4-1 一氯、二氯、三氯乙酸於自來水廠處理單元之變化。
本實驗分別於春季、夏季、冬季採集目標淨水廠之各流程 出水，依處理流程順序分別為：原水、快混池出水、膠凝池出 水、沉澱池出水，快濾池出水、清水、及距實場約 2km 的配水 管線，配水樣品選擇離淨水場有一定距離之採樣點採樣，避免 民宅當作採樣點，以防止蓄水塔造成的影響。
當原水進入淨化流程時，會先在混合池通氯氣或次氯酸進 行前加氯(pre-chlorination)，氧化水中有機物質，進而控制 微生物在流程中過度滋長。水體中餘氯在適當的條件下會與環 境中天然有機物發生化學反應，產生含氯之有機物，統稱為消 毒副產物(disinfection by-product)，含氯鹵乙酸為其中一大 類，其中又以二氯乙酸(dichloroacetic acid)、三氯乙酸 (trichoroacetic acid)；簡稱 DCAA、TCAA，為含氯乙酸兩個最 主要的物種。一氯乙酸(monochloroacetic acid；MCAA)之檢測 結果因其濃度在三個季節採樣中皆低於最低偵測極限 1ug/L，因 此並未於此列出討論。
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圖 4-1 為春季 DCAA 與 TCAA，在實場各流程的檢測結果。原 水初始 DCAA、TCAA 含量分別與 1.8 ug/L、2.6 ug/L，經混合池 中與氯氣反應，DCAA 與 TCAA，有些微的升高，分別為 7.6 ug/L、
4.7 ug/L。膠凝與沉澱單元中 DCAA、TCAA 濃度皆無明顯變化，
經快濾池處理後，DCAA 下降至 5.1 ug/L，TCAA 提升至 7.6 ug/L，
圖 4-1 春季 DCAA 與 TCAA 在淨水廠全流程中濃度變化
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HAA濃度ug/L
Spring (平均溫度:22.2℃)
DCAA TCAA
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春季 DCAA 與 TACC 濃度變化起伏不大，應是受季節溫度之影 響。圖 4-2 顯示 DCAA 與 TCAA 在夏季於處理流程之變化，當原水經 前加氯進入混合池再進入到膠凝池，DCAA 與 TCAA 濃度有顯著的上 升，快混池 DCAA、TCAA 濃度：7.9 ug/L、 1.6 ug/L，膠凝池 DCAA、
TCAA 濃度：20.3 ug/L、18.1 ug/L。當水體經快濾池過濾後，水中 DCAA、TCAA 濃度便下降至 3.8 ug/L、7.5 ug/L，隨後在清水與配水 管線中，兩者濃度無太大的變化。
圖 4-2 夏季 DCAA 與 TCAA 在淨水廠中濃度變化
0 5 10 15 20 25
快混出水 膠凝出水 沉澱出水 快濾出水 清水 配水
HAA濃度ug/L
Summer(平均溫度:26.4℃)
DACC TCAA
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圖 4-3 為冬季採樣的全流程結果，可看出 DCAA、TCAA 改變幅度比春、
夏兩季小的許多。值得注意的是，冬季時 DCAA 在沉澱單元才達至最 高，6.1 ug/L。春、夏兩季 DCAA 最高濃度位於膠凝單元，可能原因 推測是冬季因均溫較低，原水在混合池加氯後需要較長的反應時間 生成 DCAA 與 TCAA。
圖 4-3冬季 DCAA 與 TCAA 在淨水廠中濃度變化
由三季 DCAA 與 TCAA 濃度於各淨水單元的比較，其共同的特點 在於，DCAA 在三季中經由快濾池處理過後，濃度有顯著的下降。而 快濾池內主要的淨化腳色，便是池中之濾砂，因此合理懷疑，快濾 砂上之微生物具有降解 DCAA 之功能。TCAA 在春冬兩季並無濾砂降
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HAA濃度ug/L
Winter(平均溫度21.5℃)
DCAA TCAA
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解的現象，但在夏季與 DCAA 濃度曲線類似，經快濾砂過濾後有高幅 度的下降。MCAA 濃度在三季各個檢測點皆低於最低偵測極限，推測 可能原因有二，一是生成量少，二是相較於 DCAA，MCAA 分解快速，
微生物較喜好將 MCAA 做為優先的營養來源。
觀察三季中清水與配水內的含氯鹵乙酸，配水內的 DCAA 與 TCAA 濃度會些微大於清水內的濃度。一般認為，含氯鹵乙酸經配水管網 附著之微生物作用應有下降的趨勢。查詢文獻發現，配水內鹵乙酸 的濃度變化會與自由餘氯含量有關，自由餘氯高不但會再生成鹵乙 酸而且也抑制微生物降解鹵乙酸的機制，自由餘氯低的情況下微生 物則會在輸水管線中大量降解鹵乙酸 (Speight et al. 2005)。檢測該 廠清水與配水內自由餘氯約界於 0.5~0.7 mg/L，與文獻比較是屬於 較高的餘氯量，因而得到配水內鹵乙酸濃度會微幅大於清水濃度。
4-2 快氯砂降解一氯、二氯、三氯乙酸批次詴驗。
由三季 MCAA、DCAA、TCAA 濃度全流程分布推斷，快濾砂可能具 有降低此三種鹵乙酸之特性，其中又以生物性降解為最主要之因素。
為證實此論點，此實驗針對潭頂水場快濾池去除一氯、二氯、三氯 乙酸的情形做進一步的探討。由於濾砂使用前保存於 4℃冰箱，首 先將實場採回之快濾砂分別加入微量的一氯、二氯、三氯乙酸及無
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菌水，使附著於快濾砂之微生物活化，刺激微生物利用此三種鹵乙 酸做為生長營養來源。而後取 10mL 活化過之快濾砂分別倒入含有濃 度約 45 mg/L MCAA、DCAA、TCAA 三種鹵乙酸的血清瓶中，以滅菌後 的自來水及做為培養的基質，並加入適量磷酸鹽緩衝 pH，並給予震 盪保持好氧狀態，置於 25℃恆溫箱中進行降解詴驗，一定間隔時間 採樣，經無菌過濾保存後，利用 HPLC 量測樣品中 MCAA、DCAA、
TCAA 濃度並觀察結果及變化。
圖 4-4 ~圖 4-6 依序為 MCAA、DCAA、TCAA 於 300 小時內經 HPLC 量測之結果。曲線 M、D、T 分別代表 MCAA、DCAA、TCAA 供給實場快 濾砂後的濃度變化。b1、b2、b3 依序為滅菌濾砂對照組、無砂空白、
HAA 空白，大寫 M、D、T 代表鹵乙酸的種類，M：MCAA，D：DCAA，T：
TCAA。
從 MCAA 與 DCAA 降解曲線可觀察出，隨著時間增加，鹵乙酸確 實有減少，濃度 45 mg/L 的一氯、二氯乙酸在 288 小時內，降低至 1 mg/L 以下。為了分別出生物性降解與濾砂吸附鹵乙酸，本實驗曲 線 Mb1 與 Db1 代表的是滅菌後濾砂的空白詴驗，與操作組對照後可 以明顯看出，一氯、二氯乙酸的減少，與濾砂吸附鹵乙酸無直接的 關係。45 mg/L 三氯乙酸經過 288 小時無顯著的減少，與當初之假
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設有出入，此次實驗結果也顯示，同量的濾砂，降解 MCAA 與 DCAA 時間快慢上無顯著差別。
將 MCAA 與 DCAA 降解圖的每個時間點前後濃度差除以時間距離，
便可得到圖 4-7 ,圖 4-8 降解實驗中，MCAA 與 DCAA 的帄均降解速 率曲線圖。由此二圖可發現有趣的現象，相對於整體降解速率，降 解初期(0~7 hour)的 HAA 減少最快，MCAA 與 DCAA 降解速率也迅速 下降，MCAA 從 1.4 mgL-1/h 降至 0.3 mgL-1/h ，DCAA 從 0.9 mgL-1/h 降至 0.4 mgL-1/h，在 7~12 小時，兩者幾乎無降解發生，速率趨於 零。而後速率漸漸提升，達 0.25 mgL-1/h 後，HAA 含量已趨近於零。
比對對照組 1 (Mb1、Db1;無菌濾砂吸附效應控制組)，無 HAA 被吸附之情況發生。MCAA、DCAA 快速下降之原因，應非濾砂本身具 有的吸附效果造成。針對初期高降解速率的結果，可能的原因有二，
一是實驗分析的誤差，二是降解初期生物膜吸附的結果。文獻指出，
生物膜的組成具有多醣體(polysaccharide)，稱為
exopolysaccharide (EPS)，EPS 被證實在適當的條件下具有吸附有 機物或無機物的性質(Wang et al. 2002)。但生物膜上 EPS 雖然具 有吸附特質，但是否能吸附 HAA，還需進一步証實。
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針對 TCAA 無降解的可能原因，實驗用濾砂之採樣時間為 11 月，
雖當周該地之天氣均溫達 28 度，但生物膜上之菌群可能已與夏季 (八月)時不同，可能是 TCAA 無法降解之原因。
而參照過去文獻，部分已被證實可降解 HAAs 之微生物，其代謝 鹵乙酸所需之酵素；(Dehalogenace)，需要有其他的基質才能代謝 TCAA，意即 TCAA 的降解過程，是為一共代謝之生化反應。而在此降 解實驗中，僅提供 TCAA 做為生長之營養源，此實驗在缺乏提供其他 有機碳做為共代謝所需基質的條件下，可能是造成 TCAA 無法被濾砂 上微生物降解之主因。A.L. Weightman 實驗發現，欲使
Pseudomonas putida 與 Pseudomonas sp.
降解 TCAA，額外添加2,2-dichloropropionic acid (2,2DCPA)會使培養液中
Dehalogenace 活性大幅增加，代謝 TCAA。此外，Pyruvate 與 DCAA 也可做為 TCAA 進行共代謝所需之基質 (Weightman et al. 1992)。
此批次實驗僅提供含氯鹵乙酸做為獨立碳原，因此在缺乏共代 謝基質的環境下，TCAA 可能無法被微生物所利用，此點也可能是造 成 TCAA 無法被快濾砂降解的主要因素。
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圖 4-6、TCAA 於 288 小時內降解批次實驗結果。T：
TCAA+實場氯砂，Tb1：滅菌砂+TCAA，Tb2：無砂空白、
Tb3：MCAA 空白。
0 10 20 30 40 50
0 50 100 150 200 250 300
TCAAmg/L
Hours
T Tb1 Tb2 Tb3
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4-3 水廠處理單元之生物膜及水體之菌相與菌種分析。
本研究嘗詴跳過傳統生物培養的方式，直接以 DNA 分子層面的 角度來探討水處理流程中微生物菌相之改變。為達到此目的，此部 分研究結合了，實場環境樣本 DNA 萃取，16SrDNA 之 PCR 擴增，變 性梯度膠凝電泳(DGGE)等分子生物技術，藉由結合分析淨水廠內鹵 乙酸與環境樣本菌相之變化，探討淨水處理單元內微生物與鹵乙酸 降解之關係。
由各單元 MCAA、DCAA 濃度檢測結果，明顯看出夏季鹵乙酸降解 的比春冬季明顯，因此實驗中的環境 DNA 樣本皆採於夏季。DNA 菌 相分析的對象針對兩大種類，一是各單元池壁的表層生物膜(表層微 生物以好氧為主)，二是各單元水體內微生物，將上述二類微生物與 附著於濾砂之微生物做菌相比較，建立鹵乙酸濃度高低與菌相變化 之關係。
研究之第一步是利用傳統 DNA 萃取法或市售 kit 萃取環境樣本 總 DNA，由於萃取出的環境 DNA 濃度低，加上必頇確定萃取出的 DNA 可用於後續之工作，便利用聚合酶鍊鎖反應由特定引子放大片段的 16SrDNA。
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研究之第二步是經由本實驗使用之引子(GC357f、907r)放大環 境中 16SrDNA。由於 PCR 反應是極為靈敏的酵素反應，倘若在 PCR 反應過程中存在抑制物質，便會導致產物不足或反應失敗。環境樣 本中常存在之腐質酸或多環芳香類化合物，有可能抑制 PCR 反應，
因此在 DNA 萃取後，PCR 反應前，需將環境總 DNA 進行純化。PCR 反應之條件會影響產物之專一性，嚴苛度過低之 PCR 條件，會發生 非專一性複製的情形，因此頇先測詴出最適當之 PCR 引子黏合溫度 (Annealing Temperature)。結果如圖 4-7，Lane 1 是 100bp 之 ladder marker，Lane 2 至 Lane 11 為完全相同之條件下，調整 annealing temperature 所得之結果，溫度依序為 46℃、47℃、….54
℃、55℃。可看出 band 顏色隨溫度增加而遞減，為得到較佳之重複 性，本研究以 54℃做為 PCR 反應的黏合溫度。
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圖 4-9 不同引子接和溫度下進行 GC357-907 之 PCR 反應結果 後，於 2% agarose 電泳分析之結果。Lane 2 至 Lane 11 所代 表之溫度依序為 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55
℃。Lane 1 是 100bp ladder marker，Lane 12 是 negative control。
4-3-1 池壁生物膜與濾砂 PCR-DGGE 菌相之探討。
圖 4-10 為單元池池壁生物膜與濾砂經 DNA 萃取後，進行
PCR-DGGE 之電泳結果圖，下方圖 4-11 為圖譜經 Quantity ONE 軟體
PCR-DGGE 之電泳結果圖，下方圖 4-11 為圖譜經 Quantity ONE 軟體