第四章 討論
VI. yebC 與 yeeN 是否參與 quorum sensing 之調節
在特性分析發現 yebC 基因與逆境調節並無直接關連。測定不同生長時期 yebC 啟動子活性結果顯示，但 yebC 的啟動子則要在對數期至停滯期才會開始表
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現 (圖十五)，可以推論 yebC 及 yeeN 基因可能具有不同的功能所以才會有不同 的調控方式。 YebC 蛋白質位置結果發現，YebC 蛋白質不論在何種處理下，蛋 白質皆均勻分布於細胞質中不會有聚集的情形，但在停滯期後期 YebC 則會出現 分段聚集的現象，進一步利用西方墨點法檢測蛋白質含量推測 YebC 分段聚集的 現象可能與蛋白質的含量並無關連，而可能與細胞的生長時期有關。先前實驗顯 示 yebC 會負調節鞭毛的生合成，其啟動子於對數期才會開始有活性且在生長至 停滯期達最高，而 YebC 蛋白質在細胞進入停滯期後期才有聚集的現象。先前文 獻指出 P. aeruginosa 中 DUF28 基因 (PA0964)，會參與調節細菌的 quorum sensing (Liang H., et al., 2008)，而 quorum sensing 是細菌調節族群數量的方式之一，
當細菌由對數期生長至停滯期時，細菌便會藉由 quorum sensing 進行族群量的調 節 (Ahmer B. M. M., 2004)，綜合以上結果推論 yebC 可能與調節 quorum sensing 有關。因此，大腸桿菌中的 yebC 基因可能與 P. aeruginosa 的 DUF28 基因 (PA0964) 有類似的功能。但 yeeN 是否參與調節 quorum sensing ，則需進一步實 驗證實。未來需利用 EMSA 來檢測 YebC 及 YeeN 蛋白質是否與 PA0964 同樣 有與調節 quorum sensing 啟動子結合之能力，藉此確認大腸桿菌中 YebC 及 YeeN 確實參與調節 quorum sensing 。
VII. 參與泳動力及氧化逆境調節之上游基因特性分析
經由微陣列資料庫所搜尋可能參與調節 yeeN 或 yebC 的基因，檢測這些基 因突變株的泳動力及氧化逆境的特性後，結果發現 ΔrelA 、 ΔglnG 、 Δhns 、 ΔyceP 及 ΔbaeR 突變株之泳動能力有增加， ΔrecA 及 ΔparC 則些微降低。目前 已知在大腸桿菌中 recA 缺失會影響鞭毛推進的能力，而 recA 參與調節 swarming motility (Gómez-Gómez J.M., et al., 2007)，針對 hns 的研究指出 hns 基因會正調 節鞭毛生合成相關基因 flhDC (Krin E., et al., 2010)。另有文獻指出 yceP 缺失會使 鞭毛生合成相關基因表現量上升，且參與調節大腸桿菌生物膜生成 (Domka J., et
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al., 2006)。對於 relA 、 glnG 、 baeR 及 parC 如何參與調節泳動力之研究甚少，
未來可進一步針對上述基因進行泳動力調節相關研究。在氧化逆境部分， ΔrecA 、 ΔnorR 、 ΔparC 及 Δhns 突變株對 paraquat 氧化逆境耐受性增加，而 ΔrelA 較 為敏感。已知在 H2O2氧化逆境下 recA 表現量上升，參與修復遭受氧化逆境損害 之 DNA (Takechi S., et al., 2009) 目前 norR 、 parC 、 hns 及 relA 於 paraquat 氧化逆境中所扮演的角色並不清楚，相關研究較少，本論文首次發現這些基因可 能參與調節 paraquat 所生成之氧化逆境，未來可進一步針對這些基因於氧化逆境 之調節作較深入之研究與探討。
VIII. recA 在氧化逆境下可能參於調節 yeeN 基因
yeeN 啟動子的活性分析結果顯示，正常環境中 ΔrecA 中 yeeN 啟動子活性 有明顯降低的現象，推測在正常生長情況下 recA 會正調控 yeeN 之啟動子表現。
先前研究中指出 recA 參與在 DNA 複製及修復上，一旦 recA 突變後會使細胞較 易產生自體突變 (Cox M. M., 2003) 且 recA 突變株對於 UV 及 H2O2 的逆境較 為敏感，另外也有文獻指出 recA 基因不會受到 paraquat 的誘導但會受到 H2O2
誘導使表現量增加 (Storz G., et al., 1990)，進一步推測 yeeN 基因可能參與 DNA 複製及修復功能。與 yebC 屬同一操縱子的 ruvC 基因已知為核酸內切酶是 RuvABC resolvasome 成員之一，參與切除 Holliday junction ， ruv C 突變株對於 UV 也具有高度敏感性，因此猜測 yebC 有可能參與調節 DNA 修復。綜合上述 現象可進一步推測大腸桿菌中 DUF28 基因 (yeeN 及 yebC) 可能參與修復 DNA 的功能。在未來須以實驗證實，例如檢測 ΔyeeNΔyebC double mutant 對 UV 之耐 受性，及與 DNA 修復之相關基因表現來加以驗證。
IX. relA 於正常環境中正向調控 yeeN，但在氧化逆境下並無直接參與調節 yeeN yeeN 啟動子的活性分析結果顯示，正常環境中 ΔrelA 中 yeeN 之啟動子活性 有明顯降低的現象，推測在正常生長時 relA 會正調控 yeeN 之啟動子表現。relA 為
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(p)ppGpp synthetase ，在大腸桿菌中 ppGpp 已知為全面性調控因子，在缺乏胺基 酸時會抑制 rRNA 的合成 (Magnusson L. U., 2005)；除此之外，也作為細胞感受 外界環境變化之訊息分子 (Foster. P. L., 2007)。目前研究僅指出 relA 基因缺失對 於 H2O2之氧化逆境耐受性增加 (DiDonato L. N., et al., 2006)，但並未有研究指出 relA 基因對於 paraquat 氧化逆境之反應為何。由實驗結果得知，於生長早期正常 環境中 yeeN 啟動子會受到抑制，因此推測 yeeN 之表現會受到 relA 的正調控。
由文獻得知 relA 參與調節細胞遭受營養匱乏之相關逆境反應 (stringent response)，
因此進一步推測 yeeN 可能也會參與細胞調節營養匱乏之逆境反應，但 relA 是否 直接調節 yeeN 之表現則需利用互補的方式加以驗證，也可能是由 ppGpp 調控因 子感應周遭環境後，間接由其他基因影響 yeeN 啟動子的活性。而 relA 突變株經 paraquat 逆境處理後，其 yeeN 啟動子與在正常情況下的表現並沒有差異皆受到 抑制，但 relA 突變株抵抗 paraquat 氧化逆境的能力較差，因而推測在氧化逆境 下 relA 基因並無直接參與調節 yeeN。進一步推測 ΔrelA 對於 paraquat 較敏感 與 yeeN 調節氧化逆境之方式無關，而 relA 如何藉由其他途徑參與 paraquat 氧 化逆境的調節則需進一步研究加以了解。
X. 在鞭毛生合成過程中 hns 基因可能參與調節 yeeN
在泳動力、氧化逆境特性分析結果顯示 hns 基因缺失對於 paraquat 氧化逆境 的耐受性有明顯上升，但目前對於 hns 基因與氧化逆境之間的關聯性並不清楚。
但 在生 長後期 yeeN 啟動子活性在 hns 突變株中不論是正常 情況或是處理 paraquat 情況下都有明顯增加的現象，顯示不論正常環境或氧化逆境下 hns 負調 節 yeeN 之啟動子活性，因而推測 hns 與 yeeN 調節氧化能力並無直接關聯性。
但有許多研究指出在鞭毛生合成上，hns 扮演重要的調節角色，當 hns 缺失時 E.
coli 泳動力下降，與鞭毛生合成相關基因如 flhDC 表現量也明顯下降，鞭毛生合 成能力因此降低 (Bertin P.,et al., 1994 ; Ko M. & Park C., 2000)。藉由先前研究進一
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步推論 hns 基因在生長後期會負調控 yeeN 啟動子，使 yeeN 基因無法抑制 flhDC 的基因表現，讓鞭毛生合成能力增加，而 hns 基因也會啟動 flhDC 基因表 現促使鞭毛生成。另外也有部份研究指出，hns 會受到不同環境因子影響，如冷休 克或生長時期的調節等等，但 yeeN 基因是否與這些環境因子有關需做進一步的 實驗瞭解。
XI. 結語
綜合以上結果， yeeN 參與氧化逆境調節；而 yebC 則對氧化逆境耐受性不 會有直接影響，在啟動子組成及調節上也可發現， yeeN 具有自身的啟動子並且 會受到氧化逆境影響而被抑制； yebC 則在生長後期才會有啟動子的表現，其啟 動子活性也不會受到氧化逆境影響而有變化，可以推論 yebC 及 yeeN 基因可能 具有不同的功能所以才會有不同的調控方式。 YeeN 蛋白質的分布情形呈現點狀 聚集，並會受到氧化逆境及低養環境的影響促使聚集； YebC 蛋白質除在生長後 期會有分段聚集的情形外，其他生長時期皆是均勻分布，且不會受到氧化逆境及 低養環境的影響而有所變化。進一步推論， yeeN 及 yebC 基因同屬 DUF28 蛋 白質家族成員，在調節鞭毛生合成上具有功能重複性，但這兩者在大腸桿菌中同 時也具有不一樣的功能， yeeN 可能與環境中逆境的調節有關，尤其是參與在氧 化逆境的調節，而 yebC 基因可能參與在族群數量上的調控 (quorum sensing)。
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第五章 未來展望
未來需製作 yeeN 及 yebC 同時突變之 double mutants 突變株，進一步確認 大腸桿菌中 DUF 28 基因在生長、氧化及抗生素逆境上有何影響。
針對不同菌種中 DUF28 蛋白質之功能可利用 heterologous complementation 進行跨菌種或跨物種間表現基因，進一步推測有 DUF28 蛋白質的菌種或物種，
其 DUF28 蛋白質是否與大腸桿菌中的 DUF28 蛋白質有相似 ( 參與調節氧化逆 境 ) 的功能。
大腸桿菌 yeeN 基因參與調節氧化逆境，檢測 YeeN 蛋白質於氧化逆境之表 現量，驗證細胞處於逆境中會促使 YeeN 蛋白質聚集。對於 yeeN 可能參與之調 控路徑，可利用即時定量 RT-qPCR 檢測氧化逆境及調節氫氧根離子相關基因表現，
推測其調節氧化逆境之相關機制，並針對氧化磷酸化相關基因進一步做測試。可 藉由 relA 之互補株測定其中 yeeN 之表現量驗證 relA 是否直接調節 yeeN。對於 ppGpp 是否與參與調節 yeeN 基因表現可利用測定細胞內在正常環境下之 ppGpp 的含量，並藉由添加 ppGpp 檢測 yeeN 基因表現量有何變化，進一步找出 ppGpp 與 yeeN 基因調節上有何關聯。
對於其他可能位於上游調節之基因突變株參與泳動力及氧化逆境之調節，可 進行更多功能性的研究做進一步探討。
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