3-1 人工合成抗菌胜肽設計
比較及分析 150 種以上由脊椎及無脊椎動物中所發現長度為 16 到 44 個胺基酸的抗 菌胜肽序列 (見圖 3-1A)，儘管其在結構上有相當大的差異，但這所有的胜肽在 N 端都 存在著螺旋的區域，為了抗菌活性這是必要的。由於胜肽長度非常的廣泛，所以此次的 分析主要以每條胜肽的前20 個胺基酸為依據，也包含和活性有關的 N 端區域，以期能 產生一個能設計合理短鏈螺旋抗菌胜肽的依據。在一條直線形胜肽的序列中，每個位置 上任意分配胺基酸，每個胺基酸能出現的機率為5％，是很值得來探討的，或許可藉此 得知演化的選擇性，也可能與胜肽的功能有密切的關係。
事實上，在直線形抗菌胜肽上每個位置上的胺基酸經研究後，發現除了第一個位置 (＞70％是為 Gly) 及第八個位置 (＞50％為 Lys) 外，其他結果並不如預期。然而在考慮 位置上胺基酸的類型時就有了重大的突破，也因此產生了序列模板 (見圖 3-1A)，這解 釋了一個典型螺旋抗菌胜肽的序列型態，也產生了”陽離子”、”高度疏水性”及”雙性”等 特色。自然界中抗菌胜肽結構變數的分析如圖 3-1 C-E，這指出了大多數自然界的抗菌 胜肽都帶有+4 到+9 的正電荷、40％到 60％的疏水性胺基酸 (這代表在螺旋輪中疏水性 的角度約為140°至 200°) 及最適的雙性程度為 50％到 60％ (見圖 3-1C、D 及 E)。
目前約有五十多種不同人工合成螺旋抗菌胜肽已被設計出來，主要多是利用蛋白源 (proteinogenic) 或非蛋白源 (non-proteinogenic) 胺基酸，有系統或獨立的改變胜肽的螺 旋構型特性、所擁有的陽離子、兩性特性、疏水性及極性角度等而得 (Tossi et al., 2000)。
由前人的研究可發現，使得抗菌胜肽的某一項結構變數改變，便會影響到其他的結 構變數；因此在本次實驗中，主要只針對改變單一結構變數，而保持其他的結構變數，
以便我們可以清楚的了解此結構變數對抗菌胜肽其結構或活性之間的影響。另外選用兩 條天然雙性螺旋抗菌胜肽作為對照組，其一為由非洲爪蟾蜍的分泌物中所發現的抗菌胜 肽-magainin 衍生物 (GIGKFLHSAKKWGKAFVGEIMNS)，另一種則為由比目魚分泌物 所發現的抗菌胜肽-pleurocidin (GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL)，這兩種胜肽均 已證實了對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌甚且真菌、病毒等皆具有廣泛且強效之抑制能 力 (Hara et al., 2001a；Zelezetsky ＆ Tossi., 2006)。
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A
B
圖 3-1 將自然界中所發現的螺旋抗菌胜肽，由其 N 端取 20 個胺基酸所做的胺基酸分佈 統計分析及序列模型。(Zelezetsky ＆ Tossi., 2006)
此分析依據目前 AMSDb (www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/antimic.html) 所收錄的150 種不同的螺旋抗菌胜肽，自其N端開始20個胺基酸來做統計分析。A圖代表在螺旋環裡 每個位置上不同類型的胺基酸所出現的頻率；B圖代表在胺基酸序列裡每個位置裡最常 出現的胺基酸類型。(h=疏水性胺基酸、p=極性不帶電胺基酸、x=還未確定、±=電荷) (Tossi et al., 2000)；自然界中螺旋抗菌胜肽所帶的正電、疏水性胺基酸組成及兩性等結構特性 分別以圖C、D及E表示。
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Zasloff (1988) 等學者於 magainin 的研究中發現到，當抗菌胜肽欲穿越膜時，其 胜肽序列必須大於20 個胺基酸 (當 magainin 之胺基酸序列小於 20 個時，其抗菌活性 會大幅度的降低。)，因此基於胺基酸合成的穩定性及成本上的考量，本實驗中的人工 合成抗菌胜肽均以 20 個胺基酸作為其胜肽長度，再配合圖 3-1 所示自然界抗菌胜肽的 結構特性分布情形，針對其四種不同的結構特性 (正電荷、極性角度、疏水性及疏水性 矩) 來做改變，便可得到表 3-1 所列之 16 條不同結構特性之人工合成抗菌胜肽。可大 致區分為五組，一為正電荷組 (Q)，是由 GW-Q3、GW-Q4、GW-Q5 及 GW-Q6 等四 條胜肽所組成，主要是改變胜肽正電荷的多寡 (＋3~＋6)；其二為極性角度組 (θ)，由 GW-A1、GW-A2、GW-Q4、GW-A4 及 GW-A5 等五條胜肽所組成，依據 Uematsu 及 Matsuzaki (2000) 所設計之胜肽極性角度計算法則來改變人工抗菌胜肽極性角度的程度 (100°~180°)；其三為疏水性組 (H)，由 GW-H0、GW-H1、GW-Q4 及 GW-H3 等四條胜 肽所組成，主要是改變胜肽疏水性的程度 (-0.181~0.107)；其四是疏水性矩組 (MH)，由 GW-M1、GW-Q4、GW-M3 及 GW-M4 等四條胜肽所組成，主要是改變胜肽疏水性矩 的程度 (0.291~0.451)；最後則是對照組，由自然界抗菌胜肽 magainin 及 pleurocidin 所 組成。由圖3-1 可得知，自然界的抗菌胜肽中第一個胺基酸為 glycine 的機率有 70％以 上，因此本實驗中人工合成抗菌胜肽之第一個胺基酸，便都設計為glycine；同時也將人 工合成的抗菌胜肽最後一個胺基酸皆設計為 tryptophan，以便日後進行螢光實驗之需。
最後交由科羅耐國際科技公司合成出本實驗所需之16 條抗菌胜肽。
3-2 高效能液相層析試驗 (High Performance Liquid Chromatography；HPLC)
目的
本實驗主要利用 HPLC 來分析經科羅耐國際科技公司所合成抗菌胜肽之純度。
儀器
本論文中使用 HPLC 儀器為 Waters 公司所出產的分析系統，該系統包含有 Waters 600 Pump、600 Controller 及 2996 Photodiode Array Detector。
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1. 層析用水 (H2O；MERCK ＃HC695380)
2. 三氟乙酸 (trifluoroacetic acid，TFA；Riedel-de Haen ＃61030) 3. 乙腈(acetonitrile，CH3CN；Merck ＃1295830-619)
4. HPLC 管柱 (phenomenex ＃OOF-4337-EO) 方法
1. 溶液的配製
1.1 Buffer A (0.1％ 三氟乙酸水溶液)
將 2 mL 的三氟乙酸加入層析用水中，便得到 0.1% 三氟乙酸水溶液 1.2 Buffer B (含 0.08％ 三氟乙酸的 80% 乙腈水溶液)
將 1.6 mL 的三氟乙酸加入至 1.6 L 的乙腈溶液中，再用層析用水定量至 2 L，即可 得到含0.08％ 三氟乙酸的 80% 乙腈水溶液。
2. 實驗步驟
一開始先利用 buffer B 沖洗管柱 10 分鐘，把殘留在管柱內的雜質沖洗掉，之後再 利用 buffer A 沖洗管柱 10 分鐘，將管柱內液體置換成 buffer A，此即前平衡。隨後將 1.28 mg/mL 之抗菌胜肽取 20 μL 注入 HPLC 的注射孔中，開始 HPLC 的溶液梯度流 程 (如下圖 3.2 所示)，完成後即可得到 HPLC 圖譜，藉此即可分析所合成抗菌胜肽之 純度。
30 圖 3-2 HPLC 溶液梯度流程
3-3 最小抑制濃度測定 (Minimal Inhibitory Concentration；MIC)
原理
依據 Amsterdam (1996) 所提出之測量法，來判斷抗菌胜肽之抗菌活性。主要以抗 菌胜肽能抑制50％的細菌生長的濃度，為其最小抑制濃度。
儀器
1. 多功能全波長微量盤分析儀 (Multimode Microplate Reader；Molecular Devices Corp.
＃SpectraMax M2)
2. 迴轉式震盪培養箱 (DENG YNG ＃E600L)
3. 滅菌釜 (VERTICAL STERILIZER ＃CHIN KU AS-1060G) 材料
1. 培養菌株所需培養液
1.1 Nutrient Broth (NB；BD ＃234000)
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1.2 Brain Heart Infusion Broth (BHIB；BD ＃237500) 1.3 Tryptic Soy Broth (TSB；BD ＃211825)
1.4 Mueller Hinton Broth (MHB，DIFCO ＃275730) 1.5 Bacto Agar (BD ＃214010)
1.6 氯化鈉 (Sodium Chloride，NaCl；Wako ＃195-01663)
2. 已消毒的 96 孔聚丙烯盤 (Sterile 96-well polypropylene microtitre plates；COSTAR Cat.
No. 3790)
(由於帶有正電的抗菌胜肽會結合上聚苯乙稀，所以需以聚丙烯的 96 孔盤替代) 3. 已消毒的有蓋培養皿 (信德 ＃PP3-90R)
4. 醋酸 (acetic acid，CH3COOH；Wako ＃017-00251) 5. 牛血清白蛋白 (BSA；Sigma ＃A3803-10G)
方法
1. 溶液的配製
1.1 0.01％ 醋酸＋0.2％牛血清白蛋白及 0.02％ 醋酸＋0.4％牛血清白蛋白溶液 (w/w)取 0.2 g 的醋酸及 4 g 的牛血清蛋白溶於 1 L 的二次水中，即可得到 0.02％ 醋酸＋0.4
％牛血清白蛋白溶液。再取等體積的二次水將之稀釋，即可得到 0.01％ 醋酸＋0.2
％牛血清白蛋白溶液。
1.2 培養液的配製 NB 培養液
取 8 g 的 NB 培養基粉末，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌釜中滅菌，待放涼 後，即可得NB 培養液。
BHIB 培養液
取 37 g 的 BHIB 培養基粉末，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌釜中滅菌，待放 涼後，即可得BHIB 培養液。
TSB 培養液
取 30 g 的 TSB 培養基粉末，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌釜中滅菌，待放
32 涼後，即可得TSB 培養液。
MHB 培養液
取 21 g 的 MHB 培養基粉末，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌釜中滅菌，待放 涼後，即可得MHB 培養液。
TSB＋1.5％氯化鈉培養液
取30 g 的 TSB 培養基粉末及 15 g 的氯化鈉，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌 釜中滅菌，待放涼後，即可得TSB＋1.5％氯化鈉培養液培養液。
MHB＋1.5％氯化鈉培養液
取21 g 的 MHB 培養基粉末及 15 g 的氯化鈉，加入 1 L 的二次水中，再放入滅菌 釜中滅菌，待放涼後，即可得MHB＋1.5％氯化鈉培養液培養液。
2. 菌液的製備
將冷凍菌株由-80℃冰箱中取出，經解凍後，將菌液劃線培養於加入洋菜的培養液 培養皿中，在最適培養溫度下培養 16 小時，在培養皿中挑出單一菌落，放入培養液中 培養16 小時後，利用分光光度計測量菌液濃度 (OD600) ，將菌液調整至 104 cfu/mL。
表 所示為本實驗所使用菌種之名稱及最適培養條件。
3. 抗菌胜肽的製備
將所合成的抗菌胜肽由-20℃冰箱中取出，取所需最大濃度十倍量溶於 1 mL 包含 0.4%牛血清白蛋白的 0.02% 醋酸中 (如：最終濃度為 64 μg/mL 則需取 640 μg 溶於 1 mL) ，之後利用包含 0.2%牛血清白蛋白的 0.01% 醋酸將抗菌胜肽進行序列稀釋至所需 濃度 (320 μg/mL、160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL 及 10 μg/mL)。
4. 最小抑制濃度的測定
取 135 μL 先前所製備的菌液及 15 μL 不同序列稀釋的抗菌胜肽加入 96 孔聚丙烯盤 中，即可得濃度為 64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 之抗菌胜肽放入培養箱中，依菌株 最適培養溫度培養48 小時，再放入 microplate reader 中測得菌液濃度 (OD600)，以未加 任何抗菌胜肽的菌液濃度為基準，可抑制50％細菌生長的最小濃度，定義最小抑制濃度。
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3-4 最小溶血活性濃度測定 (Minimal Hemolytic Concentration；MHC)
原理
利用抗菌胜肽對兔子及人類紅血球的溶血活性，來模擬胜肽對真核宿主細胞的影響 程度，再配合 MIC 求出 MIC/MHC 值，便可得知抗菌胜肽對微生物選擇性。
儀器
1. 離心機 (KUBOTA；6500)
2. 迴轉式震盪培養箱 (DENG YNG；Incubator E600L) 3. 分光光度計 (Thermo ＃Helios β)
材料
1. 新鮮兔子血液
2. 磷酸鹽緩衝液 (phosphate buffered saline，PBS；Sigma ＃P7059-1L) 3. Triton X-100 (Amresco；Lot#0913B66)
方法
1. 紅血球的製備
取 1 mL 兔子的血液，利用離心機以 840xg 離心約三分鐘，待紅血球完全沉澱後，
再將上清液倒出，加入四倍體積的磷酸鹽緩衝液，使沉澱物完全懸浮後，再放置於離心 機離心 840xg 約三分鐘後，將上清液倒出，重複步驟三次，以清洗紅血球。待最後一 次離心，上清液倒出後，再將紅血球沉澱物冷藏於4℃冰箱中備用。
2. 溶血活性測試
取 995 μL 包含序列稀釋抗菌胜肽的磷酸鹽緩衝液，再加入 5 μL 先前所製備的兔子 或人類的紅血球，充分混合，放入 37℃ 培養箱中培養 30 分鐘後，放入離心機中離心
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840g 約三分鐘，待溶液完全沉澱，取 200 μL 的上清液，再加上 800 μL 的磷酸鹽緩衝液 混合，以分光光度計讀取OD413讀值，再代入下列算式中：
溶血活性＝ (F－F0)/(Ft－F0) X100％
F：不同序列抗菌胜肽的溶血程度 F0：未加入抗菌胜肽時的溶血程度
Ft：以Triton X-100 取代抗菌胜肽所得到的溶血活性定義為 100％
本實驗以造成50％溶血的最小濃度，定義為最小溶血活性濃度 (MHC) 。
3-5 微脂粒 (liposomes) 的製備
儀器
1. 磷脂質推擠器 (Extruder；Avanti ＃610000) 2. 粒徑分析儀 (Coulter ＃N4 Plus)
3. 旋轉減壓濃縮儀 (Rotary Evaporator；Eyela ＃N-1000) 材料
1. DOPC；1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (Avanti ＃850375)
2. DOPG；1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (Avanti ＃840475)
35 4. 氯仿 (chloroform，CHCl3；Wako ＃038-02606) 5. 甲醇 (methanol，CH3OH；Wako ＃137-01823)) 6. 氮氣 (建泰)
7. Tris 【tris(hydroxymethyl)aminomethane，NH2C(CH2OH)3；J. T. Baker ＃4109-06】
8. 鹽酸 (hydrochloric acid，HCl；Riedel-de Haen ＃30721) 9. 乾冰 (永全)
10. 丙酮 (acetone，CH3COCH3；Mallinckrodt ChromAR-HPLC ＃2435-4L) 方法
1. 溶液的配製
1 M Tris-HCl 溶液 (pH 7.4)
取121.14 g 的 Tris，將之溶於 1 L 的一次水中，再利用 HCl 將 pH 值調整至 7.4，儲 存備用。
2. 磷脂質製備
在圓底燒瓶中秤取不同比例的磷脂質 【DOPC、DOPC：DOPG (3：1、1：1、1：
3) 及 DOPG】 共 10 μmol，加入 2 mL 的 CHCl3/ CH3OH (3：1)，待磷脂質完全溶解後，
將圓底燒瓶裝置於旋轉減壓濃縮儀上，打開抽氣機，將有機溶劑完全抽乾 (或利用氮氣
將圓底燒瓶裝置於旋轉減壓濃縮儀上，打開抽氣機，將有機溶劑完全抽乾 (或利用氮氣