• 沒有找到結果。

所產生的抗藥性也在持續的增加當中 (McGahee & Lowy, 2000)。因此,對抗藥性沒有預 防的能力,而無法有效治療因細菌所引發的感染時,就必需早一步發現新的抗生素。換 言之,新型態抗生素的研究是非常迫切需要的!

在許多被提及的策略之中,研究自然界或人為產生作用在微生物細胞膜的抗菌胜肽 (antimicrobial peptides;AMPs) 是最有希望的。目前為止,有八百種以上這類型的胜肽 抗生素 (peptide antibiotics) 被純化分析出來,且其中一部份已進入臨床試驗 (Dubin et al., 2005)。如 Mak (2000) 等學者自血紅素 (hemoglobin) 及肌紅蛋白 (myoglobin) 中所 得到的抗菌胜肽-hemocidins,已分析到其擁有強大的抗菌活性,且 hemocidin 已成功地 比目魚 (winter flounder) 中所發現的抗菌胜肽-pleurocidin (Cole et al., 1997)】、植物

【如:Fernandez (1972) 等學者在 wheat seeds 中所發現的抗菌胜肽-purothionins】甚 至在人類【如:Frohm (1997) 等學者在人類的嗜中性白血球 (neutrophils)、單核球細胞 (monocyte) 及 T 淋巴球細胞 (T lymphocyte) 中所發現的抗菌胜肽-LL-37】身上都可 以發現到抗菌胜肽的存在。生物體每天都暴露在會遭受到細菌及病原體感染的環境中,

為了保護自己而去抵抗這嚴苛的環境,便發展了”先天性”及”後天性”的免疫防禦機制 (Bulet et al., 2004)。在無脊椎動物中目前只發現到先天性的免疫防禦機制,但在脊椎動 物的免疫反應則需依賴先天性及後天性的免疫防禦機制共同運作 (Hoffmann et al., 1999)。所謂先天性免疫防禦機制主要指的是生物體中會產生一種主要由胜肽及多胜肽 鏈所組成的抗菌物質,它們最少由15到20個胺基酸所組成,並由不同類型的細胞及分泌

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物製造出來。生物體相當依賴抗菌胜肽,它們主要存在分泌器官的細胞內或被感染時才 會被誘發產生 (Hancock & Diamond, 2000)。而合成抗菌胜肽的誘發過程已經在昆蟲,特 別是果蠅 (Drosophila melanogaster) 裡成功的研究出來 (Meister et al., 2000),在脊椎動 物或植物的組織中也曾經被發現。目前所發現的抗菌胜肽大多是帶有陽離子 (cation) 的,也就是說在生理的環境下它們是呈現正電性的,這是由於在胜肽中存在的帶正電胺 基酸 arginine 及 lysine 比帶負電的胺基酸 aspartic acid 和 glutamic acid 含量要高,且 如果C端修飾為醯胺基 (amide) 則更會加強胜肽之陽離子特性。除了這常見的陽離子特 性之外,抗菌胜肽通常會形成雙性 (amphipathic) 的結構,以一側為親水性區域,另一 側為疏水性區域的方式存在。因此這兼具陽離子及形成雙性的特性,會使得胜肽更容易 和帶有陰離子的細胞膜或微生物的磷脂膜產生交互作用甚至嵌入到膜中 (Oren & Shai, 1998)。已經有許多的機制可以用來說明胜肽作用的模式,如:桶狀式穿鑿 (barrel stave)、

地毯式吸附 (carpet) 或是超環面機制 (toroidal-pore) 等 (Castle et al., 1999;Kragol et al., 2001;Otvos et al., 2000)。

雖然無脊椎或脊椎動物所發現的抗菌胜肽其一級結構差異性非常大,但存在在類似 膜的環境中,大多會形成α-螺旋 (α-helix) 或是帶有一個或一個以上的分子內雙硫鍵的β-褶板 (β-sheet) 等二級結構 (Dimarcq et al., 1998;Tossi et al., 2000)。而除了這兩個類型 外,抗菌胜肽還可以利用本身存在一種或多種以上的特殊胺基酸 如:arginine、

tryptophan、histidine 或 glycine 等來加以分類,例如由蜘蛛 (Acanthoscurria gomesiana) 身上所發現到的抗菌胜肽-acanthoscurins,擁有92個胺基酸,但其中73%皆是由 glycine 所組成 (Bulet et al., 1999),其中最常見的為帶有 proline 的抗菌胜肽 (如:Gennaro (1989) 等人由牛身上所發現的抗菌胜肽-bactenecin 7)。

抗菌胜肽的研究大約是由80年代開始興起。Hultmark (1980) 由天蠶 (Hyalophora cecropia) 中分離純化得到具有抗菌性的多胜肽鏈-cecropin 後,學者便相繼由細菌、昆 蟲、植物、哺乳動物甚至人類體內發現到抗菌胜肽的存在。目前所發現的抗菌胜肽已有

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1 - 2.1 雙性和疏水性螺旋胜肽 (amphipathic and hydrophobic α-helices)

在許多的生物體中如:脊椎及無脊椎動物、植物甚至於微生物等都會發現線性螺旋 抗菌胜肽的存在 (如表 1-1),目前約有上百種抗菌胜肽都屬於此類型。這類抗菌胜肽的 胺基酸序列相當短 (大多小於40個胺基酸),缺乏 cysteine ,卻富含 lysine 及 arginine (使胜肽帶有大量的正電荷),且C端大都帶有醯胺基 (amide) (Bulet et al., 2004)。在水溶 液 中 , 胜 肽 多 呈 現 混 亂 (random) 的 二 級 結 構 , 但 如 果 存 在 於 三 氟 乙 醇 (trifluoroethanol)、磷脂微粒、脂質體或脂質雙層膜中,胜肽便會改變而形成螺旋的二級 結構 (Gennaro & Zanetti, 2000)。另有學者發現,產生螺旋的程度與抑制革蘭氏陰性及 陽性菌的活性有密切的關係;而增加螺旋的程度也會相對增加抗菌的活性。以脊椎動物為 例,科學家已在兩棲動物的皮膚分泌物、胃黏膜及腸的上皮組織中發現到相當強且作用 範圍廣泛的抗菌胜肽存在,且他們的活性並不僅限於病原體,如:對革蘭氏陰性菌及陽 性菌、真菌和原生動物 (protozoan) 的抑制,而有些螺旋抗菌胜肽也具有高度的溶血活 性 (hemolytic activity)。由於螺旋型抗菌胜肽長度較小,較有利於利用化學方法合成,

有鑑於此,許多的學者便利用圓二色偏極光譜儀 (circular dichroism;CD) 及核磁共振 (nuclear magnetic resonance;NMR) 來做結構特性的描述,並藉此判斷其結構及功能間 的相互關係 (structure-activity relationships;SAR)。有許多研究指出螺旋胜肽的效力和 活性由以下幾個要點共同決定,包括(1)有能力形成雙性結構、(2)帶正電荷、(3)整體而 言是呈現疏水性、 (4)大小、序列以及 (5)極性角度等,都和胜肽的抗菌活性有密切的 關係。而這些結構需求 (structural requirements) 彼此間是有關聯的,當改變其中某種結 構需求,即可能連帶改變其他的結構需求,造成胜肽在生物活性上的改變 (Bulet et al., 帶有輕微負電且會形成疏水性結構的細胞毒素胜肽 (cytotoxic peptide)-alamethicin 為 例,此胜肽在穿越雙層膜時會先聚集,然後圍繞形成可運輸離子的孔洞。而 alamethicin 會被微生物利用非核醣體生合成 (ribosome synthesis) 的機制所合成。但由於其對微生 物的膜具較低的選擇性,在藥理上的效用有諸多限制。不過在自然界中大多數的雙性螺 旋細胞毒素胜肽都是帶有正電荷,且也顯示出對微生物有高度的選擇性及毒性 (Sansom, 1991)。

而在雙性陽離子螺旋抗菌胜肽中,最被學者所廣為研究的是 magainin。它是由23 個胺基酸所組成,在非洲爪蟾蜍 (Xenopus laevis) 的皮膚分泌物中所發現 (Zasloff,

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1987)。此胜肽的特性在最近才被學者再仔細討論,認為此胜肽會形成促使細胞溶解的 孔洞 (lytic pore) (Matsuzaki, 1998;Matsuzaki, 1999);而此孔洞和一些螺旋型胜肽 (如:

alamethicin) 利用聚集形成孔洞的形式不同。就 magainin 來說,其形成的孔洞較大且在 開啟或關閉時不會分離,然而形成這類型的孔洞並不會造成膜完全的瓦解,例如:

magainin 不會容許 24kDa 的胰蛋白酶 (trypsin) 進入到膜中 (Matsuzaki et al., 1995)。

另外和 alamethicin 形成的孔洞相異的地方是 alamethicin 之孔洞只利用胜肽去排列形 成 (此即 barrel-stave 機制),而 magainin 所形成的孔洞外牆則包含了胜肽及脂質兩 種,這是由於胜肽會促使帶負電荷的雙層膜彎曲,使其更容易在所形成的孔洞外牆產生 胜肽及脂質的界線 (此即 toroidal pore 機制) (Matsuzaki et al., 1998;Wieprecht et al., 1997b)。

表1-1 由脊椎及無脊椎動物中所發現之螺旋型抗菌胜肽的結構特徵及抗菌活性。(Bulet et al., 2004)

活性表示:B:抗細菌;C:細胞毒素;F:抗真菌;H:溶血活性;I:殺蟲劑;L:胜 肽會和脂多醣結合;T:trypanolytic activity;Y:造成酵母細胞溶解。

*代表胜肽C端帶有醯胺基 (amide)

1、2、3及4分別代表6-bromotryptophan、dihydroxyresidues、3,4-dihydroxyphenylalanine 及 5-hydroxylysine,

在三維結構部份,是利用由刺蠅 (Stomoxys calcitrans) 及非洲爪蟾蜍 (Xenopus laevi) 身 上所發現到的抗菌胜肽 stomoxyn 及 magainin 來呈現其三級結構。

螺旋輪 (helical wheel) 是利用由蛾 (Hyalophora cecropia) 身上所發現的抗菌胜肽 -cecropins,來呈現其含有的雙性結構特性。

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1 - 2.2 β-褶板胜肽及較小的蛋白質 (β-Sheet peptides and small proteins)

目前發現屬於此類的抗菌胜肽約有三百多種。此類的抗菌胜肽中包含數個成對的半 胱胺酸 (cysteine) 所氧化形成分子內雙硫鍵 (disulfide bridges),這些帶有雙硫鍵的胜肽 通常在水溶液中會形成β-褶板狀結構 (Brogden, 2005) (如表 1-2)。近年來,有學者在恆 河 猴 (rhesus monkey) 身 上 發 現 環 狀 且 帶 有 半 胱 胺 酸 的 抗 菌 胜 肽 (cyclic cysteine-containing antimicrobial peptide) 稱為, minidefensin 或 θ-defensin (Tang et al.,1999); minidefensin 利用本身的半胱胺酸 (序列中第2及第8個位置) 配對產生的雙 硫鍵去形成β-褶板狀結構。其他如 β-hairpin-like 結構 (例如:由節肢動物上所發現的 thanatin、androctonin、gomesin 及 tachyplesin等,而在兩棲動物上則發現到 brevinins 及 esculentins) 及常在無脊椎動物及植物 defensins 中所發現到的 mixed α-helix/β-sheet 結構等 (Garcia-Olmedo et al., 1998),都可利用本身的半胱胺酸來形成雙硫鍵;而雙硫鍵 會使得胜肽呈現環狀 (ring) 結構如:tachyplesins、protegrin 及 lactoferricin 等,或使得 整個胜肽骨架環化 (cyclization) 如:gramicidin S、polymyxin B 或 tyrocidines等。以 tachyplesin 為例,此抗菌胜肽利用兩個雙硫鍵連結形成環狀反平行β-褶板結構,不管是 對細菌或是人工膜都會使其產生滲透性 (permeability),這是由於此胜肽會結合而形成短 暫的孔洞並藉此改變位置 (translocate) 穿越脂質雙層膜 (Matsuzaki et al., 1997),有學者 認為此胜肽對細胞質外膜作用的方法和螺旋胜肽-magainin 相當類似。由此可知對β-褶 板式胜肽而言,會影響抗菌活性最重要的結構變數是維持雙性,也就是親水性和疏水性 間的平衡 (Rao, 1999)。

自然界中的雙性β-褶板胜肽類似物之雙性程度可利用逆相 HPLC 的滯留時間 (retention time) 來判斷,發現到如果胜肽擁有較高的雙性程度,其溶血活性 (hemolytic activity) 會相對的增加,但卻會降低其抗菌的活性;相對的如果胜肽的雙性程度較低時 顯示出有較高的抗菌選擇性 (Epand & Vogel, 1999)。

Defensins 是一群約為50個胺基酸擁有強大抗菌活性的小蛋白抗菌胜肽,它們產生 及儲存於嗜中性白血球中 (granules of neutrophils),可在動物、昆蟲及植物的組織中發 現,近年來被廣泛的通稱為 thionines。其擁有高量的雙硫鍵可幫助胜肽維持結構的完整 性並形成β-褶板性的結構,但在植物及昆蟲的 defensins 裡通常還包含一部分的螺旋結 構區域。而所有的 defensins 都擁有雙性的結構特性,可使抗菌胜肽能藉此對細菌的細 胞膜作用 (Cornet et al., 1995)。

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表1-2 由脊椎動物與無脊椎動物中所發現之β-褶板抗菌胜肽的結構特徵與抗菌活性,表 示抗菌胜肽擁有一至兩個雙硫鍵而形成 β-hairpin 的二級結構。(Bulet et al., 2004) 在圖中以黑線表示雙硫鍵的配對

灰色部分代表 thanatin 及 brevinin-1 裡的 insect box 及 Rana box

活性表示:B:抗細菌;C:細胞毒素;F:抗真菌;H:溶血活性;I:殺蟲劑;L:胜 肽會和脂多醣結合;T:trypanolytic activity;Y:造成酵母細胞溶解。

*代表胜肽C端帶有醯胺鍵 (amide)

三 維 結 構 是 以 在 昆 蟲 (Podisus maculiventris) 及 猪 的 白 血 球 中 所 發 現 的 抗 菌 胜 肽 thanatin 及 protegrin-1 來表示其三級結構

1 - 2.3 擁有特殊胺基酸組成的抗菌胜肽

這類擁有特殊胺基酸組成的抗菌胜肽,在自然界中已發現約 40 多種,其結構特性 為:在其胺基酸序列中富含一種或多種的特殊胺基酸 (Otvos, 2002)。不過此類的胺基酸 大多缺少 cysteine 以形成 β-褶板結構,多是呈現線性的結構。例如在唾液中所發現的

這類擁有特殊胺基酸組成的抗菌胜肽,在自然界中已發現約 40 多種,其結構特性 為:在其胺基酸序列中富含一種或多種的特殊胺基酸 (Otvos, 2002)。不過此類的胺基酸 大多缺少 cysteine 以形成 β-褶板結構,多是呈現線性的結構。例如在唾液中所發現的

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