不同菌種間 DUF28 同源性蛋白質及演化樹之分析與胺基酸序列之比較 21

第三章 結果

I. 生物資訊功能性分析

1. DUF28 蛋白質在不同物種間之演化樹分析與蛋白質 domain 分析

為 了 瞭 解 DUF28 蛋 白 質 結 構 上 的 特 性 ， 及 在 不 同 物 種 之 分 佈 ， 利 用 EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) InterPro 資料庫分析 DUF28 蛋白質 家族，結果顯示除了古細菌 (表一)，在真核與原核物種都具有 DUF28 蛋白質。

DUF28 蛋白質 domain 包含約 230 個胺基酸， Aquifex aeolicus DUF28 蛋白質 (Aq1575) 的立體結構分為三個 domain ， domain 1 有 α-helix 、 domain 2 和 3 為 α-helix 與 β-sheet 混合而成 (Shin D. H., et al., 2002)，而該蛋白質立體結構與 大腸桿菌 Escherichia coli 的 DUF28 蛋白質 YebC 頗為相似 (附錄四)，顯示 DUF28 蛋白質在不同物種間具有高度保留性且在細菌中該蛋白質保有相似的立 體結構。

2. 不同菌種間 DUF28 同源性蛋白質及演化樹之分析與胺基酸序列之比較

為 了 瞭 解 在 細 菌 中 DUF28 同 源 蛋 白 質 的 相 似 性 及 關 聯 性 ， 利 用 PEC (Prolifling of E. coli chromosome) 生物資訊網站 (http://tinyurl.com/2cp8sh3) 及軟 體 VectoNTI 進行分析。從表一中可發現在大多數真細菌當中至少具有一個屬於 DUF28 蛋白質家族的同源性蛋白，只有極少部份的菌系沒有 DUF28 同源蛋白質，

而在某些細菌當中 (如腸道菌 E. coli) 則具有兩個 DUF28 同源蛋白。

利用 EMBL-EBI 生物資訊分析及 vector-NTI 將大腸桿菌的兩個 DUF28 蛋 白質 YeeN 及 YebC 與其它不同菌種之 DUF28 蛋白質進行演化分析及胺基酸 序列比對 (圖一)，結果顯示在親緣關係的分群上可將表現 DUF28 蛋白質的細菌 大致分做兩群，一群是 DUF28 同源蛋白與 YebC 較相似之菌種，另一群則是 DUF28 蛋白質與 YeeN 較為相像之菌種。具有兩個 DUF28 蛋白質之菌種有 Shigella boydii (soby)、 Shwanella oneidensis (sone) 及 Pseudomonas syringae (Psyr)，

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而其中同為腸道菌的 soby 與 E. coli 的相同度高達 99% (soby 2 : YeeN ; soby 1 : YebC)。但只具有一個 DUF28 同源蛋白之菌種則會各與 YeeN 或 YebC 相像，

如 Yersinia pestis (ype) 其蛋白質與 YebC 非常相像 (相同度 93%)，但與 YeeN 相似度只有 50% 。在親緣關係較遠之菌種如 Aquifex aeolicus 及 Thermotoga lettingae ，其 DUF28 蛋白質序列與大腸桿菌胺基酸序列相似度則偏低許多。利 用 Bio-editor 軟體分析比較在大腸桿菌中兩個 DUF28 蛋白質 (YeeN、YebC) 序 列相似度，發現這兩個蛋白質序列相似度約有 50% ，相同度只有 38% (圖二)。

這些結果顯示不同的菌種所保留的胺基酸序列不盡相同，並不會只與大腸桿菌其 中一個 DUF28 蛋白質相似。

3. 大腸桿菌 yeeN 及 yebC 基因於微陣列資料庫中基因表現

為了進一步了解大腸桿菌 yeeN 及 yebC 基因可能參與哪些功能，利用微陣 列資料庫 (NCBI 及 Ecogene database http://ecogene.org/EcoarrayStat.php) 搜尋 yeeN 及 yebC 在轉錄層次上之表現情況。結果顯示在不同逆境處理下如 (抗生素、

溫度、 H2O2) yeeN 的基因表現量有明顯變化 (上升或下降至少兩倍以上)，而 norfloxacin 及 spectinomycin 抗生素、溫度或是紫外光處理會使 yebC 基因表現 量有兩倍左右的變化量。這些結果指出 yeeN 會受到較多種類之逆境影響，而改 變其基因表現量 (表二)，顯示 yeeN 可能與逆境調節較為相關。

另外在搜尋大腸桿菌基因突變株之微陣列資料也可發現，在某些基因突變株 中 yeeN 或 yebC 基因表現量有明顯的變化。在 ΔrelA 、 ΔrecA 、 ΔyliH 、 ΔyceP 、 ΔgyrB 及 ΔparC 突變株中 yeeN 基因表現有明顯的變化 (上升或下降 至少兩倍以上)， yebC 則在 ΔbaeR 、 Δhns 、 ΔrecA 、 ΔglnG 、 ΔnorR 、 Δfur 及 ΔparC 這些突變株中，其基因表現量有兩倍左右之變化。較特別的是 yeeN 及 yebC 其基因表現在與逆境相關之突變株 ΔrecA 都有上升的趨勢，而在 ΔparC 中 兩基因表現量都有下降的趨勢 (表三)。這些結果顯示 yeeN 及 yebC 基因表現會 受到上述這些基因缺失的影響，推測這些基因可能是可調控 yeeN 或 yebC 功能

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的上游基因。

II. 大腸桿菌突變株 ΔyeeN 及 ΔyebC 之生物特性分析 1. 生長曲線、生物膜形成及泳動能力測定

為了瞭解大腸桿菌中 DUF28 基因缺失後是否影響其正常生長，測量兩突變 株在豐富 (LB) 及貧瘠 (M9) 培養基之生長曲線，可以發現只有 ΔyeeN 其吸光值 稍微偏低，但不論是在豐富或是貧瘠培養基中， ΔyeeN 及 ΔyebC 其生長曲線與 野生株並沒有太大的差異，顯示 yeeN 或 yebC 基因缺失後並不會影響大腸桿菌 的生長情況 (圖三 A 、 B)。

生物膜之形成對於微生物的生長及其抵抗環境中逆境的能力扮演重要角色，

為了瞭解 yeeN 或 yebC 基因在大腸桿菌生物膜的生成功能是否改變，進一步測 定野生株及突變株 (ΔyeeN 及 ΔyebC) 生物膜形成，結果顯示兩突變株之生物膜生 成能力都只有些微的增加，顯示 yeeN 或是 yebC 基因在生物膜的形成上並非扮 演關鍵性的角色 (圖三 C)。

泳動能力對於微生物在環境適應性上扮演重要角色，進一步測定 yeeN 及 yebC 突變株之泳動能力。試驗結果中可以發現，兩突變株 (ΔyeeN 及 ΔyebC) 之 泳動力都有極為顯著的增加 (圖三 D)。顯示 yeeN 及 yebC 基因參與調控大腸桿 菌的泳動能力，並且扮演重要的角色。

2. 逆境耐受性測試及相關基因表現

在先前的研究中指出在酵母菌中 DUF28 基因 (hah1) 參與在抵抗氧化逆境 之調控，因此測試野生株與突變株 (ΔyeeN 及 ΔyebC) 抵抗氧化逆境能力有何改變。

發現在 paraquat 處理 16 小時 ΔyeeN 對於 parquat 的抵抗能力有明顯增加的現 象 (圖四)，結果顯示 yeeN 參與調節 paraquat 所產生的氧化逆境；但在 H₂O₂ 及 tertiary-butylhydroperoxide (tBOOH) 處理下，由於菌落之間結果差異過大，分析多

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次實驗所得結果目前尚無法確認兩突變株對於此兩種氧化逆境因子之耐受性是否 增加 (附錄五)。

微陣列資料庫顯示 yeeN 或 yebC 之基因表現會受到不同抗生素處理有明顯 的變化 (表二)，進一步測試 ΔyeeN 及 ΔyebC 對於抗生素逆境的耐受性有何變化。

發 現 在 野 生 株 及 突 變 株 (ΔyeeN 及 ΔyebC) 中 ， 處 理 抗 生 素 rifampicin 、 spectinomycin 、 norfloxacin 及 novobiocin 之生長情形並沒有明顯的差異 (圖五)，

顯示 yeeN 或 yebC 基因並沒有參與大腸桿菌抵抗這些抗生素的耐受性。

由氧化逆境特性分析結果中發現 yeeN 突變後可能影響氧化逆境的調節，為 進一步了解 yeeN 是否參與調控氧化逆境相關基因之表現，利用即時定量 PCR 比 較野生株與 yeeN 突變株中與調控氧化逆境相關基因 (soxR 、 soxS 、 oxyR 、 fumC 、 katG 及 sodA) 的 RNA 表現量是否有改變。發現 yeeN 突變株與野生株 在未處理 paraquat 時這些基因的表現量都沒有明顯的變化，但 yeeN 突變株在處 理 paraquat 八小時後上述基因之表現量都有明顯增加的現象 (附錄六)，但由於目 前僅只有一次結果，尚無法有一定論。

III. 驗證 yeeN 及 yebC 基因功能 1. 互補株之分析

為了進一步驗證 yeeN 缺失確實會影響大腸桿菌之泳動能力，利用帶有 yeeN 基因的 IPTG 誘導質體 pCA24N 植入 ΔyeeN 中，測試其泳動能力結果顯示在加 入 0.3 mM IPTG 誘導 YeeN 表現後，泳動能力有明顯下降的趨勢 (附錄七)。為 驗證 yeeN 缺失確實會影響大腸桿菌抵抗 paraquat 之氧化逆境的能力，利用利用 帶有 yeeN 基因的 IPTG 誘導質體 pCA24N 植入 ΔyeeN 中，但由於影響因子眾 多 (IPTG、抗生素及 paraquat)，結果並無法下一定論。因此改採用低複製數之泛 寄主質體 pUFR047 質體將 yeeN 基因及其啟動子片段放入該質體，植入 yeeN 突變株進行互補，實驗結果發現互補株抵抗 paraquat 的能力有下降 (圖六、附錄

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十)，顯示 yeeN 基因確實參與大腸桿菌泳動能力及抵抗 paraquat 的能力之調節。

利用帶有 yebC 基因的 IPTG 誘導質體 pCA24N 植入 ΔyebC 中，測試其泳 動能力結果顯示在加入 0.3 mM IPTG 誘導 YebC 表現後，泳動能力有明顯下降的 趨勢 (附錄七)，因此可說明 yebC 基因在大腸桿菌調控泳動能力上確實扮演重要 角色。

IV. YeeN 及 YebC 蛋白質表現位置之觀察

為了瞭解 YeeN 及 YebC 在細胞內之功能，利用 YeeN、YebC 與綠螢光蛋白 (GFP) 融合法分析 YeeN 及 YebC 蛋白質於大腸桿菌中分布情形，以螢光顯微鏡 觀察其分布，並以西方墨點檢測其蛋白質表現量。

進行觀察時同時處理對照組 (empty vector, pCA24N)，結果顯示對照組並不會 產生螢光，利用 VectorNTI 檢測後確認 pCA24N 上 GFP 序列具有 start codon ， 但由西方墨點法分析結果中得知， pCA24N 並不會生成 GFP ，以上結果顯示若 pCA24N 質體未攜帶任何基因，則 GFP 不會表現，因此不會有 GFP 生成。

1. YeeN 蛋白質表現位置及分布情形

( 1 ) YeeN 蛋白質於不同濃度 IPTG 處理下之分佈情形

在 0.1 mM IPTG 處理時， YeeN 蛋白質在生長對數期早期 (early log phase) 會均勻分布在細胞質中，到對數期中期 YeeN 蛋白質開始呈點狀分布並且持續至生 長停滯後期 (stationary phase) 皆觀察到有點狀分布的現象 (圖七 A 、 C)。於 0.3 mM IPTG 誘導下在生長對數期早期 (early log phase) 便有出現點狀分布的情形，

且持續至生長後期皆然 (圖七 B 、 D)，顯示 YeeN 蛋白質於細胞中分佈呈點狀 分布的形式。

( 2 ) YeeN 蛋白質處理 paraquat 環境中於不同濃度 IPTG 之分佈情形

處理 0.6 M paraquat 情況下， 細胞生長延遲， 在 0.1 mM IPTG 的條件中

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YeeN 蛋白質在生長延遲期 (lag phase) 便有點狀聚集的現象 (圖七 A ，圖八 A)，

並且至生長對數期 (log phase) 皆有點狀聚集的情形。而處理 0.6 M paraquat 情況 下，於 0.3 mM IPTG 條件中，同樣在生長延遲期早期 (early lag phase) 便有點狀 聚集的現象，並持續至生長對數期 (log phase) 皆然 (圖七 B， 圖八 B)。顯示 YeeN 蛋白質在處理 paraquat 氧化逆境中，亦會促使點狀聚集的情形。

( 3 ) YeeN 蛋白質於低養環境中處理不同濃度 IPTG 之分佈情形

於貧瘠培養基 (M9) 中 0.1 mM IPTG 處理下， YeeN 蛋白質在生長進入對數 期 (log phase) 時會出現聚集的情形 (圖九 A 、 C)，而在 0.3 mM IPTG 情況下，

YeeN 蛋白質在生長延遲期 (lag phae) 便開始聚集 (圖九 B 、 D)。顯示 YeeN 蛋 白質在低營養環境下亦會促使點狀聚集的情形。

( 4 ) YeeN 蛋白質於不同濃度 IPTG 處理下蛋白質含量之分析

比較 YeeN 在生長對數早期 (early log phase) 處理 0.1 mM (尚未聚集) 及 0.3 mM IPTG (已聚集) 之蛋白質量變化，結果顯示 YeeN 在 0.3 mM IPTG 處理下，

蛋白質量較多，推測 YeeN 蛋白質含量會影響 YeeN 於細胞內點狀聚集之情形 (圖十三)。

由以上結果顯示， YeeN 蛋白質在細胞中當蛋白質量達一定程度後，會開始 出現點狀聚集，且 YeeN 蛋白質在 paraquat 氧化逆境及低養環境的情況下會促使 點狀聚集之分佈情形。

2. YebC 蛋白質表現位置及分布情形

( 1 ) YebC 蛋白質於不同濃度 IPTG 處理下之分佈情形

0.1 mM IPTG 處理下， YebC 蛋白質在生長停滯期後期 (late stationary phase) 出現聚集的情形，其聚集的型態與 YeeN 不同，呈現分段的現象 (圖十 A 、 C)，

而在 0.3 mM IPTG 處理下， YebC 蛋白質同樣在生長停滯期後期 (late stationary phase) 出現分段聚集的現象 (圖十 B 、 D)，結果顯示 YebC 蛋白質在生長停滯