[tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris]、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvants, FCA )、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvants, FIA )、兔 子抗老鼠抗體-鹼性磷酸酶(rabbit anti-mouse IgG-alkaline
phosphatase , RAM-AP)、山羊抗兔子抗體-鹼性磷酸酶(goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase , GAR-AP)、對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate, pNPP)，次黃嘌呤、氨基蝶呤與胸腺嘧啶 (hypoxanthine, aminopterin and thymidine , HAT)與疊氮化鈉
(sodium azide, NaN3)皆購自 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)。
IMDM 細胞培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, IMDM) 購自 Gibco (Grand Island, NY)。聚乙二醇 1500 (Polyethylene Glycol 1500, PEG 1500)來自 Boehringer Mannheim (783641)，老鼠 抗體分型套組購自 Southern Biotechnology Associates (5070-04)，
胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）則是 Hyclone 的產品 (SH30071.03）。
2. 常用溶液
Ⅰ. 磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline, PBS)：
140 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.4
Ⅱ. ELISA blocking solution：
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V. Alkaline phosphatase (AP) substrate solution：
9.6% (v/v) diethanolamine, 0.5 mM MgCl2‧6H2O, pH 9.6
2. 三聚氰胺聚合反應的上清液(supernatant)分析
取 900 μL 的 20 mM 三聚氰胺水溶液與 100 μL 的 2.5 M 戊
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二醛混合，再於 37℃中反應 3 天，之後將反應液離心 (10000 g, 10 min)，隨後將上清液樣品取出後委託台灣布魯克生命科學股份 有限公司以 LC/MS 進行分析，儀器的設定條件為：全掃瞄正離 子模式，scan rate 為 32000 u/sec，樣品流速為 3 μL/min，mass range 為 100 to 1000 m/z。 測其於 214 nm 的吸光值(absorbance value)。此外，也在不同 次的獨立實驗中，分別取 20 μL 的 18 mM 三聚氰胺水溶液
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（isocratic elution）方式，流速為 1 mL/min；PDA 偵測波長 為 240 nm，樣品注入體積設定為 20 μL。
4. 三聚氰胺聚合物的分子量分析
將方法 1 製備之免疫原樣品解凍後，進行離心(10000 g, 10 min)並去除上清液，再加入 0.5 mL DMF 回溶底層的三聚氰胺聚
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合物顆粒以為檢液，隨後委託財團法人塑膠工業技術發展中心以 凝膠滲透層析儀(gel permeation chromatography，GPC)進行分子 量分析。使用的層析管柱為 Jordi gel polydivinylbenzene (PDVB) column，沖提液為 0.3% (w/v)溴化鋰溶於 DMF 中，流速為 1
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32 體，稀釋方式是以 ELISA diluent buffer 將抗血清稀釋 200 倍；於室溫下反應 2 小時後，以 washing buffer 清洗 3 次。
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substrate solution)，於室溫下反應 2 小時後，以酵素免疫分 析測讀儀進行反應結果 (Abs 405-490 nm)判讀。 值，最後再加入 0.5 mL Borate saline buffer，即完成抗血清 中可辨識三聚氰胺聚合物的抗體分離。
IV. 針對上述分離獲得之抗體樣品，依廠商提供操作說明，進行 ELISA 方式的抗體分型鑑定。
8. 細胞融合(cell fusion)與單株抗體純化(purification)
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Ⅰ. 細胞融合：
將方法 5.完成免疫注射之小鼠以頸椎脫臼法(cervical dislocation)犧牲，再以 70%酒精將其體表充份浸潤，並移入 無菌操作台中。取出小鼠的脾臟並以 IMDM 沖洗出內部細 胞，隨後與骨髓癌細胞（myeloma cell）充分混合(spleen cell：myeloma cell = 10：1 的比例)，再加入 50%之
PEG1500 使兩種細胞發生融合。隨後將細胞懸浮於 50 mL
35 其上層液以進行 protein A/G（Pierce 20422）的吸附純化工 作。
在進行吸附純化前，先以 10 倍 protein A/G 膠體體積之
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PBS 清洗管柱，之後以 2 倍膠體體積的 0.1M glycine-Cl (pH 2.5)溶液進行假沖提(fake elution)，再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱。隨後將上述經硫酸銨沉澱濃縮之單株抗體 A/G 管柱、PBS 清洗、glycine-Cl 流洗、PBS 清洗的過程，
直到收集液的最高吸光值低於 0.10。將所有收集的流出沖提 液集中後，進行 50%硫酸銨沉澱，並以小體積的 PBS 回 溶，再進行 15000 g 的離心澄清，最後取出 80 μL 以 PBS 進行 10 倍稀釋，測其 OD280 值，再以下列公式換算出抗體 的濃度：
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38 washing buffer 清洗 3 次。
VI. 以 50 μL/well 的方式加入 AP 受質 (pNPP 0.6 mg/mL in AP substrate solution)，於室溫下反應 2 小時後，以酵素免疫分 析測讀儀進行反應結果 (Abs 405-490 nm)判讀。
(ammeline)、三聚氰胺一醯胺(ammelide)與三聚氰酸(cyanuric acid or cyanurate)，分析方法如方法 4.的 cELISA，交叉反應率(cross-reactivity ratio, CR%)的計算公式如下：
CR% = (IC50 for melamine/IC50 for analog compound) × 100%
39 上的差異。編號 1~6 號的碗口半徑分別為：8、8、7.25、5.5、
4.25 與 6.3 公分，我們將 6 組餐具先以二次水洗淨乾燥，再分別 加入已預熱至 95℃之二次水，加入的體積分別為 450、450、
320、180、110 與 290 mL，隨後以錶玻璃蓋住碗口，再放入 95℃
水浴槽中 60 分鐘。之後，分別取出碗內的溶出液，冷卻後以 0.22 μm 濾膜(Nylon 材質)過濾，並儲放於-20℃以供後續分析使 用。
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0.5 mL/min；樣品注入體積設定為 10 μL；離子噴灑電壓(ion spray voltage)為 3.2 kV；溶媒揮散溫度(desolvation
temperature)為 450℃。多重反應偵測(multiple reaction monitoring，MRM)的設定模式則是前驅離子(m/z)為
127>84.8，產物離子(m/z)為 127>68，碰撞能量(eV)為 26 與 42，定量離子對 (m/z)為 127>84.8。
42 譜圖中，橫坐標為分子量與電荷的比例[質荷比，mass to charge ratio, (m/z)]，由於質譜圖中的分子碎片其電荷皆以+1 (z = 1)計，
其分子量波峰出現於 291.1 (127+200-36 = 291)，此聯結模式為 GMG；但還有另一種可能的聯結模式則是 1 分子三聚氰胺先與 戊二醛以醛胺縮合反應去掉 1 分子水聯結，而此聯結三聚氰胺
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的戊二醛則再與另一戊二醛以醛醇縮合反應去掉 1 分子水聯 結，即 MGG 之聯結模式。
依上述 2 種縮合反應與聯結模式推斷，在圖 10(b) m/z 範圍 300~500 中，2M+1G-2H2O 其分子量波峰出現於 317.1，即 MGM 之聯結模式。1M+3G-3H2O 其分子量波峰出現於 373.2，
可能的聯結模式則包括 MGGG 與 GMGG。2M+2G-3H2O 其分子 量波峰出現於 399.2，可能的聯結模式則包括 MGMG 與
MGGM。2M+3G-4H2O 其分子量波峰則出現於 481.2，可能的聯 結則包括 MGMGG、GMGMG 與 GMGGM 等模式。另外，在圖 10(c) m/z 範圍 500~700 中，2M+4G-5H2O 其分子量波峰出現於 563.3，可能的聯結包括 MGMGGG、MGGMGG、MGGGMG、
MGGGGM、GMGMGG 與 GMGGMG 等模式。至於 3M+3G-5H2O 其分子量波峰出現於 589.3，可能的聯結模式則包括 MGMGMG 與 MGMGGM。
綜合上述的結果說明，在我們所設定的三聚氰胺與戊二醛 聚合反應條件中，利用 LC/MS 分析反應液的水相成分，可看到 戊二醛確實可以交聯三聚氰胺與其他戊二醛分子，逐步地聯結 形成大分子；至於此聚合反應所產生的沉澱顆粒我們將另行分 析。
44 圖 11，在紫外光波長範圍中(190~320 nm)，三聚氰胺於波長 214 nm 有最高吸收值。
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3000~5000 Da 之條件 (Graham and Christopher, 2004)；我們將 方法 4 之檢液以 GPC 儀器分析三聚氰胺聚合物分子量及分布範 圍，結果如表 6，此聚合物樣品的數量平均分子量(number average molecular weight, Mn)為 9309 Da。重量平均分子量 (weight average molecular weight, Mw)為 17842 Da。由於 Mn = ΣNiMi / ΣNi，而 Mw = ΣNiMi2 / ΣNiMi，其中 Ni 為聚合物的
表 6 中的分子量分佈指數(polydispersity index, PDI) 為 Mw/Mn 之比值，是表示分子量分佈區間的參考指數，PDI 越 大，分子量分佈越寬； PDI 越小(越趨近 1)，分子量分佈越集 中 (李一釗等人，2017)；PDI 等於 1 表示聚合體中每一條分子 鏈的聚合度皆相同，不過這是理想的情況，一般皆大於 1。本 反應條件下所形成的三聚氰胺聚合物其 PDI 為 1.917，介於 1.1~2.0 之間，屬於中度散佈 (Nobbmann., 2014)，顯示利用此
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53 ng/mL，相較於前人以儀器 LC/MS/MS 檢測標準品最低偵測濃度 為 0.1 ng/mL ( Braekevelt et al., 2011)更佳。另外，控制組未經免 疫注射的小鼠及兔子血清均只會對三聚氰胺產生微弱的背景反
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達此目的，我們首先以三聚氰胺聚合物來吸附沉澱其可結合的 抗體，隨後才針對該抗體樣品進行其分型測試。實驗組共有 2 組 (Immunized mouse serum #1、#2)，對照組則為未經以三聚氰 胺聚合物免疫注射的小鼠血清 (Non-immune mouse serum)。結 果如圖 18，實驗組小鼠的抗血清中有不等量的 IgG1、IgG2a、
IgG2b、IgG3 及 IgM 等各型及亞型的抗體，而對照組的小鼠血 清中則均僅有微弱的背景反應。此結果顯示我們製備的三聚氰 胺免疫原可使動物免疫反應中 B 細胞表面抗體重鏈，由原本 IgM 的μ鏈經由類型轉換(class switching)轉換成 IgG 的γ鏈，形 成針對三聚氰胺聚合物多株性抗體。
55 計分析方法採學生 t 檢定(Student's t-test)，當競爭劑三聚氰胺濃 度為 10-2 ng/mL 時，其反應吸光值與控制組無顯著差異，當競 爭劑三聚氰胺濃度為 10-1 ng/mL 時，其反應吸光值與控制組有 非常顯著的差異，故該分析的三聚氰胺最低偵測濃度應為 0.1 ng/mL，與現今液相層析串聯質譜儀的分析敏感度相同
( Braekevelt et al., 2011)。
另外，當競爭劑三聚氰胺濃度為 105 ng/mL 時，其反應吸
56 ng/mL，換算的交叉反應率則分別為 0.92%、1.31%與 0.89%。
是以本實驗的結果證實三聚氰胺單株抗體(1H9)對此 3 種三聚氰
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cELISA 方法之相對誤差為 3.83%，而儀器分析方法之相對誤差 則為 12.45%。
十一、 免疫分析的同日間與異日間變異情形
為了評估以 cELISA 檢測三聚氰胺之結果穩定性，我們也針 對美耐皿餐具的熱溶出液進行同日間變異分析(intra-assay)與異日 間變異分析(inter-assay)的探討。前者是於同一日內進行 3 次不同 次分析，取測試結果數據之變異係數(coefficient of variation,
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CV)；後者是比對 3 個不同日的實驗分析，取測試結果數據之 CV。表 10 為以 cELISA 方式對六種美耐皿餐具熱溶出三聚氰胺 之分析結果；同日間分析之變異程度分別為 2.73%、7.57%、
9.87%、9.17%、8.78%與 8.93%；而異日間分析之變異程度則分 別為 4.32%、2.84%、2.68%、5.82%、7.86%與 5.17%。由於同日 間分析之變異程度僅介於 2.73%至 9.87％之間（n = 3），異日間 分析之變異程度也只介於 2.68%至 7.86％之間（n = 3），故本研 究所使用 cELISA 方法的同日間與異日間變異均低，並優於先前 曾發表過對三聚氰胺進行免疫檢測的數據如表 11 (Yin et al., 2010)。
59 亦可藉由自身醛醇縮合反應(aldol self-condensation reaction)互相 聯結。由於三聚氰胺為帶有 3 個胺基的分子，戊二醛為帶有 2
60 (甘油, glycerol)聯結形成聚合物(圖 26)。依據上述的邏輯，帶 有一或多個胺基與具有一或多個羧酸基的化學物質，亦可能 藉 EDC 的碳二亞胺反應以醯胺鍵相互聯結形成聚合物。所以
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屍胺(cadaverine)、亞精胺(spermidine) (Tanabe et al., 2004)、精 胺(spermine) (Hamaoki et al., 2002)等；多胺在真核與原核生物 中參與細胞的生長、死亡的調節 (Hesterberg et al., 2018)，亦 具有調節腫瘤抑制蛋白 p53 來限制細胞增殖和細胞凋亡 (Huang et al., 2005)。另外，腫瘤細胞表面的腫瘤相關醣類抗 原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)屬於多醇或 多醛類物質，為癌症診斷與治療時的重要標的 (Monzavi-Karbassi et al., 2013; Feng et al., 2016)，開發其對應抗體亦極 具需求潛力；再者，多醇類物質例如木糖醇(xylitol) (Sreenath and Venkatesh., 2008)、赤蘚醇（erythritol） (Sreenath and
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疫反應以產生標的抗體呢？此一免疫反應機轉是非常值得探討 之議題。一般而言，B 細胞的活化主要有 T 細胞依賴 (T cell-dependent)與 T 細胞非依賴 (T cell-independent)兩種途徑(表 12)；T 細胞依賴抗原大多為結構複雜的蛋白質、醣蛋白或是脂 藉識別胜肽-主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)，然後才能將活化信號傳遞給 B 細胞 (Becker et al., 2016)。值得注意的是，本研究在製備三聚氰胺免疫原的過程 中，並沒有使用載體蛋白，它到底如何被輔助 T 細胞識別並進 一步觸發 T 細胞依賴途徑？我們雖可推測或許免疫原的聚合物 在動物體內可能會與動物的自身蛋白成分結合，再觸發 T 細胞
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66 67674 Da，PDI 為 1.924。此重複製備之三聚氰胺聚合物亦己 達成免疫原所需之重量分子量至少需達 3~5 KDa 之條件，且 與本研究結果所測之三聚氰胺聚合物 Mw 差異僅為 5.88%
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[(17842-16793)÷17842×100% = 5.88%]。
3. G10 膠體管柱分析圖之面積計算 被抗原的吸附反應時間非常重要。Hofstetter et al. (1997)曾以
3. G10 膠體管柱分析圖之面積計算 被抗原的吸附反應時間非常重要。Hofstetter et al. (1997)曾以