探討控制水稻抽穗日數基因與播種期之交感

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國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系研究所碩士論文

Department of Agronomy

College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

探討控制水稻抽穗日數基因與播種期之交感 Interaction between Genes Controlling Days to Heading

and sowing dates in Rice

石瀞予 Ching-Yu Shih

指導教授：胡凱康博士 Advisor: Kae-Kang Hwu, Ph.D.

中華民國 107 年 1 月

Jan 2018

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中文摘要

水稻的抽穗日數為影響產量的重要農藝性狀之一，不同品種因地理環境與栽培期作培育出最合適的抽穗日數以達到最佳產量。抽穗日數由多個效應不同的基

因控制，有些基因與環境因子如日長及溫度具有交感效應。本試驗利用台稉 2 號

與台中秈10 號的雜交後 RILs，評估兩個播種期與四個功能性分子標誌 Ehd1、Ehd4、

Ghd7 與 Dth8 基因與環境之間的交感作用，亦建構連鎖圖譜偵測在此族群中是否 存在其他控制抽穗日數的QTL。

分別對兩個播種期做多重迴歸分析，其中Ehd1、Ehd4 與 Dth8 顯著影響兩個 播種期抽穗日數的變異，Ghd7 只在較早播種期下顯著表現。在較早播種期下 Ehd1:Ghd7:Dth8 與較晚播種期下 Ehd1:Dth8 基因間交感統計上顯著。將兩個播種 期與合併的多重迴歸分析中，播種期為影響抽穗日數變異最大的因子，其外表型解

釋變異為 54.46%，除了在兩個播種期分別做多重迴歸分析結果得到的基因與基因

交感效應，Ehd4 和 Ghd7 與播種期之間具有交感效應。QTL 分析與多重迴歸分析結果差異不大，除了51.52 cM 上的 Ghd7 外，在 78 cM 上多偵測到 qHD7，推測此 區間可能含有一個以上的基因，需要進一步利用染色體片段置換系驗證此觀察結果。在不同環境下評估基因表現有利於後續分子標誌輔助選種之應用，穩定表現的基因適用於廣泛區域的育種，與環境間具有交感的基因則可應用在特定地區品種之培育。

關鍵字 : 水稻、抽穗日數、多重迴歸分析、QTL 定位

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Abstract

Heading days is one of the important agronomic traits for seed production in rice.

Rice cultivars have been bred to adapt to various environments and cropping systems in terms of optimum flowering time to maximize the grain yield. Heading days in rice is controlled by multiple quantitative genes, and some of these genes may have effects that interact with environmental factors such as photoperiod and temperature. In this study, we evaluated the heading days of a RILs population derived from a cross between Taiken 2 and Taichung Sen 10 under two sawing dates, and genotypes of four previously found heading days controlling genes Ehd1, Ehd4, Ghd7, and Dth8 via functional markers to evaluate the interaction between genes and environments. We also constructed a genetic linkage map for this population to determine if there are other QTLs controlling heading days.

When analyzed separately, the results of multiple regression analysis showed that Ehd1, Ehd4 and Dth8 significantly affected heading days in both environments, while

the effect of Ghd7 was only statistically significant in the early sawing date. Genetic interactions of Ehd1:Ghd7:Dth8 and Ehd1:Dth8 were statistically significant in the early and late sawing date, respectively. When the heading days under both sawing dates were combined, the results of multiple regression analysis indicated the sawing

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effects and interactions found in the separated analysis, Ehd4 and Ghd7 were found interacting with sawing dates. The result of QTL analysis was largely consistent with the multiple regression analysis except that gHD7 position at 78.00 cM of chromosome 7 was mapped instead of the Ghd7 located at 51.52 cM, suggesting that there may be more than one genes at chromosome 7 controlling heading days. Further study using chromosome segment substitution lines may be needed to verify this supposition.

Evaluating genetic effects in different environments can contribute to marker assisted selection. Steadily detected genes can be used in general environments; however, genes having interactions with environments could be used for varieties developed for a certain sawing date.

Key word: Oryza sativa L, Heading days, multiple regression, QTL mapping

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表目錄

表一、兩個播種期的氣候資料... 17

表二、早播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果... 30

表三、晚播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果... 30

表四、早播種期的抽穗日數多重迴歸分析結果... 31

表五、晚播種期的抽穗日數多重迴歸分析結果... 31

表六、在早播種期下16 種基因型效應的抽穗日數估計值與觀察值... 34

表七、在晚播種期下16 種基因型效應的抽穗日數估計值與觀察值... 34

表八、合併兩個播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果... 36

表九、合併兩個播種期的多重迴歸分析結果... 37

表十、分子標誌於12 個連鎖群上的結果... 42

表十一、試驗族群中發生不平衡分離的分子標誌... 46

表十二早播種期MIM 結果 ... 48

表十三晚播種期MIM 結果 ... 48

表十四、模型Y~EHD1+EHD4+DTH8+QHD7(MODEL1) 及 Y~EHD1+EHD4+DTH8+QHD7(MODEL2) 的遺傳定位結果 ... 52

表十五、台稉2 號/台中秈 10 號雜交 F2、F2.4及RILS族群在不同環境下遺傳定位結果... 54

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對照表

臨界日長 (critical day length)

雙限制酶切位相關DNA 定序 (Double digest restriction site-associated DNA sequencing, ddRAD)

轉殖株 (transgenic plants) 據圖選殖 (map-based cloning)

頂端分生組織 (shoot apical meristem, SAM) 同源基因 (ortholog)

鋅指 (zinc finger)

單核苷酸多型性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 次世代定序 (Next Generation Sequence, NGS)

生物親緣關係學 (phylogenetics) 親緣地理學 (phylogeography) 關聯性分析 (association studies)

分子標誌輔助選拔 (marker-assisted selection, MAS) 基因組選拔 (Genomic selection)

數量遺傳基因座 (Quantitative trait locus, QTL)

簡化代表性基因組定序 (Reduced-representation Sequencing, RRS) 全基因體再定序 (whole-genome resequencing, WGR)

連鎖不平衡 (linkage disequilibrium)

限制酶切位相關DNA 定序 (Restriction site-associated DNA sequencing, RADseq) 雙限制酶GBS (Two-enzyme GBS)

重組自交系 (Recombinant Inbred Lines, RILs) 生育度數法 (growing degree days, GDD)

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外表型解釋變異 (phenotypic variance explained, PVE) 多重區間定位法 (multiple interval mapping, MIM) 區間定位法 (Interval mapping, IM)

超親分離 (transgressive segregation)

分離基因座 (segregation distortion loci, SDL)

全染色體置換系 (whole chromosome substitution lines, WCSL) 染色體片段置換系 (chromosome segment substitution lines, CSSL)

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第一章前言

水稻 (Oryza sativa L.) 為短日植物，當其感受日照長度小於臨界日長 (critical day length) 時才會抽穗 (Izawa, 2007a)。水稻抽穗日數能做為評估品種對地域適應性的重要性狀，不同地理環境差異與栽培制度使得水稻抽穗日數變異相當大，但目標皆為在恰當的時機抽穗，維持穩定的產量 (Jung and Müller, 2009)。

抽穗日數由多個基因與不同環境因子調控，為一複雜的數量性狀 (Lee and An, 2015; Cho et al., 2017)。地區及期作間的溫度與日長差異，使得水稻的抽穗日數表現不一致，部分控制抽穗期的數量遺傳基因座 (Quantitative trait locus, QTL) 在不同環境下有不同的效應，QTL 與環境之間具有交感作用 (王, 2010; 蘇, 2010;

顏, 2015; Han et al., 2017)。

抽穗日數的研究可以用以探討將台灣二期作更改為中間期作之構想，中間期作插秧時間介於一和二期作之間，除了能避開一期作秧苗期遭逢低溫寒害，在中南部地區則能夠避免春耕缺水的限制；亦能減緩在二期作因遭受較多的天然災害，

使得生產成本較高、品質較差的現象。若將中間期作水稻的營養生長期拉長至秋颱過後才抽穗，此一生長階段的植株對颱風的耐受性較高，避免災害造成產量減損。此外，中間期作可以與其他雜糧作物輪種，產量收成應能舒緩兩期作總產量過剩的現象。

本次研究參考前人在相同親本不同世代雜交族群的抽穗日數遺傳定位與候選基因比對結果得到Ehd1、Ehd4、Ghd7 與 Dth8 基因，採用前人已經設計的 Ehd1 與Ehd4 功能性分子標誌，並從已知 Ghd7 序列中找尋其他 SNP 位點重新設計功 能性分子標誌。此外，本次實驗亦將 TK2 與 TCS10 的 Dth8 基因定序並針對多 型性位點設計功能性分子標誌，使用Ehd1、Ehd4、Ghd7 與 Dth8 共四個功能性

分子標誌對RILs 族群做基因型判別，在相同的迴歸模型下探討基因與環境之間

的交感作用。此外，亦利用雙限制酶切位相關DNA 定序 (Double digest restriction

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site-associated DNA sequencing, ddRAD) 建構連鎖圖譜，進行 QTL 定位，找尋其他可能控制抽穗日數變異的基因。

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第二章前人研究

第一節抽穗期相關研究

水稻為短日植物，短日條件 (日長 <10 小時) 能促進水稻開花，長日條件 (日長 >14 小時) 則抑制開花 (Izawa, 2007a; Tsuji et al., 2008)。抽穗期為適應不同地理生態環境以及栽培期作的重要性狀，能決定後續的產量及品質 (Jung and Müller, 2009)。植株在生長期間，整合外在環境訊號以及內部遺傳調控機制，在最佳條件下抽穗後進入生殖生長期階段，最終以達到穩定的產量，其中受到的環境因子包含有溫度、濕度、光強度、風、溫度及日長 (Hayama et al., 2003; Bentley et al., 2013)。

至今已超過70 個開花基因經由突變株 (mutants)、轉殖株 (transgenic plants) 及自然變異 (natural variation) 的方法找到 (Hori et al., 2016)。其中經由據圖選殖 (map-based cloning) 方法找到的基因有 : Se/Se1/K/Lm/Hd1、E1/M/m-Ef1/Ghd7、

E2/Hd17/Ef7/OsELF3-1/OsELF3/Hd-q 、 E3/Hd6 、 E/Ef1/Ehd1 、 Hd3a 、 RFT1 、 DTH8/Ghd8/LHD1/Hd5/LH8、DTH3/OsMADS51、DTH2、Hd16/EL1、OsPRR37/Hd2、

Ehd4、Hd18。

在短日條件下，開花素基因Hd3a 由 Hd1 及 Ehd1 兩個獨立表現的基因控制 (Yano et al., 2000; Kojima et al., 2002; Doi et al., 2004; Tamaki et al., 2007)。OsGI 表 現量由晝夜時鐘調控，能促進Hd1 表現量，促使水稻開花 (Hayama et al., 2003)。

Ehd1 上游基因 Ehd2、Ehd3、Ehd4 及 OsMADS51 互為獨立作用且為正調控因子 (Matsubara et al., 2008, 2011; Gao et al., 2013)；。Ehd2 與玉米 indeterminate 1 基 因同源，能促使玉米開花 (Matsubara et al., 2008)；Ehd3 編碼轉錄調控因子 (Matsubara et al., 2011)；Ehd4 編碼鋅指 CCCH domain 蛋白，調控水稻對光週期 的開花反應 (Gao et al., 2013)；OsGI 可直接或經由 OsMADS51 間接活化 Ehd1 表現量 (Itoh et al., 2010)。

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在長日條件下，Hd1 功能由促進轉換為抑制 Hd3a 表現量，進而抑制水稻開花 (Izawa, 2007b)。Hd6 能加強 Hd1 對 Hd3a 的抑制效應 (Takahashi et al., 2001;

Ogiso et al., 2010)，亦受到 Hd1 與 Ghd7 構成的複合體調控 (Nemoto et al., 2016)。

RFT1 為 Hd3a 的同源基因，兩基因僅相距 11.5 kb，其在長日條件下表現量增加，

使水稻仍保持開花 (Komiya et al., 2008, 2009)。Ehd1 與 DTH2 為 RFT1 的正調控因子，能活化RFT1 表現量 (Doi et al., 2004; Wu et al., 2013b)；Se14 則為負調控 因子，抑制RFT1 表現量 (Yokoo et al., 2014)。DTH3、OsMADS51、OsMADS56、

Ehd2 及 Ehd4 為 Ehd 上游基因，能誘導 Ehd1 表現量；DTH8、OsCOL4、OsCOL10 及 OsLFL1 則為 Ehd1 的負調控因子，會抑制 Ehd1 表現量。DTH8 可能透過與 Hd1 形成複合體的形式而抑制開花 (Wei et al., 2010; Yan et al., 2011)；DTH3 與 OsMADS51 形成複合體進而調控 Ehd1 (Ryu et al., 2009)；OsMADS51 藉由調控 Hd18 進而誘導 Ehd1 表現量 (Kim et al., 2007; Shibaya et al., 2016)；OsVIL2 能誘 導OsLFL1 表現量，進而抑制 Ehd1 (Peng et al., 2008; Yang et al., 2013)；Se13 抑 制 Ehd2 表現量進而活化 Ehd1 表現量 (Matsubara et al., 2008; Yoshitake et al., 2015)；OsCOL4 能持續抑制 Ehd1 表現量，與 OsCOL10 皆為類 CONSTANS 家族 的成員 (Lee et al., 2010)，OsCOL10 能藉由活化 Ghd7 進而抑制 Ehd1 表現量 (Tan et al., 2016)。Ehd3 與 Hd17 為 Ghd7 正調控因子，能誘導 Ghd7 表現量，OsTrx1 則為負調控因子，抑制Ghd7 表現量 (Choi et al., 2014)；Hd16 藉由磷酸化作用活 化Ghd7 表現量，抑制 Ehd1、Hd3a 及 RFT1 表現量，造成晚花現象 (Hori et al., 2013)。OsCOL16 藉由誘導 Ghd7 表現量，抑制 Ehd1、Hd3a 及 RFT1 的表現量，

造成晚花 (Wu et al., 2017)。OsPRR37 為 Hd3a 上游基因，作用機制獨立於 Hd1 及 Ehd1，OsPRR37 藉由抑制 Hd3a 表現量，進而抑制開花 (Koo et al., 2013)。

Hd3a/RFT1 調控下游基因的機制無論在長日或短日條件下皆一致，Hd3a 在莖頂 端與14-3-3 蛋白 OsFD 結合進而誘導開花 (Purwestri et al., 2009)，OsFD 與 GF14c

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誘導OsMADS14 與 OsMADS15 表現量，使莖頂端分生組織 (shoot apical meristem, SAM) 由營養生長期轉變成生殖生長期階段 (Lim et al., 2000)。

抽穗期為一數量性狀，由多對效應大小不等的QTL 共同調控，有些 QTL 表

現容易受到環境影響，在不同地區或期作之間有不同的效應，形成 QTL 與環境

間的交感作用 (QTL × environment interaction effect)。藉由在多個環境評估控制

抽穗期的QTL 表現差異，能夠衡量 QTL 效應之穩定性，有利於育種家進行分子

標誌輔助選拔。關於抽穗期在多個環境下的QTL 定位，Han et al (2017) 建立秈稻 Zhenshan 97 與稉稻 Xizang 2 雜交的分離族群 RILs，分別栽種在連續三年長日條件 (武漢，30.5˚N) 及一年短日條件 (海南，18.5˚N)，在長日條件下定位到 8 個 QTLs，短日條件下定位到 2 個 QTLs，其中僅有 qHD10.1 同時在長日及短

日下被偵測到，其餘 QTL 在短日下沒有效應，或是效應很小以致無法顯著被定

位，顯示控制抽穗期之QTL 多為對光敏感，QTL 幾乎都在長日條件下被定位到，

使得在長日條件下族群的抽穗期變異較短日條件下抽穗期變異來得大。其中 qHD7.1 及 qHD8 連續三年的長日條件下都有被定位到，可分別對應至 Ghd7 及 Dth8 基因的物理圖譜位置，為兩個控制抽穗期的主效基因，加性效應分別為 12.9- 15.9 天及 8.6-11.1 天，外表型解釋變異分別為 49.1-59.8%及 21.6-29.9%。

王 (2010) 利用台稉 2 號 (TK2) 與台中秈 10 號 (TCS10) 雜交 F2族群在台北一期作定位到3 個與抽穗日數相關的 QTL，蘇 (2010) 利用相同親本不同世代雜交族群 F2.4，於台北、台中及高雄各兩期作共定位到 11 個與抽穗日數相關的 QTL。顏 (2015) 合併 7 個環境的遺傳定位結果，挑選重複定位到兩次以上的 QTL 並做候選基因比對，得到qHD10 (RD1005-RD1006) 範圍可對應至 Ehd1、qHD3 (RD0301-RD0302) 範圍可對應至 Ehd4、qHD7 (RD0704-RD0705) 範圍可對應至 Ghd7、qHD8a (RD0803-RD0804) 範圍可對應至 Dth8 基因。在重複定位到三次的 qHD5a (RD0501-RD0502) 區間內沒有比對到前人研究與控制抽穗日數相關的基 因。顏 (2015) 將 TK2 與 TCS10 的 Ehd1、Ehd4 與 Ghd7 基因定序結果與前人研

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究比對，得到TK2 帶有失去部分功能 ehd1-T65 對偶基因，TCS10 帶有功能正常 Ehd1 對偶基因；TK2 帶有功能正常的 Ehd4 對偶基因，TCS10 帶有失去部分功 能的ehd4 對偶基因；TK2 帶有功能性較差的 Ghd7 -2 對偶基因型，TCS10 帶有 具完全功能的 Ghd7-3 對偶基因型。顏 (2015) 根據序列間多型性位點設計功能 性分子標誌，Ehd1 與 Ehd4 功能性分子標誌可以清楚判別兩種對偶基因與異質結 合型，但Ghd7 基因型判別因為使用單一反應的 allele specific primer set，無法判 別異質結合型。

Ehd1 基因僅存在於水稻，並未在阿拉伯芥中找到同源基因 (ortholog)，Ehd1- Hd3a/RFT1 途徑為水稻獨有，具有促使開花的作用 (Doi et al., 2004)。Ehd1 基 因在長日及短日條件下皆會促使Hd3a 與 RFT1 表現量，進而誘導開花。Saito et al (2009) 研究指出在短日條件下，帶有不具功能 ehd1 對偶基因之 T65 的 BVG 為71.8 天，而帶有具功能 Ehd1-gla 對偶基因之 NIL-T65e，其 BVG 為 47.7 天，

在短日條件下不具供功能 ehd1 對偶基因能延長 BVG 使抽穗期較長。具功能

Ehd1 對偶基因之品種有較短的 BVG，這類品種多分布在緯度 25-39˚N 之溫帶 地區；不具功能ehd1 對偶基因之品種，其 BVG 則相當長，分布區域位在緯度較低21-26˚N 地區。Zhao et al (2015) 建立 3 個 T65/Guangluai4 雜交 F4族群，在中國廣州與海南兩個栽培季種植，分別為三月中到八月的長日條件 (c. 13.5 h)，及七月到十一月的短日條件 (c. 12 h)。當帶有不具功能 ehd1-T65 對偶基因的片段

會使得抽穗期在長日及短日條件下分別增加15 天及 18 天。此外，在同時具有不

具功能 ehd1-T65 對偶基因與不具功能 Hd3a/rft1-GLA 對偶基因組合的族群中發 現，無論長日或短日條件下植株都不抽穗；然而族群中帶有其中一個具有功能的 Ehd1-GLA 或 Hd3a/RFT1-T65 對偶基因時，植株則維持正常開花現象，推測 ehd1- T65 與 Hd3a/rft1-GLA 對偶基因具有上位性，當同時帶有兩個不具功能的對偶基 因組合會使水稻無法開花。檢測Ehd1、Hd3a 及 RFT1 對偶基因在 3 個族群的表 現量，結果得到在短日條件下具功能 Ehd1-GLA 對偶基因能促進 Hd3a 及 RFT1

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的表現量，但在長日條件下Ehd1-GLA 對偶基因表現量減少，使得 Hd3a/RFT1 表 現量隨之降低；而在不具功能的 ehd1-T65 對偶基因的情況下 Hd3a 表現量完全

被抑制，但具功能的RFT1-T65 對偶基因仍有些微表現量得以維持開花，不具功

能的rft1-GLA 對偶基因的植株則有不花現象，由此結果可得知具功能 Ehd1 對偶 基因才能使Hd3a 表現。

水稻開花由兩個遺傳機制控制，分別為 Hd1 及 Ehd1 兩個獨立途徑 (Doi et al., 2004; Izawa, 2007b; Komiya et al., 2009)。Ehd1 基因在短日下能促使水稻抽穗，

長日條件下仍可促進早花，但效應則較不明顯。Hd1 基因在短日下會誘導開花素基因Hd3a 表現量增加以促進開花，長日下 Hd3a 表現量則受到抑制，造成晚花 現象 (Yano et al., 2000; Izawa et al., 2002)。然而 Nemoto et al (2016) 研究指出在長日條件下，Hd1 為 Ehd1 的上游基因，Ehd1、Hd3a 及 RFT1 基因的表現量皆會受Hd1 抑制。在長日條件下，Ehd1 基因只有在不具功能 hd1 對偶基因存在的條 件下才能促使Hd3a 及 RFT1 開花素基因表現。

Lin et al (2002) 建立以日本晴為輪迴親，Kasalath 為貢獻親的 BC4F2族群，

長日條件下於第三條染色體前端定位到控制抽穗期的 Hd9，當染色體片段帶有

Kasalath 對偶基因時，會使抽穗期增加 2.7 天。建立以日本晴為遺傳背景，帶有 Kasalath 之 Hd9 片段的 Nip (hd9)，在長日條件下其開花時間較日本晴晚 7 天，

在短日條件下兩者抽穗期則沒有差異。Bian et al (2011) 在帶有非洲稻 3S 對偶基因片段的 NIL 與稉稻 Dianjingyou 1 (DJY1) 雜交族群 F2定位到 DTH3，當帶有 DJY1 的 DTH3 對偶基因片段時，於長日及短日條件下抽穗期皆減少 7-10 天。在 長日及短日條件下，NIL 的 dth3 表現量皆低於 DJY1 的 DTH3 表現，DTH3 會促進Ehd1 及 RFT1 表現量，但僅在長日條件下 DTH3 才會促進 Hd3a 表現量。Ehd4 編碼 CCCH-type 鋅指 (zinc finger) 蛋白，在水稻栽培種中具高度保守性，且未在阿拉伯芥、玉米、高粱等其他植物中找到同源基因。Ehd4 藉由促進 Ehd1 基因表現量，進而活化下游開花素基因Hd3a 及 RFT1 之表現量，在長日及短日條件

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下皆會促使水稻早花。然而Ehd4 在長日條件下之促進早花的效應較短日下來得 大，ehd4-Kit 突變株之抽穗期在長日及短日條件下，較 Kit 植株分別晚 106 天及 49 天開花，ehd4-NIP 突變株之抽穗期，與 Nip 相較在短日條件下晚 23 天開花，

在長日條件下則不開花。利用Ehd4 對偶基因之功能性可以區分秈稉稻，秈稻主

要歸類於Hap_2，栽培環境為中低緯度地區，稉稻多被分類在具功能 Hap_3 對偶基因，在長日條件下可以促進水稻開花，有助於水稻適應高緯度地區的長日條件 (Gao et al., 2013)。

Yano et al (1997) 於 Nipponbare/Kasalath F2族群中的第七條染色體上定位到包含Ghd7 基因的數量性狀基因座 Hd-4，在長日條件下帶有 Kasalath 之 Hd-4 對 偶基因會使得抽穗期增加2.9 天。Ghd7 基因編碼 CCT domain 蛋白，為一多效性 基因，影響水稻每穗粒數、株高及抽穗期。帶有具功能Ghd7 對偶基因之 NIL(mh7)，

其抽穗期較帶失去功能ghd7 對偶基因之 NIL(zs7) 多 21 天、株高增加 33.3 cm，

及總產量提高50.9%。Ghd7 基因在長日下會抑制 Ehd1 與 Hd3a 基因的表現量，

短日下則促進 Ehd1 在黑暗期的表現量，但不影響 Hd3a 的表現量，三者間關係 為 Ghd7-Ehd1-Hd3a，在阿拉伯芥中未發現相對應的同源基因，是水稻獨有控制 開花的途徑。藉由分析栽培稻之Ghd7 對偶基因序列，發現不同 Ghd7 對偶基因 對水稻的產量及地理環境適應性影響相當大，帶有具功能 Ghd7 對偶基因之品種，

其抽穗期在長日環境下會受到抑制；帶有不具功能 ghd7 對偶基因的品種分布在

溫帶地區。在長日條件下不具功能ghd7 對偶基因能減少對下游基因 Ehd1 與 Hd3a 的抑制作用，延遲開花的效應相當微弱或不具效應，因此使得品種能夠適應高緯度地區生長期較短的環境 (Xue et al., 2008)。Zheng et al (2016) 分析 69 個種原的 Ghd7 對偶基因及抽穗期之關聯性，發現不具功能 ghd7 對偶基因在長日條件下抽 穗期顯著少於具功能 Ghd7 對偶基因，其中帶有不具功能 Ghd7-7 對偶基因之種 原都分布在溫帶地區如中國北方、日本及韓國。Zhang et al (2015b) 建立 Zhenshan 97/93-11 F2族群在長日條件下定位到 Ghd7，具功能 Ghd7 對偶基因會使抽穗期

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延後18.1 天。作者同時分析 320 個品種之 Ghd7 序列，發現秈稉稻之間有明顯的 分界，秈稻主要歸類在功能性強 Hap1，稉稻則多屬於功能性較弱 Hap4。具功能性Ghd7、Ghd8 及 Hd1 對偶基因皆對光照敏感 (Lin et al., 2000; Xue et al., 2008;

Yan et al., 2011)，三個對偶基因皆具功能組合 (SSF) 在長日下有顯著的晚花現象。

在長日條件下，Ehd1、Hd3a 及 RFT1 基因表現量在 SSF 組合顯著低於 SSN 組

合，使得 SSF 組合有較長的抽穗期。三個不同對偶基因組合有其適應之地理環

境，皆不具功能組合之品種於高緯地區栽培對日長反應為鈍感，能在生長期短且日照長的地區有恰當的抽穗期以避免寒冬受凍；皆具功能組合之品種則種植於地緯地區 (Zhang et al., 2015b)。帶有不具功能 ghd7 對偶基因之 NILs(ghd7) 的 Ehd1、

Hd3a 及 RFT1 無論日照長短，皆具有高表現量；帶有不具功能 Ghd7 對偶基因之 NILs(Ghd7) 在長日條件下之 Ehd1、Hd3a 及 RFT1 表現量皆受到抑制，延後開 花。Ghd7 基因可單獨造成水稻晚花現象，但 Hd1 必須在具功能 Ghd7 對偶基因存在下才有抑制開花的功效。在長日條件下 (13.5-14.5h)，Hd1 與 Ghd7 具有交感作用，帶有Hd1 與 Ghd7 對偶基因組合的品系相較於 hd1 與 Ghd7 組合品系，

其Ehd1 及 RFT1 表現量顯著受到抑制。Ghd7-Hd1 複合體會藉由結合 Ehd1 5'UTR cis-regulatory region，兩者共同抑制 Ehd1 的表現量；但在短日條件下 Ehd1 表現 量則不受Ghd7 影響 (Nemoto et al., 2016)。

Yano et al (1997) 於 Nipponbare/Kasalath F2族群中第八條染色體上定位到包含Ghd8 基因的數量性狀基因座 Hd-5，在長日條件下帶有 Kasalath 之 Hd-5 對偶 基因會使得抽穗期增加3.4 天。DTH8 編碼 CCAAT-box-binding 轉錄因子的 HAP3

亞基，為一多效性基因，能控制產量、株高及抽穗期，在長日條件下抑制 Ehd1

及Hd3a 表現量，造成晚花現象，但在短日條件下 Ehd1 及 Hd3a 基因表現量和抽 穗期則不受影響。帶有不具功能dth8 對偶基因之 CSSL61，在長日條件下其抽穗

期、株高及每穗粒數均減少，在短日條件下則不影響性狀表現。分析 40 個水稻

品種DTH8 基因序列，品種因核甘酸序列有缺失造成失去功能的對偶基因，其表

(21)

現為光鈍感型，在長日條件下抽穗期不因日長而有大幅度變化，適合作為高緯地

區育種選拔之對偶基因，帶有具功能DTH8 對偶基因則為光敏感型，短日可促進

開花，適合做為低緯度地區選拔之對偶基因 (Wei et al., 2010)。Yan et al (2011) 提出在短日及長日條件下，Ghd8 分別有促進與抑制開花的作用，帶有具功能 Ghd8 對偶基因之 ZS97-Nip 轉殖株在短日條件下較 ZS97 早花 1.5 天，在長日條件下則延後 1.5 天開花。檢測基因表現量的結果指出 Ghd8 為 Ehd1 與 Hd3a 上游基 因，在短日條件下，分別帶有具功能及不具功能Ghd8 對偶基因之 NIL-ZS 與 NIL- HR5，其 Ghd8、Ehd1 及 Hd3a 表現量沒有差異，抽穗期沒有顯著差異，但長日 條件下三個基因在NIL-HR5 之表現量則較低，NIL-HR5 延後開花 7.8 日。Dai et al (2012) 建立以 Teqing 為輪迴親，但帶有野生稻的 LHD1 對偶基因片段之 YIL79，

在長日條件下其抽穗期較Teqing 多出 34.6 天，在短日條件下兩者的抽穗期幾乎一致。在長日條件下，Ehd1、Hd3a 及 RFT1 表現量在 YIL79 低於在 Teqing 之表現量，抑制抽穗期，在短日下三個基因之表現量則沒有顯著差異。 LHD1/Ghd8/Dth8 在長日條件下會抑制 Ehd1、Hd3a 及 RFT1 表現量，延遲開花 時間，但不影響株高及每穗粒重；在短日條件下三個基因之表現量則無變化。

Zhang et al (2015b) 建立 Zhenshan 97/93-11 F2族群在長日條件下定位到Ghd8，

具功能 Ghd8 對偶基因會使抽穗期延後 17 天。Ghd8 之 haplotype 在秈稉間有明 顯分界，作者藉由分析320 個品種之 Ghd8 序列，將秈稻歸類於 hap11 及 hap5 兩 群，皆為不帶功能的haplotype (Wei et al., 2010; Yan et al., 2011)，稉稻多屬於具較弱的功能性 hap2。Zheng et al (2016) 指出 Ghd8 對偶基因分布有特定區域之特

性，分析 74 個種原的 Ghd8 對偶基因功能性與抽穗期之關聯性，具功能與不具

功能之Ghd8 對偶基因的抽穗期平均值分別為 76 及 99 天，兩種對偶基因間之抽

穗期具有顯著的差異，其中帶有不具功能ghd8 對偶基因的種原分布於中國東部。

Du et al (2017) 指出 Dth8 與 Hd1 具交互作用，共同調控 Hd3a 表現量，進而控制 水稻開花。DTH8-Hd1 複合體在長日條件下會抑制 Hd3a 基因表現量，而不具功

(22)

能 dth8 對偶基因則不與 Hd1 形成複合體，使 Hd3a 表現量維持不變，水稻正常 開花。然而DTH8-Hd1 複合體在短日條件下會促進 Hd3a 基因表現量，使得水稻 提早開花。

第二節次世代定序

真核生物當中，單核苷酸多型性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 相

較於其他分子標誌在基因組上多型性的數量比例最高，其中在水稻中發現每232

bp 即出現一個 SNP (Feltus et al., 2004)。次世代定序 (Next Generation Sequence, NGS) 利用光學影像技術可以對大量個體平行定序，使得一次定序總量達到數億

至數十億的鹼基數量，與 Sanger 定序方法相較下，降低了時間與資金成本而獲

得高通量資料。Illumina Miseq 及 Hiseq (Illumina, San Diego, CA, USA) 為最廣泛被應用的定序平台，其得到的短讀序長度介於 50-300 bp，定序通量依照平台不同，介於 1.5-600 Gbp。利用 NGS 技術開發大量的 SNP 目前被廣泛應用在研究生物親緣關係學 (phylogenetics)、親緣地理學 (phylogeography)、關聯性分析 (association studies)、分子標誌輔助選拔 (marker-assisted selection)、基因組選拔 (Genomic selection) 、建構遺傳圖譜 (genetic mapping) 及數量遺傳基因座 (Quantitative trait locus, QTL) 定位 (Huang et al., 2010; Poland et al., 2012b;

McCormack et al., 2013; Spindel et al., 2013; Yang et al., 2015)。

GBS (Genotyping by sequencing) 方法結合 NGS 的技術，使得 SNP 的開發在

定序時同步進行基因型探勘。傳統的分子標誌如 SSR 為最常被使用來建構水稻

連鎖圖譜及QTL 定位，SSR 分子標誌引子之設計受到參考序列的限制，開發 SSR

分子標誌需投入相對較多的時間與人力，且基因組上SSR 分子標誌的密度較 SNP

稀少，以之建構的連鎖圖譜密度較低，遺傳定位到的 QTL 數量少且無法精細呈

現QTL 在連鎖圖譜上的位置 (Yu et al., 2011)。

(23)

GBS 方法可分為兩大類 : 以限制酶降低基因組複雜度的簡化代表性基因組定序 (Reduced-representation Sequencing, RRS) 以及全基因體再定序 (whole- genome resequencing, WGR)。根據族群結構組成以及研究目的預期獲得分子標誌

數量，來決定使用何種 GBS 方法。當目標獲得的分子標誌總數少或是基因組複

雜度高的情況下，使用RRS 方法相較於 WGR 方法較有效率。RRS 使用限制酶辨識基因組上特定位點，僅選取特定基因組區域作定序，降低基因組複雜度，因此在固定定序資源條件下，可以提高定序深度，或是投入更多樣品。WGR 則缺少減低基因組複雜度之步驟，每個個體得到的定序深度相對較低，基因型缺值率較高，在有可靠的參考序列條件下，可進行基因型補差 (genotype imputation) 來彌補此方法的缺點。連鎖圖譜的密度取決於染色體的重組次數，當互換率低時，

分子標誌間距太緊密時會造成資訊的累贅；當分子標誌之間連鎖不平衡 (linkage disequilibrium) 相當大時，僅需挑選其中一個分子標誌就足夠。用於建構兩親本雜交後代族群的連鎖圖譜時，僅需數千個分子標誌就足以得到理想結果，此時 RRS 相較 WGR 較有效率提供足量的分子標誌以建立高密度連鎖圖譜 (Beissinger et al., 2013)。

RRS 方法共同特點皆以限制酶切辨識基因組特定位點以達到降低基因組複雜度，然而根據限制酶使用的種類與數量，較廣泛被應用的有 : 限制酶切位相關 DNA 定序 (Restriction site-associated DNA sequencing, RADseq) (Baird et al., 2008)、Elshire GBS (Elshire et al., 2011)、雙限制酶 GBS (Two-enzyme GBS) (Poland et al., 2012a)、雙限制酶切位相關 DNA 定序 (Double digest restriction site- associated DNA sequencing, ddRAD) (Peterson et al., 2012)。

RADseq (Baird et al., 2008) 方法使用辨識六個鹼基的 EcoRI 或辨識八個鹼基 的 SbfI 限制酶後，連接包含條碼 (barcode) 的 P1 adapter，將樣品混合後隨機斷裂成長度約500 bp 的大小後接上 P2 adapter，最終僅有包含 P1 與 P2 adapters 的片段才能進行PCR 擴增。Elshire GBS (Elshire et al., 2011) 最初利用 ApeKI 避開

(24)

玉米基因組上重複序列，方法簡化為將限制酶切與adapter 連結的步驟同時進行，

並省去隨機斷裂與片段大小篩選兩步驟，其缺點為在分析大量個體時，每個個體僅能提供部分分子標誌資訊，在有參考序列的條件下可以進行 imputation 補足缺值。Two-enzyme GBS (Poland et al., 2012a) 以及 ddRAD (Peterson et al., 2012) 方法皆使用兩個限制酶組合，功能分別為決定片段數目、降低基因組複雜度與控制片段長度大小，Two-enzyme GBS (Poland et al., 2012a) 使用 PstI 及 MspI 限制酶組合後，接上 barcode adapter 及 Y adapter，避免在 GBS 方法的文庫製備中有一半的片段無法被增幅的資源浪費。ddRAD (Peterson et al., 2012) 使用 EcoRI 及 MspI 限制酶組合後，接上 barcode adapter 及 Y adapter 之後混合樣品，進行片段 大小篩選。最後在 PCR 擴增階段加入能辨識不同樣品的 index，相較於 Two- enzyme GBS 方法可以投入更多樣品。

RRS 方法在建構連鎖圖譜與 QTL 定位中被廣泛應用，其中使用 RADseq 方法 (Baird et al., 2008) 的作物有大麥 (Chutimanitsakun et al., 2011) 、草莓 (Davik et al., 2015) 及茄子 (Barchi et al., 2011, 2012)；使用 GBS 方法 (Elshire et al., 2011) 方法的作物有水稻 (Spindel et al., 2013)、玉米 (Chen et al., 2014)、向日葵 (Celik et al., 2016)、芝麻 (Uncu et al., 2016) 等。利用 ddRAD 方法 (Peterson et al., 2012) 的作物有花生 (Zhou et al., 2014)、奇異果 (Scaglione et al., 2012, 2015) 及康乃馨 (Yagi et al., 2017)。目前在水稻中已有許多研究利用 GBS 方法探勘 SNP 分子標誌，其具有增加連鎖圖譜上SNP 密度，及提高 QTL 定位的效率及精確度 (Yu et al., 2011; Kim and Tai, 2013; Duan et al., 2013; Spindel et al., 2013; Liu et al., 2015;

Arbelaez et al., 2015; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2015a; Leon et al., 2016; Furuta et al., 2017)。

(25)

第三章材料與方法

第一節遺傳材料及栽培環境

1. 遺傳材料及外表型調查

本試驗的材料親本為台稉2 號 (TK2) 及台中秈 10 號 (TCS10)，及 F8:9世代 258 個重組自交系 (Recombinant Inbred Lines, RILs)，分別於 2015/04/22 及 2015/07/03 播種，約兩週後移植至本田並調查抽穗日數，地點為台大實驗田 (121.5˚E, 25.0˚N)。家系按照序號由小到大在田間以 S 型排列種植，行株距 25 公分×25 公分種植，每個家系種植 6 株單本植，呈現 2×3 方格，以及 1 叢多本植栽種於方格中央，當超過半數植株抽出一個指尖的穗長時，則視為此一家系的抽穗日數。

2. 栽培環境因子

水稻在營養生長期、幼穗分化期至抽穗期各生育階段中，受到氣象因素中影響有關的有日長、氣溫、濕度、降雨量、日射量及風速等 (Yoshida, 1981)。水稻營養生長期由對光照不敏感的基礎營養生長期與光敏感期構成，在合適的環境條件下幼穗分化進入生殖生長期，營養生長期為主要影響抽穗日數變化的階段，受到日長與溫度影響，生殖生長期與成熟期維持一定的天數，分別為35 天及 30-35 天左右 (Vergara and Chang, 1985)。

本試驗在同一地區分成兩個時期栽培 RILs 分離族群，兩個時期栽培環境的

氣候如表一。兩個時期種植的氣候資料參考中央氣象局的氣候資料紀錄，包含每日日長變化 (圖一) 及每日溫度變化 (圖二)。日長計算方式為由日出到日落的時間，單位為小時 (hr)。溫度對水稻抽穗日數影響的量化方式以生育度數法 (growing degree days, GDD) 評估之，計算方法為 : 最早抽穗的家系在播種期至

(26)

幼穗分化期間，每日最高溫與最低溫之平均溫度減去其基礎溫度10˚C 後的總合，

單位為攝氏。在早播種期最早抽穗家系的營養生長期由2015/04/22 至 2015/05/22，

在晚播種期最早抽穗家系的營養生長期由2015/07/03 至 2015/08/03，兩次播種期中最早抽穗家系的營養生長期差異不大，天數約一個月，都在小於臨界日長進入幼穗分化；兩次播種期的生育度數亦超過生長積溫門檻值，因此光週期與溫度並非本次試驗的限制因子。

表一、兩個播種期的氣候資料

感受日長變化 (hr) GDD (˚C)

早播種期 (E1) 12.8~13.5 469.6

晚播種期 (E2) 13.7~13.3 634.8

資料來源 : 中央氣象局台北觀測站

圖一、每日日長變化（資料來源 : 中央氣象局台北觀測站）

(27)

圖二、每日溫度變化（資料來源 : 中央氣象局台北觀測站）

第二節功能性分子標誌之建立與多重迴歸分析

採用顏 (2015) 根據王 (2010) 在 F2及蘇 (2010) 在 F2.4族群，多個環境下 QTL 定位結果，選擇重複定位次數大於兩次的 QTL 共四個，基因比對結果為 Ehd1、Ehd4、Ghd7 及 Dth8。然而 Ehd1 與 Ehd4 的功能性分子標誌已在顏 (2015) 的研究結果中成功設計出，直接利用Ehd4 與 Ehd1 功能性分子標誌對 RILs 族群 做基因型判別。本次研究再根據顏 (2015) 定序 Ghd7 基因序列重新設計功能性

分子標誌，以及定序兩親本Dth8 序列以及設計功能性分子標誌。

1. 以Taqman 系統對 Ghd7 做基因型判別

顏 (2015) 將 TK2 與 TCS10 的 Ghd7 基因序列分別對應至功能性較低的 Ghd7-2 對偶基因，以及具完全功能的 Ghd7-3 對偶基因型，但是根據先前 SNP 位點設計的allele specific primer set 為顯性分子標誌，無法判別異質結合個體。因此採用Taqman 系統重新挑選 SNP 位點設計新的一組功能性分子標誌，於 Thermo

(28)

Fisher 網頁設計 Taqman Assay，選取 SNP 位置前後 50 bp 的序列進行設計。PCR 反應總體積為10 µL，包含 10 ng genomic DNA，5µL ABI Universal Master Mix (Applied Biosystems)，20X Custom Taqman Genotyping Assay 0.5 µL。以 ABI 7500 熱循環反應器進行產物擴增，模式設定為Genotyping，反應條件為 60˚C 1 min、

95˚C 10 min，40 cycles 的 95˚C 15 s、60˚C 1 min，最終 60˚C 1 min 後降溫至 25

˚C。反應結束後根據 Allelic Discrimination Plot 的分群結果與親本做對照後，對 RILs 的 Ghd7 做基因型判別 (附圖六)。

2. Dth8 基因定序及功能性分子標誌設計

欲確立TK2 與 TCS10 的 Dth8 基因核苷酸序列多型性，並取日本晴 DNA 做 為對照組，利用BatchPrimer3.0 (https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/) (You et al., 2008) 設計三組引子，引子之設計類別選擇 Generic primers，產物大小參數設定min:300、opt:400 及 max:500 bp，其他參數設定為預設值。PCR 反應總體積 10 μL，包含 20 ng genomic DNA，0.5 µM 引子組合，5X Phusion HF Buffer 2 μL，

Phusion DNA Polymerase 0.1 µL (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA,USA)，10 mM 0.2 µL dNTPs。PCR 反應條件為 98˚C 30 s，35 cycles 的 98˚C 30s，60˚C 30s，

72˚C 1min，最終降溫至 4˚C。將 PCR 產物於 1% AgaroseⅠ進行電泳，確認產物符合目標大小及專一性後進行Sanger 定序。以 CLC Sequence Viewer 7 作序列比對，參數設定為預設值，比對結果在可將日本晴、TK2 及 TCS10 分別歸類於功能性弱的hap2、功能性強的 hap8 及不具功能的 hap5 (Zhang et al., 2015b)。

取 TK2 及 TCS10 的 Dth8 基因的複合型微衛星序列上找到兩親本之間有 (CGC)3差異，針對這9 bp 序列大小設計功能性分子標誌。在多型性位點前後 100 bp 序列大小以 BatchPrimer3.0 設計引子，引子之設計類別選擇 Generic primers，

參數設定為預設值，其對TK2 及 TCS10 的擴增產物大小為分別為 129 及 120 bp。

PCR 反應總體積為 10μL，20 ng genomic DNA，0.4 µM 引子組合，0.5 U

(29)

IMMOLASE™ DNA polymerase (Bioline)，2.5 mM 0.8 µL dNTPs，50 mM 0.4 µL MgCl2，Bioline 10X buffer 3.75 µL。反應條件為 95˚C 15 min，35 cycles 的 95˚

C 30 s、65˚C 30 s、72˚C 30 s，最終降溫至 4˚C。因 PCR 產物大小僅差 9 bp，故選擇解析度較大的膠體，以5% MetaPhor® Agarose (Lonza Rockland) 100 V 進行 2 小時電泳，確認可以清楚判別 TK2、TCS10 及 artificial F1的基因型後，再對258 個RILs 做基因型判別 (附圖八)。

3. 利用功能性分子標誌建立多重迴歸模型

為了解控制抽穗日數基因與播種期之間的關係，必須將遺傳因子與播種期在

同一個線性模式下進行分析，本次研究以四個功能性分子標誌對 RILs 族群進行

基因型定型，能夠正確地判別所有個體的基因型，避免顏 (2015) 的迴歸分析受到基因型轉換的限制，只能利用遺傳定位資料的兩側的分子標誌預測目標基因座的基因型，在兩側分子標誌基因型相同的情況下才能保留該筆資料，因此捨去部分不確定基因型的個體，線性模型只有選擇效應較大的 qHD10 及 qHD3 兩個基 因座放入模型，以免加入過多基因座造成拋棄大量資料而無法得到正確的分析結果。

F8.9世代族群的基因型異質結合率約0.4%，因此在做基因效應分割時只將目標基因型分為A (A1A1)與 B (A2A2) 兩個變級，估算加性效應 (addictive effect, a)。資料分析分別在兩個播種期以變方分析法檢視統計顯著的基因或基因間交感項，並且合併兩個播種期資料，評估基因與播種期之間的交感項效應，變方成分估計以R::VCA 套件 remlMM 方法計算 (Schuetzenmeister, 2016)，外表型解釋變異 (phenotypic variance explained, PVE) 以變方成分之百分比估計。

(30)

第三節文庫之製備流程及資料分析

1. 估計預期用於建構連鎖圖譜之分子標誌數量

建構 RILs 的連鎖圖譜所需要分子標誌數量估計，根據先前 96 個水稻品種的PstI 及 MspI 限制酶組合建構文庫，以 Hiseq2500 定序得到的資料結果中，資 料分析篩選48 K 目標片段，其中 TK2 與 TCS10 之間多型性的 SNP 有 10238 個，

具有多型性的目標片段約8000 個，這當中有些目標片段涵蓋不只 1 個 SNP，由此結果粗估 TK2 與 TCS10 多型性片段的比例約 1/6 (實驗室未發表資料)。預期得到的RILs 連鎖圖譜密度為 1 SNP/cM，以水稻連鎖圖譜總長 1500 cM 估計，需要1500 個 SNP，相當於 9000 個目標片段。對應至片段篩選大小為 60 bp，但避免篩選時遺失邊緣片段，故將篩選大小增加至100 bp，最終估計可得到 15000 個目標片段，2500 個 SNP。

2. Genomic DNA 萃取

為得到高品質 DNA，本實驗以 SDS 法搭配 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Venlo, Netherland) 抽取 260 個樣品，在 2 ml 離心管放入直徑為 2.5 mm 玻璃珠約25 顆，剪碎經過冷凍乾燥葉片 0.02 g，放入均質機震碎 1 分鐘至粉末狀，加入700 μL SDS extraction buffer (0.1 M Tris buffer, 0.05M EDTA, 0.5M NaCl, 10% SDS, β-ME)，65˚C 水浴 1 小時，加入 175 μL 5M KOAc 混勻，放置 4˚C 冰箱15 分鐘，以 16000 xg 離心 10 分鐘取 600 μL 上清液加入含有 2 μL RNAse A 的 1.5 mL 離心管，放置 37°C 恆溫 30 分鐘。接著在管內直接加入 600 μL PB buffer，倒轉數次混勻後取一半體積加入 Spin Column，以 17000 xg 離心 1 分鐘，

倒出管底液後再加入剩下的溶液，以17000 xg 離心 1 分鐘。之後加入 500 mL PE buffer 清洗 Spin Column 上的 binding DNA，以 17000 xg 離心 1 分鐘，再將空管以17000 xg 離心 1 分鐘。最終將 Spin Column 取下放在新的離心管，加入 100

(31)

μL EB buffer 靜置 10 分鐘，以 17000 xg 離心 1 分鐘後取出管底的 DNA。將此 DNA 以 nanodrop 測量 260/230 及 260/280 的值分別為~1.80 及~2.2，確定為沒有雜質的高品質 DNA，並用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA, USA) 定量 DNA 濃度。

3. 雙切酶切割

每個樣品取300 ng genomic DNA，加入 5 μL 10X CutSmart Buffer，1 μL 20 U/μL PstⅠ-HF，1 μL 20 U/μL MspⅠ(New England BioLabs [NEB], Ipswish MA, USA) 與二次蒸餾水加至總體積 50 μL，放入 Veriti PCR 機器進行酶切，設定溫度37˚C，反應時間 1 小時。

4. P1 adapter 及 Y adapter 連接酶反應

P1 adapter 與 Pst Ⅰ -HF 切口黏合，其正向核酸序列為 5’

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCA 3’，反向核酸序列為 5’

p-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT 3’，帶有部分 PCR 正向引子序列；P2 adapter 與 Msp Ⅰ 切口黏合，其正向核酸序列為 5’ p- CGAGATCGGAAGAGCGAGAACAA 3’ ，反向核酸序列為 5’

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3’，與部分 PCR 反向引子序列互補。Adapter 與 insert DNA 酶切端點數的莫耳數比設定為 5 :1，雙切酶處理後的樣品直接投入5 μL 10X CutSmart Buffer，1 μL 1.31 µM P1 adapter，1 μL 12.8 µM P2 adapter，0.5 μL 400 unit/μL T4 DNA ligase，6 μL 10mM riboATP (NEB, Ipswish MA, USA) 及二次蒸餾水加至總體積 60 μL，於 PCR 機器處理 25˚C 反應隔夜後，加溫至65˚C 10 分鐘，再以 1% ramp rate 降溫至 23˚C，去除酵素活性。最後使用 Agencourt® AMPure® XP system (Beckman Coulter, Brea CA, USA)，

(32)

PCR 時競爭資源，再以 15 μL 二次蒸餾水回溶後，於 PCR 機器以 50˚C 10 分鐘去除殘留的酒精，再取2 μL 進行定量。

5. PCR 反應

先取5 μL 5 µM forward primer (i5) 及 5 μL 5 µM reverse primer (i7)，加入 10 mM 1 µL dNTPs (NEB, Ipswish, MA, USA)，5X Phusion HF Buffer 10 µL，Phusion DNA Polymerase 0.5 µL (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA,USA)，再加入 2 μL adapter 接合 DNA 作為 template，最終以二次蒸餾水加至總體積為 50 µL。PCR 反應條件設定為98˚C 30 s，25 cycles 的 98˚C 10 s、72˚C 30 s，再進行 72˚C 10 min，最終降溫至 4˚C。之後使用 Agencourt® AMPure® XP system 以 0.8 倍 PCR 反應體積進行純化，去除200 bp 以下的 primer dimer，再以 20 µL 二次蒸餾水回溶後，於 PCR 機器以 50˚C 10 分鐘去除殘留的酒精。再以 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA,USA) 進行 DNA 定量，

且根據定量濃度結果，每個樣品取80 ng 進行標準化，避免定序資源不一致。

6. 片段大小篩選 (Size selection)

先取混合DNA 文庫以 Agencourt® AMPure® XP system 的相同體積濃縮成 4 倍後，片段大小的篩選以Blue Pippin (Sage Science, Beverly, USA) 進行切膠，範圍設定為300-450 bp，之後使用 Agencourt® AMPure® XP system 純化。接著以 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 的 High Sensitivity DNA chip 進行毛細管電泳，確認切膠後文庫的片段大小分布符合原本的設定，

以及定量使得最終濃度大於10 nM 且體積大於 10 µL 的標準。最後將此 ddRAD 定序文庫送至陽明大學基因體研究中心提供的 Illumina HiSeq 2500 次世代核酸定序服務平臺 (Illumina, San Diego, CA, USA)，使用 Illumina PE100 一個 lane 進行核酸定序。

(33)

第四節序列比對及 Variant calling

以Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) 讀取原始 FASTQ 檔資料將其對應回水稻參考序列 (MSU Rice Genome Annotation Project Release 7)，設定可容許的最大insert size 為 600 bp，將得到 SAM 檔並轉成 BAM 檔。以 Rsamtools (Morgan et al., 2009) 保留 paired-end 兩個讀序單一比對到 12 條染色體結果，刪除比對到多組位置之讀序，以及對應至胞器 (ChrC 及 ChrM) 與無法確定位置 (ChrSy 及 ChrUn) 的讀序。再以 PICARD tools (http://broadinstitute.github.io/picard) 將讀序按照物理圖譜位置排序，並以MarkDuplicate 去除定序過程中被機器誤判為兩個以上 clusters 造成重複的讀序 (Optical Duplicates) 。以 NCBI 水稻 dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) 資料庫為依據，利用 GATK (McKenna et al., 2010) BaseRecalibrator 檢視扣除水稻 variants 位置之後其餘位置之錯誤率，重新估算讀序各個位置及特定序列字串的錯誤率並校正Quality score，最後以 GATK HaplotypeCaller 參照校正後 Quality score 對各個樣品的 genomic VCF (gVCF) 檔進行joint calling，綜和所有樣品判斷 variants 是否存在。

第五節篩選建構連鎖圖譜的 SNP

使用套裝軟體 R 之 Bioconductor VariantAnnotation (“Bioconductor - VariantAnnotation,”) 套件進Variant Call Format (vcf) 檔案分析，以 readVcf () 讀取vcf 檔案後，再以 isSNV () 設定參數 singleAltOnly=TRUE 篩選 reference allele 及alternate allele 都只含一個 SNP 的 variants 後，得到 58499 個 variants。接著利用geno ()$GT 取出所有個體的基因型資料，以利後續計算 variants 的缺值率及異質結合率。將缺值率與異質結合率總和門檻值設定為10%，得到 8035 個 variants。

(34)

第六節連鎖圖譜建立及數量性狀基因座定位

1. 連鎖圖譜之建構

將轉換成A、B、H 基因型資料、分子標誌所屬連鎖群、物理圖譜位置，及

兩次外表型調查資料整理成能夠使用R/qtl 套件讀取的 csv 格式，以 read.cross () 讀取資料後，利用convert2riself () 把原本預設的 F2族群轉換成RILs 族群型態。

以est.rf () 檢查分子標誌在 RILs 中的 A、B 基因型是否有相反，再利用 plot.rf ()繪製分子標誌之間的重組率及 LOD 值圖。

刪除分子標誌基因型的缺值大於60 個的樣品，以及刪除樣品間基因型相同

比例高於93%的個體。

RILs 族群的基因型分離比在符合孟德爾分離比情況下為 1:1，利用 geno.table () 彙整所有分子標誌的統計值資料，並以卡方適合度檢定計算 p 值，以 Bonferroni 校正多重檢定之 p 值門檻，若分子標誌的 p 值小於 0.05 除以分子標誌總數，則視之為不平衡分離的分子標誌，確認發生不平衡分離的分子標誌區域是否與在早世代分離族群中發現的位置相符。

加入以建立的四個功能性分子標誌Ehd1、Ehd4、Ghd7 及 Dth8 的基因型資 料，其在染色體上的物理圖譜位置分別為chr 10 : 17,077,589 bp、chr 4 : 1,270,709 bp、chr 7 : 9,152,804 bp 及 chr 8 : 4,333,919 bp。以 est.map () 計算每條染色體上 SNP 間的互換率，選用 Kosambi 函數 (Kosambi, 1943) 把互換率轉換成遺傳距離後，以 replacemap () 將估算後的遺傳距離放入原本讀取的物件中。以 summary.map () 檢視各連鎖群資訊及連鎖距離總長，並以 plot.map () 繪製連鎖圖譜。

(35)

2. 數量基因座之定位

在進行QTL 定位前，先利用 Shapiro-Wilk 檢查外表型分布是否符合常態性，

在第一個環境下外表型有些微偏離常態分布的現象 (p-value = 0.0003278)，第二個環境下外表型則符合常態分布 (p-value =0.1299) (附圖)。

QTL 定位採用 multiple interval mapping (MIM) (Kao et al., 1999) 統計方法，

步驟為 : 在一開始模式並未存在任何 QTL 時，先以 scanone() 進行區間定位 (Interval mapping, IM) 法，做單一 QTL 模式搜尋，選擇 Haley-Knott 的迴歸模式做運算 (Haley and Knott, 1992)，以重排試驗 (Churchill and Doerge, 1994) 方法重複計算1000 次估算 LOD 的門檻值，α值設為 0.05。以 makeqtl() 建立模型並放入scanone() 得到的 QTL 位置，利用 fitqtl() 分析整個模型的顯著性，當模型中涵括兩個以上QTL 時，以 addint() 檢測兩兩 QTL 之間是否具有交感作用，若交感效應顯著則加入模型中，再以 refineqtl() 對模型中 QTL 的位置進行微調，使得全模式的LOD 值為最高。以 addqtl() 在全模式下找尋額外的 QTL，若有新的 QTL 大於門檻 LOD 值則以 addtoqtl() 將此 QTL 加入模型，利用 fitqtl() 分析整個模型的顯著性，之後以 addint() 檢測模型中 QTL 間是否具有交感作用，以及 refineqtl() 調整最佳位置使得總 LOD 值最高。重複 addqtl() 及 addint() 步驟，直到掃描到QTL 的 LOD 值都小於重排的門檻值則停止 QTL 定位。最終以 fitqtl() 設定參數get.est=TURE，估計全模式中 QTL 的效應值以及外表型解釋變異。

為了避免遺漏主效應不強，但具有相當大交感效應組合的QTL，以 addpair() 基於現有模式掃描是否存在其他的 QTL 交感效應，或以 scantwo() 建立基礎模式對整個基因組偵測QTL 交感效應。

在兩個環境下估計涵蓋 QTL 的信賴區間方法為依據 Darvasi 等人的經驗公式 (Darvasi and Soller, 1997) : 將定位到的 QTL 位置加減一半 CI 值，估計 QTL 坐落的信賴區間。CI=⁵³⁰

𝑁∙𝜈，N 為定位族群的數目，ν 為外表型解釋變異量。

(36)

第四章結果與討論

第一節 RILs 的抽穗日數變異

RILs 族群在早播種期的抽穗日數為 88.7 ± 11.3 天，族群抽穗日數範圍 51- 114 天，TK2 與 TCS10 抽穗日數分別為 100 及 83 天；晚播種期的抽穗期日數 70.4 ± 7.9 天，族群抽穗日數範圍 52-99 天，TK2 抽穗期為 65 天，TCS10 在田間生命力表現較弱而死亡，因此無抽穗日數紀錄 (圖三)，觀察兩個播種期的抽穗日數散布圖，推測可能是環境機差或基因與播種期的交感作用造成抽穗日數有一定分散性 (圖四)。RILs 族群在早播種期的抽穗期分布遠超過兩親本的抽穗期，

表現出超親分離 (transgressive segregation) 現象，推測具有多個效應方向分散 (disperse) 的抽穗期基因影響外表型變異。

圖三、台稉2 號/台中秈 10 號 RILs 在早播種期 (左) 與晚播種期 (右) 的抽穗日數分布

Heading days 1 Heading days 2

(37)

圖四、台稉2 號/台中秈 10 號 RILs 族群在兩個播種期的抽穗日數散佈圖

第二節多重迴歸分析結果

1. 兩個播種期個別的多重迴歸分析結果

早播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果得到Ehd1、Ehd4、Ghd7、Dth8 及一個三基因交感項Ehd1:Ghd7:Dth8 顯著表現 (表二)，晚播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果得到Ehd1、Ehd4、Dth8 及一個兩基因交感項 Ehd1:Dth8 顯 著表現 (表三)，將前述顯著表現的基因建構兩個播種期的多重迴歸模型，估計基因之效應、變方成分及外表型解釋變異，結果得到外表型總解釋變異分別為 58.91%與 74.97% (表四、五)。帶有 TK2 的 Ehd1 對偶基因效應在早與晚播種期 分別為 5.5 及 5.9 天，Ehd1 表現在兩個播種期下差異不大；Ehd4 效應在早與晚 播種期分別為-4.3 及-2.6 天，在早播種期的效應較晚播種期提早 1.7 天，推測 Ehd4

(38)

基因與環境之間有交感效應。本次 Ehd1 與 Ehd4 在兩個播種期的效應估計值和 顏 (2015) 的迴歸分析結果差異不大，兩者皆為主要控制抽穗期變異的基因。

Ghd7 表現只有在早播種期達到顯著水準，帶有 TK2 對偶基因的效應為-2.0 天，

推測此基因可能只有在特定環境下才有表現。帶有TK2 的 Dth8 對偶基因在早與 晚播種期下效應分別為1.5 及 0.8 天，Dth8 個別效應只在早播種期下顯著影響外 表型。早播種期下Ehd1:Ghd7:Dth8 交感項顯著表現，當三個基因都帶有 TK2 對 偶基因時效應增加1.4 天；在晚播種期下 Ehd1:Dth8 交感項達到顯著水準，當兩 個基因都為TK2 對偶基因時效應減少 1.2 天，因此推測 Dth8 可能在特定環境才 有表現，且Dth8 與其他基因形成交感項，影響抽穗日數變異。帶有 TK2 的 Ehd1 與 Dth8 對偶基因效應能延長抽穗日數，而 TK2 的 Ehd4 與 Ghd7 對偶基因效應 則縮短抽穗日數，在秈稻與稉稻之間帶有多個基因效應表現方向相反，使得後代分離族群抽穗期呈現分散。

(39)

表二、早播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)

Ehd1 1 5113.48 5113.48 66.99 1.92E-14 ***

Ehd4 1 3740.08 3740.08 49.00 2.83E-11 ***

Ghd7 1 907.52 907.52 11.89 0.000672 ***

Dth8 1 557.30 557.30 7.30 0.007409 **

Ehd1:Ehd4 1 17.52 17.52 0.23 0.632313

Ehd1:Ghd7 1 8.22 8.22 0.11 0.743122

Ehd4:Ghd7 1 27.11 27.11 0.36 0.551771

Ehd1:Dth8 1 58.98 58.98 0.77 0.38029

Ehd4:Dth8 1 4.65 4.65 0.06 0.805266

Ghd7:Dth8 1 36.39 36.39 0.48 0.490578

Ehd1:Ehd4:Ghd7 1 0.79 0.79 0.01 0.919013

Ehd1:Ehd4:Dth8 1 3.65 3.65 0.05 0.827151

Ehd1:Ghd7:Dth8 1 552.07 552.07 7.23 0.007687 **

Ehd4:Ghd7:Dth8 1 11.63 11.63 0.15 0.696586

Ehd1:Ehd4:Ghd7:Dth8 1 41.28 41.28 0.54 0.462836

Residuals 228 17402.87 76.33

表三、晚播種期抽穗日數之完整模式變方分析結果

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)

Ehd1 1 6210.50 6210.50 228.30 3.32E-36 ***

Ehd4 1 1414.44 1414.44 51.99 8.12E-12 ***

Ghd7 1 38.76 38.76 1.42 0.233869

Dth8 1 159.23 159.23 5.85 0.016332 *

Ehd1:Ehd4 1 18.23 18.23 0.67 0.413897

Ehd1:Ghd7 1 0.27 0.27 0.01 0.921315

Ehd4:Ghd7 1 0.88 0.88 0.03 0.857594

Ehd1:Dth8 1 361.18 361.18 13.28 0.000333 ***

Ehd4:Dth8 1 4.39 4.39 0.16 0.68824

Ghd7:Dth8 1 3.59 3.59 0.13 0.716661

Ehd1:Ehd4:Ghd7 1 1.34 1.34 0.05 0.824443

Ehd1:Ehd4:Dth8 1 15.55 15.55 0.57 0.450381

Ehd1:Ghd7:Dth8 1 98.57 98.57 3.62 0.058233 .

Ehd4:Ghd7:Dth8 1 8.11 8.11 0.30 0.585624

Ehd1:Ehd4:Ghd7:Dth8 1 75.91 75.91 2.79 0.096199 .

(40)

表四、早播種期的抽穗日數多重迴歸分析結果 HD1=Ehd1+Ehd4+Ghd7+Dth8+Ehd1:Ghd7:Dth8+ε

Df Effect^a Mean Sq VC^b PVE(%)^c F value Pr(>F)

Ehd1 1 5.5 5113.5 59.51 32.73 68.82 8.054e-15 ***

Ehd4 1 -4.3 3740.1 35.06 19.28 50.33 1.477e-11 ***

Ghd7 1 -2.0 907.5 6.63 3.65 12.21 0.0005658 ***

Dth8 1 1.5 557.3 3.31 1.82 7.50 0.0066368 **

Ehd1:Ghd7:Dth8 1 1.4 480.1 2.60 1.43 6.46 0.0116628 *

Residuals 238 74.3 74.72 41.09

a基因效應估計值以TK2 對偶基因效應表示

bVC : variance component (R::VCA, remlMM)

cPVE : 外表型變異解釋量 phenotypic variance explained

迴歸模式顯著性採用F 檢定，顯著水準表示為 *0.05, **0.01, ***0.001

表五、晚播種期的抽穗日數多重迴歸分析結果 HD2=Ehd1+Ehd4+Dth8+Ehd1:Dth8 +ε

Df Effect Mean Sq VC PVE(%)^b F value Pr(>F) Ehd1 1 5.9 6637.5 66.07 59.27 237.90 < 2.2e-16 ***

Ehd4 1 -2.6 1579.9 13.62 12.21 56.62 1.024e-12 ***

Dth8 1 0.8 151.5 0 0 5.43 0.0206227 *

Ehd1:Dth8 1 -1.2 381.5 3.89 3.49 13.67 0.0002689 ***

Residuals 243 27.9 27.9 25.03

a基因效應估計值以TK2 對偶基因效應表示

bVC : variance component (R::VCA, remlMM)

cPVE : 外表型變異解釋量 phenotypic variance explained

迴歸模式顯著性採用F 檢定，顯著水準表示為 *0.05, **0.01, ***0.001

2. 四個抽穗期基因對抽穗日數之影響

早播種期的迴歸分析結果顯示，除了四個功能性分子標誌顯著影響抽穗日數，

Ehd1:Ghd7:Dth8 交感作用亦顯著影響外表型，在 RILs 族群中每個功能性分子標

誌各有兩種對偶基因，共有16 種不同的組合的基因型。晚播種期的迴歸分析結

(41)

Dth8 具有交感作用，共有 8 種不同的組合的基因型。第一個環境的迴歸分析結 果以AAAA 基因型為例，四個基因型依序為帶有具 TK2 的 ehd1ehd1、Ehd4Ehd4、

ghd7ghd7 及 Dth8Dth8 對偶基因，TCS10 所帶的對偶基因則以 B 為代號。而在第 二個環境的迴歸分析結果中，AAA 基因型依序為帶有具 TK2 的 ehd1ehd1、

Ehd4Ehd4 及 Dth8Dth8 對偶基因。

在兩個播種期下以迴歸分析得到抽穗期效應估計值與實際觀察到的外表型平均值差異不大，但在晚播種期的抽穗期效應估計值相較早播種期下來得準確，

基因組合內的標準差較小。在兩個播種期分別16 個與 9 個對偶基因組合中，在

每一個群內的相同基因組合下都有一定的變異性，推測抽穗日數之變異可能受到環境機差或其他基因控制 (表六、七，圖五)。

(42)

圖五、在早播種期的四個基因與晚播種期的三個基因中，按照基因型分類後得到16種跟9種對偶基因組合，每個組合下的抽穗日數變異

探討控制水稻抽穗日數基因與播種期之交感

國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系研究所 碩士論文

National Taiwan University Master Thesis

探討控制水稻抽穗日數基因與播種期之交感 Interaction between Genes Controlling Days to Heading

and sowing dates in Rice

石瀞予 Ching-Yu Shih

指導教授：胡凱康 博士 Advisor: Kae-Kang Hwu, Ph.D.

中華民國 107 年 1 月

Jan 2018

中文摘要

Abstract

目錄

表目錄

對照表

第一章 前言

第二章 前人研究

第一節 抽穗期相關研究

第二節 次世代定序

第三章 材料與方法

第一節 遺傳材料及栽培環境

第二節 功能性分子標誌之建立與多重迴歸分析

第三節 文庫之製備流程及資料分析

第四節 序列比對及 Variant calling

第五節 篩選建構連鎖圖譜的 SNP

第六節 連鎖圖譜建立及數量性狀基因座定位

第四章 結果與討論