功能性分子標誌之建立與多重迴歸分析

採用顏 (2015) 根據王 (2010) 在 F2及蘇 (2010) 在 F2.4族群，多個環境下 QTL 定位結果，選擇重複定位次數大於兩次的 QTL 共四個，基因比對結果為 Ehd1、Ehd4、Ghd7 及 Dth8。然而 Ehd1 與 Ehd4 的功能性分子標誌已在顏 (2015) 的研究結果中成功設計出，直接利用Ehd4 與 Ehd1 功能性分子標誌對 RILs 族群 做基因型判別。本次研究再根據顏 (2015) 定序 Ghd7 基因序列重新設計功能性

分子標誌，以及定序兩親本Dth8 序列以及設計功能性分子標誌。

1. 以Taqman 系統對 Ghd7 做基因型判別

顏 (2015) 將 TK2 與 TCS10 的 Ghd7 基因序列分別對應至功能性較低的 Ghd7-2 對偶基因，以及具完全功能的 Ghd7-3 對偶基因型，但是根據先前 SNP 位 點設計的allele specific primer set 為顯性分子標誌，無法判別異質結合個體。因 此採用Taqman 系統重新挑選 SNP 位點設計新的一組功能性分子標誌，於 Thermo

Fisher 網頁設計 Taqman Assay，選取 SNP 位置前後 50 bp 的序列進行設計。PCR 反應總體積為10 µL，包含 10 ng genomic DNA，5µL ABI Universal Master Mix (Applied Biosystems)，20X Custom Taqman Genotyping Assay 0.5 µL。以 ABI 7500 熱循環反應器進行產物擴增，模式設定為Genotyping，反應條件為 60˚C 1 min、

95˚C 10 min，40 cycles 的 95˚C 15 s、60˚C 1 min，最終 60˚C 1 min 後降溫至 25

˚C。反應結束後根據 Allelic Discrimination Plot 的分群結果與親本做對照後，對 RILs 的 Ghd7 做基因型判別 (附圖六)。

2. Dth8 基因定序及功能性分子標誌設計

欲確立TK2 與 TCS10 的 Dth8 基因核苷酸序列多型性，並取日本晴 DNA 做 為對照組，利用BatchPrimer3.0 (https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/) (You et al., 2008) 設計三組引子，引子之設計類別選擇 Generic primers，產物大小參數設 定min:300、opt:400 及 max:500 bp，其他參數設定為預設值。PCR 反應總體積 10 μL，包含 20 ng genomic DNA，0.5 µM 引子組合，5X Phusion HF Buffer 2 μL，

Phusion DNA Polymerase 0.1 µL (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA,USA)，10 mM 0.2 µL dNTPs。PCR 反應條件為 98˚C 30 s，35 cycles 的 98˚C 30s，60˚C 30s，

72˚C 1min，最終降溫至 4˚C。將 PCR 產物於 1% AgaroseⅠ進行電泳，確認產物 符合目標大小及專一性後進行Sanger 定序。以 CLC Sequence Viewer 7 作序列比 對，參數設定為預設值，比對結果在可將日本晴、TK2 及 TCS10 分別歸類於功 能性弱的hap2、功能性強的 hap8 及不具功能的 hap5 (Zhang et al., 2015b)。

取 TK2 及 TCS10 的 Dth8 基因的複合型微衛星序列上找到兩親本之間有 (CGC)3差異，針對這9 bp 序列大小設計功能性分子標誌。在多型性位點前後 100 bp 序列大小以 BatchPrimer3.0 設計引子，引子之設計類別選擇 Generic primers，

參數設定為預設值，其對TK2 及 TCS10 的擴增產物大小為分別為 129 及 120 bp。

PCR 反應總體積為 10μL，20 ng genomic DNA，0.4 µM 引子組合，0.5 U

IMMOLASE™ DNA polymerase (Bioline)，2.5 mM 0.8 µL dNTPs，50 mM 0.4 µL MgCl2，Bioline 10X buffer 3.75 µL。反應條件為 95˚C 15 min，35 cycles 的 95˚

C 30 s、65˚C 30 s、72˚C 30 s，最終降溫至 4˚C。因 PCR 產物大小僅差 9 bp，故 選擇解析度較大的膠體，以5% MetaPhor® Agarose (Lonza Rockland) 100 V 進行 2 小時電泳，確認可以清楚判別 TK2、TCS10 及 artificial F1的基因型後，再對258 個RILs 做基因型判別 (附圖八)。

3. 利用功能性分子標誌建立多重迴歸模型

為了解控制抽穗日數基因與播種期之間的關係，必須將遺傳因子與播種期在

同一個線性模式下進行分析，本次研究以四個功能性分子標誌對 RILs 族群進行

基因型定型，能夠正確地判別所有個體的基因型，避免顏 (2015) 的迴歸分析受 到基因型轉換的限制，只能利用遺傳定位資料的兩側的分子標誌預測目標基因座 的基因型，在兩側分子標誌基因型相同的情況下才能保留該筆資料，因此捨去部 分不確定基因型的個體，線性模型只有選擇效應較大的 qHD10 及 qHD3 兩個基 因座放入模型，以免加入過多基因座造成拋棄大量資料而無法得到正確的分析結 果。

F8.9世代族群的基因型異質結合率約0.4%，因此在做基因效應分割時只將目 標基因型分為A (A1A1)與 B (A2A2) 兩個變級，估算加性效應 (addictive effect, a)。資料分析分別在兩個播種期以變方分析法檢視統計顯著的基因或基因間交感 項，並且合併兩個播種期資料，評估基因與播種期之間的交感項效應，變方成分 估計以R::VCA 套件 remlMM 方法計算 (Schuetzenmeister, 2016)，外表型解釋變 異 (phenotypic variance explained, PVE) 以變方成分之百分比估計。