構築互補質體及 Promoter fusion lacZ 質體

將 SDS-PAGE 取下去除 stacking gel 後浸泡於 transfer buffer 中。裁剪適當 大 小 的 3MM Whatman filter paper 與 轉 漬 用 PVDF membrane (Polyscreen, PerkinElmer)，先將 PVDF membrane 以 methanol 浸溼再與 filter paper 浸泡於 transfer buffer 中。將 transfer buffer 倒入塑膠盆中放入固定夾，由負極開始依序 放入多孔海綿、 filter paper 、 SDS-PAGE 膠體、 PVDF membrane 、 filter paper 及多孔海綿去除氣泡後將固定夾夾好放入 cassette 中，將 transfer buffer 倒入電泳 槽內至八分滿，並放入磁石後，於 4℃ 供給 20V 電壓及 90 mA 電流轉漬過隔夜。

轉漬完後取下 PVDF membrane ，加入 Ponceau S 染劑染色先行偵測蛋白質轉漬 效率，而後以清水洗去染劑。加入含 5% 脫脂奶粉之 20 mL TBST buffer 室溫下 震盪搖晃 2 ~ 2.5 小時後去除 buffer ，再加入 15 mL TBST buffer 室溫震盪清洗 5 分鐘兩次。於 10 mL 含 3% 脫脂奶粉之 TBST buffer 加入 1：10000 稀釋倍 數之抗體 ( mouse monoclonal IgGα His-HRP ) 室溫震盪搖晃 2 小時後去除 buffer 後加入 20 mL TBST buffer 清洗 5 ~ 15 分鐘重覆清洗三次。加入 ECL detection reagent (Peroxide solution：Luminol reagent = 1：1)，使用 (Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate，Millipore)，反應 1 分鐘後以 LAS3000 (Fujifilm) 偵測訊號。

IV. 構築互補質體及 Promoter fusion lacZ 質體 1. 萃取大腸桿菌 genomic DNA

取單一菌落培養於 LB 液態培養基中，於 37℃ 震盪培養 16 小時。取一微 量離心管將 1.5 mL 菌液以 13000 rpm 離心 3 分鐘後去除上清液。加入 200 μL lysis buffer 以 pipetting 方式混合均勻，再加入 66 μL 5 M NaCl 以 pipetting 方式 充分混合後以 13000 rpm 離心 15 分鐘，取出上清液至新的微量離心管後加入等 體積 chloroform 輕輕反轉數次，混勻後離心 13000 rpm 5 分鐘將上層液取出，加 入兩倍體積 100% EtOH 而後離心 13000 rpm 10 分鐘，去除上清液以 70% EtOH

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清洗兩次，小心移去上清液後置於桌上待乾，乾燥後以 50 μL 1 X TE buffer 或 1/2 X TE buffer 回溶。

2. 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)

設計特定引子以聚合酶連鎖反應增幅目標基因或目標基因 promoter 至 5’ 端 部分序列，取 2 μL 10 倍稀釋的 genomic DNA 當模板，再加入 10 μL 5X Phusion HF buffer 、 10 μL 10 mM dNTP 、 10 μM forward 及 reverse 引子各 2.5 μL 及 0.5 μL Phsion DNA 聚合 (2U/μL)。均勻混合後放入聚合酶連鎖反應器中進行反應。

反應溫度及時間如下：

Cycle # Denature Annealing Extension

1 95℃，5 分鐘

34 95℃，30 秒 T℃，30 秒 72℃，t 分鐘

1 72℃，5 分鐘

T：溫度依據引子之 Tm 值，t：時間依據增幅長度設定 (1 kb/ min)

PCR 之產物取 2 μL 進行 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析 (90V，30 分鐘) 以確認基 因長度。

3. 限制酶消化酵素水解及膠體純化

將載體與目標 DNA 片段利用限制酶消化水解。取 5 ~ 8 μL 的 DNA 混合 0.5 μL (20 U/μL) 限制酵素、2 μL 10 X NEB buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT pH 7.9)、 2 μL 1/10 X BSA ，最後加入無菌去離子水使總體 積為 20 μL 。均勻混合後於 37℃ 反應 2 ~ 3 小時，以 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析 ( 90V，30~35 分鐘 ) 確定基因之長度後以 Micro-Elute DNA clean/ Extraction Kit ( Gene Mark ) 進行膠體純化，再以 0.8 % 瓊脂糖凝膠電泳分析 ( 90V，30 分鐘 ) 以確認 DNA 片段長度。

4. 載體與目標片段接合

將載體 DNA 與目標片段 DNA 利用接合酶 (T4 DNA ligase, New England

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Biolabs, U.S.A.) 接合。載體與目標 DNA 片段比例為 1：3 ，加入 2 μL 10X T4 ligation buffer 及 0.5 μL T4 DNA ligase ( 400 U/μL ) ，以無菌去離子水補至最終體 積 20 μL ，均勻混合後置於室溫 2 小時或隔夜後進行熱休克轉型。

5. 大腸桿菌熱休克轉型作用

將勝任細胞自 -80℃ 保存取出放置冰上待融，於 30 ~ 50 μL 勝任細胞中加入 10 ~ 15 μL 的接合產物，放置冰上 30 分鐘後給予 42℃ 熱休克處理 45 秒，立即 置於冰上 3 分鐘，接著加入 1 mL SOC 培養液，於 37℃ 震盪培養 1 小時，6000 rpm 離心 3 分鐘去除 800 μL 上清液，將 pellet 以剩餘上清液混勻後塗佈於含適 當抗生素的固態培養基上， 37℃ 培養 16 小時，挑選單一菌落進行實驗。

6. 萃取大腸桿菌質體 DNA

取單一菌落培養於 2 ~ 3 mL LB 液態培養基中，於 37℃ 震盪培養 16 小時。

取一微量離心管將菌液以 13000 rpm 離心 3 分鐘後去除上清液。加入 200 μL solution I ，混合均勻 (可震盪) 再加入 400 μL solution II ，輕輕反轉數次放置於 冰上 5 ~ 10 分鐘。加入 300 μL solution III ，輕輕反轉數次後放置於冰上 5 ~ 10 分鐘。以 13000 rpm 離心 20 ~ 30 分鐘後小心取出上清液放入新的微量離心管。

加入等體積 isopropanol 及 1/10 X 體積 3M NaOAc ，混合均勻後放置於 -20℃ 2 小時或隔夜。以 13000rpm 離心 5 ~ 10 分鐘，去除上清液後加入 1 mL 75% 酒精 搖晃數次後將酒精盡量吸乾後放置於桌上 5 ~ 10 分鐘待乾，加入 ddH2O 或 elution buffer 20 ~ 50 μL 回溶。

7. 製備大腸桿菌電穿孔勝任細胞

取 3 至 4 個單一菌落於 LB 或 LB 加 kanamycin 抗生素之液態培養基中 37℃ 震盪培養 16 小時，測量 OD600 吸光值，於 100 mL LB 液態培養基中加入 OD₆₀₀ 小於 0.01 之菌液， 37℃ 震盪培養 2 ~ 2.5 小時待 OD₆₀₀ 0.3 ~ 0.5 ， 以 6500 rpm 4℃ 離心 15 分鐘，去除上清液後放置於冰上再加入 40 mL 冰的 10%

glycerol ，用力搖晃均勻； 6500 rpm 4℃ 離心 15 分鐘，去除上清液加入 20 mL