糊，DGGE 電泳前適當的 PCR 產物前處裡，

可以增加膠片的解析度。銀染處理過程中，等同於對 biopolymer 造 成不可逆的化學反應，無法再對膠體進行 Blotting 或 hybridization analysis 等後續的實驗，另外，銀染也會降低序列分析時 DNA

re-amplication 的效果。

根據銀染對 DNA 的破壞特質，欲定序的 DGGE 圖譜，不適合使用 銀染的方法染色。SYBR Green I 具有比 ethidium bromide 更高的偵 測極限，染色結果較接近銀染，且不影響後續 DNA 定序的結果，因而

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本實驗選用 SYBR Green I 做為切膠定序前的染色方法，銀染法則用 來進行 PCR-DGGE 圖譜的群聚分析(cluster analysis)。

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Table 3-1 本研究所使用之引子

Primers Sequence(5’3’) specificity reference GC-clamp CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G --

(Muyzer, Dewaal et al. 1993)

GC357F GC-clamp+ CCT ACG GGA GGC AGC AG 16S rDNA 357F CCT ACG GGA GGC AGC AG 16S rDNA

907R CCG TCA ATT C(A/C)T TTG AGT TT 16S rDNA (Amann et al. 1992)

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Table 3-2 PCR 反應詴劑成分

component Volume (uL)

Final Concentration

10X PCR buffer 5 1X

10mM dNTP 2 0.1mM for each dNTP 10uM Primers(forward and

reverse)

2 0.2uM for each primer

DNA template 1 10~30ng Taq polymerase(2U/uL) 0.5 0.5 unit

Distilled water 39.5 --- Final valume 50 ---

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Denaturing Annealing Elongation

Room

1cycle 25cycles 1cycle

Denaturing Annealing Extension

Room

1cycle 30cycles 1cycle

圖 3-1 GC357-907 PCR 反應控制圖

圖 3-2 357F-907R PCR 反應控制圖

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Table 3-3 本實驗用之 Acryamide/bis 濃度所能分離之核酸長度 Gel percentage Base Pair Separation

6% 300-1000 bp

Table 3-4 6% Acryamide 變性梯度凝膠成分 35% Denaturing

solution

65% Denaturing solution 40% Acryamide/bis 15 mL 15 mL

50X TAE 2 mL 2 mL

Formamide (deionized) 14mL 26mL

Urea 14.7g 27.3g

dH²O To 100 mL To 100 mL

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Table 3-5 10% Ammonium Persulfate 成分 Reagent Amount Ammonium Persulfate 0.1 g

dH²O 1.0 mL

（6） 核酸序列結果分析

從 DGGE 圖譜結果切下所需亮帶，將膠體上之 DNA 溶解於 Tris buffer 中，以不含 GC-clamp 之引子；357F、907R 再一次進行聚合 酶鏈鎖反應擴增此片段 16SrDNA，此種方式又稱之為 Nested PCR，

即利用第一次 PCR 所得之產物做為第二次 PCR 反應所需的 template，

進行該片段第二次擴增。

PCR 操作條件如圖 3-2。由於 Nested PCR 產物容易因 Taq 複製 錯誤而改變原有序列，Secondary PCR 的 cycle 數，減低至 25 次，

降低第二次擴增之產物與原先 16SrDNA 序列的差異。PCR 反應完成 後，以同樣 DGGE 條件進行電泳，確認 PCR 產物僅有單一色帶。

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分析完各流程之菌群差異後，將 DGGE 指紋圖譜上有興趣的 partial 16SrDNA band 切下定序後，以得知確切的菌種名稱。DGGE 指紋圖譜亮帶之序列分析，乃委託明欣生物科技公司代為定序，而 定序所得之核酸序列，再經由 NCBI(National Center for

Biotechnology Information)網站提供核酸資料庫進行比對。利用 該網站 BLAST 功能，即可獲得比對之菌種及序列相似度之結果。

（7） 圖譜分析

DGGE 所得之圖譜，經由 BIO-Rad 公司出版之分析軟體；Quantity ONE，分析各流程間菌相之相似度。所採用之統計分析法為 UPGMA (Unweighted Pair-Group method using arithmetic average )演 算法進行聚類分析(Hayashi et al. 2007)。

為了研究生物膜、單元水體與濾砂菌相之關係，經微生物總 DNA 萃取後，以 PCR-DGGE 法分析混合菌群結構。由於 DGGE 圖譜結果複 雜度頗高，不易由肉眼分析，因此本研究採用統計學常用的聚類分 析(cluster analysis)方式來分析環境 DNA 指紋圖譜。藉由 BIO-RAD 公司出版的圖譜分析軟體 Quantity ONE，分析 DGGE 結果，選用的 方式為 UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)法，此演算法的假設下，各 DNA 上的鹼基差異與親源遠近

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關係大約成正比。藉由軟體計算，便可將 PCR-DGGE 所得之 DNA 指紋 圖譜進行計算，並分析 DGGE 指紋圖譜中各 lane 內所有 band 之間的 相對位置、總 band 數等差異因子而顯示出量化的分析圖。數值 1 代表相似度 100%，0 則表示 0%相似度。

DGGE 圖譜中，橫向欄位(Lane)各代表每一淨水處理單元內的菌 群結構，縱向亮帶(band)則代表某單一菌種，藉由分析 Lane 內每條 band 的強弱與消長變化，即可了解菌群在不同單元內的變異。