次世代定序

真核生物當中，單核苷酸多型性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 相

較於其他分子標誌在基因組上多型性的數量比例最高，其中在水稻中發現每232

bp 即出現一個 SNP (Feltus et al., 2004)。次世代定序 (Next Generation Sequence, NGS) 利用光學影像技術可以對大量個體平行定序，使得一次定序總量達到數億

至數十億的鹼基數量，與 Sanger 定序方法相較下，降低了時間與資金成本而獲

得高通量資料。Illumina Miseq 及 Hiseq (Illumina, San Diego, CA, USA) 為最廣泛 被應用的定序平台，其得到的短讀序長度介於 50-300 bp，定序通量依照平台不 同，介於 1.5-600 Gbp。利用 NGS 技術開發大量的 SNP 目前被廣泛應用在研究 生物親緣關係學 (phylogenetics)、親緣地理學 (phylogeography)、關聯性分析 (association studies)、分子標誌輔助選拔 (marker-assisted selection)、基因組選拔 (Genomic selection) 、 建 構 遺 傳 圖 譜 (genetic mapping) 及 數 量 遺 傳 基 因 座 (Quantitative trait locus, QTL) 定 位 (Huang et al., 2010; Poland et al., 2012b;

McCormack et al., 2013; Spindel et al., 2013; Yang et al., 2015)。

GBS (Genotyping by sequencing) 方法結合 NGS 的技術，使得 SNP 的開發在

定序時同步進行基因型探勘。傳統的分子標誌如 SSR 為最常被使用來建構水稻

連鎖圖譜及QTL 定位，SSR 分子標誌引子之設計受到參考序列的限制，開發 SSR

分子標誌需投入相對較多的時間與人力，且基因組上SSR 分子標誌的密度較 SNP

稀少，以之建構的連鎖圖譜密度較低，遺傳定位到的 QTL 數量少且無法精細呈

現QTL 在連鎖圖譜上的位置 (Yu et al., 2011)。

GBS 方法可分為兩大類 : 以限制酶降低基因組複雜度的簡化代表性基因組 定序 (Reduced-representation Sequencing, RRS) 以及全基因體再定序 (whole-genome resequencing, WGR)。根據族群結構組成以及研究目的預期獲得分子標誌 較高，在有可靠的參考序列條件下，可進行基因型補差 (genotype imputation) 來 彌補此方法的缺點。連鎖圖譜的密度取決於染色體的重組次數，當互換率低時，

分子標誌間距太緊密時會造成資訊的累贅；當分子標誌之間連鎖不平衡 (linkage disequilibrium) 相當大時，僅需挑選其中一個分子標誌就足夠。用於建構兩親本 雜交後代族群的連鎖圖譜時，僅需數千個分子標誌就足以得到理想結果，此時 RRS 相 較 WGR 較 有 效 率 提 供 足 量 的 分 子 標 誌 以 建 立 高 密 度 連 鎖 圖 譜 (Beissinger et al., 2013)。

RRS 方法共同特點皆以限制酶切辨識基因組特定位點以達到降低基因組複 雜度，然而根據限制酶使用的種類與數量，較廣泛被應用的有 : 限制酶切位相 關 DNA 定序 (Restriction site-associated DNA sequencing, RADseq) (Baird et al., 2008)、Elshire GBS (Elshire et al., 2011)、雙限制酶 GBS (Two-enzyme GBS) (Poland et al., 2012a)、雙 限制酶切位相關 DNA 定序 (Double digest restriction site-associated DNA sequencing, ddRAD) (Peterson et al., 2012)。

RADseq (Baird et al., 2008) 方法使用辨識六個鹼基的 EcoRI 或辨識八個鹼基 的 SbfI 限制酶後，連接包含條碼 (barcode) 的 P1 adapter，將樣品混合後隨機斷 裂成長度約500 bp 的大小後接上 P2 adapter，最終僅有包含 P1 與 P2 adapters 的 片段才能進行PCR 擴增。Elshire GBS (Elshire et al., 2011) 最初利用 ApeKI 避開

玉米基因組上重複序列，方法簡化為將限制酶切與adapter 連結的步驟同時進行，

並省去隨機斷裂與片段大小篩選兩步驟，其缺點為在分析大量個體時，每個個體 僅能提供部分分子標誌資訊，在有參考序列的條件下可以進行 imputation 補足缺 值。Two-enzyme GBS (Poland et al., 2012a) 以及 ddRAD (Peterson et al., 2012) 方 法皆使用兩個限制酶組合，功能分別為決定片段數目、降低基因組複雜度與控制 片段長度大小，Two-enzyme GBS (Poland et al., 2012a) 使用 PstI 及 MspI 限制酶 組合後，接上 barcode adapter 及 Y adapter，避免在 GBS 方法的文庫製備中有一 半的片段無法被增幅的資源浪費。ddRAD (Peterson et al., 2012) 使用 EcoRI 及 MspI 限制酶組合後，接上 barcode adapter 及 Y adapter 之後混合樣品，進行片段 大小篩選。最後在 PCR 擴增階段加入能辨識不同樣品的 index，相較於 al., 2011; Kim and Tai, 2013; Duan et al., 2013; Spindel et al., 2013; Liu et al., 2015;

Arbelaez et al., 2015; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2015a; Leon et al., 2016; Furuta et al., 2017)。